高粱根活性流分抗血小板聚集作用機(jī)制

許婉婷，周 飛，陳發(fā)菊2，，彭 梅2，，羅忠圣2，，王 麗2，，楊克鈴，楊小生2，，楊 娟2，

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué)，省部共建藥用植物功效與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，3.貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550014)

目前，血栓性疾病如冠心病、心肌梗死、缺血性腦卒中等許多栓塞性疾病，已經(jīng)嚴(yán)重危害了人類身心健康[1]。據(jù)有關(guān)研究顯示，全球約有20億心腦血管疾病患者，且每年死于心腦血管疾病的人數(shù)占總死亡人數(shù)的一半以上[2]，中國每年僅缺血性腦血管病患者就超過700萬[3]。近年來，血栓性疾病發(fā)病率處于上升趨勢，且越來越年輕化[4]，給社會(huì)和家庭帶來了極大的傷害。血栓性疾病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，受多種危險(xiǎn)因素的影響，而血小板聚集是此類疾病的主要誘因，因此，尋找抗血小板聚集藥物，研究其作用機(jī)制，尋找發(fā)病誘因?qū)ρㄐ韵盗屑膊〉闹委熂邦A(yù)防具有重大意義。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，高粱根水提醇沉上清液部位(WEAE)具有明顯的擴(kuò)張血小管和抗凝血作用[5]。WEAE部分進(jìn)一步經(jīng)MCI凝膠柱層析，0%、30%、60%、95%乙醇洗脫得到各流分。體外抗血小板聚集活性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，30%乙醇洗脫流分(WEAE-M 30%)對(duì)膠原蛋白(collagen)、凝血酶(thrombin)、二磷酸腺苷(ADP)等激動(dòng)劑誘導(dǎo)的血小板聚集有明顯抑制作用[6]。在前期研究基礎(chǔ)上，本研究對(duì)該流分抗血小板聚集作用機(jī)制進(jìn)行初步探討，為進(jìn)一步開發(fā)抗血栓藥物提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性SD大鼠(SPF級(jí)，體質(zhì)量180～200 g)，購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK(遼)2020-0001。

1.2 藥材高粱根于2018年10月采自貴州省遵義市桐梓縣，為貴州茅臺(tái)酒股份有限公司在桐梓地區(qū)種植的酒用高粱品種紅纓子糯高粱的根，標(biāo)本存放于貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.3 試劑乳酸脫氫酶試劑盒(批號(hào)：20200805)、瓊脂糖凝膠2B(批號(hào)：S8701)、鈣離子熒光探針Fura-2/AM(批號(hào)：828C011)、EGTA(批號(hào)：623P053)、TritonX-100(批號(hào)：82910211)、凝血酶(批號(hào)：72F064)均購自Solarbio公司；膠原蛋白(批號(hào)：F19000122)HYPHEN BioMed公司；二磷酸腺苷(批號(hào)：SLCB5611)、阿司匹林(批號(hào)：SLBH0714V)購自Sigma公司；PLCγ2(批號(hào)：10)、phospho-PLCγ2(批號(hào)：5)購自Cell Signaling Technology公司；Syk(批號(hào)：GR267275-19)、phospho-Syk(批號(hào)：GR286096-16)，Src(批號(hào)：GR3232598-8)、phospho-Src(批號(hào)：GR239935-26)、p38(批號(hào)：GR3215674-8)、phospho-p38(GR308415-23)、ERK(批號(hào)：GR3261666-6)、phospho-ERK(批號(hào)：GR3206456-3)均購自Abcam公司；β-actin(批號(hào)：303974)、Anti-rabbit secondary(批號(hào)：00018387)均購自Proteintech公司；PE anti-mouse/Rat CD62P(批號(hào)：B311813)購自Biolegend公司；Rat cAMP ELISA Kit(批號(hào)：GR2020-12)、Rat cGMP ELISA Kit(批號(hào)：GR2020-11)、Rat TXB2 ELISA Kit(批號(hào)：GR2021-02)、Rat 6-keto-PGF1α ELISA Kit(批號(hào)：GR2021-01)均購自武漢基因美生物有限公司。

1.4 儀器TDL-40C低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；LBY-NJ4血小板聚集儀(北京普利生儀器有限公司)；IMS-50雪花制冰機(jī)(BIOBASE公司)；NovoCyte 2040R流式細(xì)胞儀(ACEA Biosciences.Inc公司)；F97Pro熒光分光光度計(jì)(上海棱光公司)

1.5 活性部位的制備按照文獻(xiàn)[6]方法制備。高粱根經(jīng)粉碎，加入去離子水浸泡24 h后，水煎煮提取2次，每次2 h。水煎液過濾，濾液合并濃縮后，浸膏加入適量95%乙醇，使乙醇溶液終濃度達(dá)60%，靜置后上清液過濾。減壓回收溶劑，將濃縮后的浸膏真空干燥，得水提醇沉上清液部位(WEAE)。WEAE部位再經(jīng)MCI凝膠柱層析，分別采用0%、30%、60%、95%乙醇梯度洗脫，得到各洗脫流分。將30%乙醇洗脫流分(WEAE-M 30%)濃縮后真空干燥，備用。

1.6 大鼠血小板樣品制備雄性SD大鼠經(jīng)腹腔麻醉后，腹主動(dòng)脈取血，枸櫞酸鈉1 ∶9抗凝，800 r·min-1離心10 min，取上層富血小板血漿(PRP)[7]。PRP經(jīng)Sepharose 2B瓊脂糖凝膠柱層析洗滌，得到凝膠過濾血小板(GFP)[8]。

1.7 血小板聚集功能測定根據(jù)文獻(xiàn)方法[9]測定血小板聚集率。將GFP分為空白組，陽性組，低、中、高劑量組。在比色杯內(nèi)加入攪拌轉(zhuǎn)子，并加入270 μL GFP懸液與30 μL不同濃度WEAE-M 30%(終濃度為50、100、200 mg·L-1)，以阿司匹林(aspirin，100 mg·L-1)為陽性對(duì)照，以含0.5% DMSO的生理鹽水為空白對(duì)照，37 ℃孵育10 min。然后分別以ADP(20 μmol·L-1)、Thrombin(0.3 kU·L-1)、Collagen(2 mg·L-1)為激動(dòng)劑，記錄5 min內(nèi)血小板聚集儀的曲線變化，并讀取最大聚集率，按下列公式計(jì)算各受試藥對(duì)血小板聚集的抑制率。

血小板聚集抑制率/% =(空白對(duì)照組的最大聚集率-給藥組的最大聚集率)/空白對(duì)照組的最大聚集率×100 %[9]。

1.8 抗血小板聚集作用機(jī)制研究

1.8.1Western blot檢測GPVI、MAPK信號(hào)通路中蛋白表達(dá) 分別取270 μL GFP，加入30 μL不同濃度WEAE-M 30%，空白對(duì)照組、陽性對(duì)照組，孵育10 min后，用Collagen刺激5 min，得到處理好的血小板懸液。取血小板懸液，加入150 μL蛋白酶，磷酸酶抑制劑的5×RIPA裂解血小板，冰上放置30 min后，4 ℃下12 000×g離心5 min，取上清液得血小板總蛋白樣品。測定并調(diào)整血小板蛋白濃度，加入loading buffer，沸水浴5 min后，分裝凍存于-80 ℃冰箱備用。將蛋白樣品進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入對(duì)應(yīng)的一抗(PLCγ2、phospho-PLCγ2，Syk、p-Syk，Src、phospho-Src，p38、p-p38，Erk、phospho-Erk，β-actin)4 ℃孵育過夜。用TBST洗膜30 min，然后與抗兔二抗在室溫下孵育1 h。再次洗膜后，使用ECL發(fā)光液進(jìn)行顯色曝光，灰度分析。

1.8.2ATP釋放實(shí)驗(yàn) 分別取270 μL GFP(含1 mmol·L-1的CaCl2)，與30 μL不同濃度WEAE-M 30%，空白對(duì)照、陽性對(duì)照，孵育10 min，用Collagen刺激5 min后，用96孔UV板，在340 nm下，測定吸光度值。

1.8.3環(huán)磷酸腺苷(cAMP)和環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)含量測定 按“1.8.1”操作處理好的血小板懸液，加入等體積80%冰乙醇終止反應(yīng)，樣品在3 000 r·min-1離心10 min，獲取上清液，根據(jù)cAMP和cGMP含量測定試劑盒在450 nm下測定吸光度值，計(jì)算cAMP和cGMP的含量。

1.8.4胞內(nèi)血栓素(TXB2)和6-keto-PGF1α水平的測定 按“1.8.1”操作處理好的血小板懸液，加入終濃度為2.5 mmol·L-1的冰EDTA和終濃度為100 μmol·L-1的吲哚美辛終止反應(yīng)，懸液通過12 000×g離心3 min后[10]，在4 ℃下收集上清液，根據(jù)TXB2和6-keto-PGF1α含量測定試劑盒，在450 nm下測定吸光度值，計(jì)算TXB2和6-keto-PGF1α的水平。

1.8.5胞內(nèi)鈣離子濃度測定 GFP加入5 μmol·L-1的Fura-2/AM，37 ℃孵育60 min，使Fura-2進(jìn)入血小板內(nèi)，并與Ca2+耦合，將Fura-2負(fù)載的血小板與WEAE-M 30%，或空白對(duì)照(含0.5 % DMSO生理鹽水)、陽性對(duì)照(Aspirin)，孵育10 min，加入Collagen刺激活化，隨即用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行初次測定，之后依次記錄加入Triton X-100后及加入EGTA后的熒光值，計(jì)算出胞內(nèi)鈣離子濃度[11]。

1.8.6流式細(xì)胞術(shù)檢測血小板表面CD62P的表達(dá) 按“1.8.1”操作處理好的血小板懸液，按100 ∶1加入CD62P-PE染料，室溫暗室放置40 min，混勻，加入1%多聚甲醛200 μL固定20 min，3 500 r·min-1離心5 min，棄上清，用PBS重懸，上流式細(xì)胞儀檢測[12]。

2 結(jié)果

2.1 WEAE-M 30%對(duì)不同激動(dòng)劑誘導(dǎo)大鼠血小板聚集的影響結(jié)果如Fig 1，與空白對(duì)照組比較，高(200 mg·L-1)、中(100 mg·L-1)、低(50 mg·L-1)濃度的WEAE-M 30%均能對(duì)Collagen、Thrombin、ADP誘導(dǎo)的血小板聚集有明顯抑制作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其中以對(duì)Collagen誘導(dǎo)的血小板聚集抑制活性最為明顯。因此后續(xù)其抗血小板聚集活性機(jī)制的探討以Collagen為激動(dòng)劑。

2.2 WEAE-M 30%對(duì)Collagen介導(dǎo)的血小板活化通路的影響如Fig 2所示，在GPVI通路信號(hào)中，WEAE-M 30%對(duì)PLCγ2的磷酸化水平無明顯抑制作用，但表現(xiàn)出促進(jìn)趨勢；對(duì)p-Syk水平抑制作用無明顯影響，而對(duì)p-Src水平有明顯抑制作用(P<0.01)。在MAPK通路信號(hào)中，WEAE-M 30%低、高濃度對(duì)p-p38水平有明顯抑制作用(P<0.05或P<0.01)；中、高濃度對(duì)p-ERK水平有明顯抑制作用(P<0.01)。

Fig 1 Effect of WEAE-M 30% on platelet aggregation induced by different agonists

Fig 2 Effect of WEAE-M 30% on protein expression of GPVI，MAPK pathways

2.3 WEAE-M 30%對(duì)血小板ATP釋放的影響如Fig 3所示，與空白組比較，不同濃度WEAE-M 30%對(duì)ATP釋放具有明顯抑制作用(P<0.01)，200 mg·L-1組效果最好，ATP釋放量比空白組的減少了53.00%；而Aspirin對(duì)ATP的釋放沒有明顯影響。

Fig 3 Effect of WEAE-M 30% on platelet ATP release induced by collagen

2.4 WEAE-M 30%對(duì)血小板cAMP和cGMP釋放量的影響如Fig 4所示，與空白組比較，100 和200 mg·L-1的WEAE-M 30%對(duì)血小板內(nèi)cAMP和cGMP的釋放有促進(jìn)作用，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；陽性藥Aspirin能使血小板內(nèi)cGMP含量明顯升高(P<0.01)。

2.5 WEAE-M 30%對(duì)血小板TXB2和6-keto-PGF1α含量的影響如Fig 5所示，與空白組比較，不同濃度WEAE-M 30%對(duì)TXB2水平均有明顯影響(P<0.01)，100、200 mg·L-1濃度對(duì)TXB2的水平影響相當(dāng)；與陽性組比較，高、中、低劑量組均表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢。與空白組比較，不同濃度WEAE-M 30%對(duì)血小板6-keto-PGF1α的水平均有明顯抑制作用(P<0.01)。

2.6 WEAE-M 30%對(duì)血小板胞內(nèi)鈣離子活化的影響與空白組比較(Fig 6)，不同濃度WEAE-M 30%對(duì)血小板鈣離子活化均有明顯影響(P<0.01)，表現(xiàn)為抑制鈣離子活化；在WEAE-M 30%濃度為200 mg·L-1時(shí)效果最好，鈣離子濃度僅為(52.50±5.57) nmol·L-1，比陽性組減少了85%。

2.7 WEAE-M 30%對(duì)血小板P-selection表達(dá)的影響結(jié)果如Fig 7所示，與空白組比較，在WEAE-M 30%濃度為50、200 mg·L-1時(shí)，對(duì)血小板P-selection表達(dá)有明顯抑制作用(P<0.05)，在濃度為100 mg·L-1，無明顯影響；與陽性組比較，抑制活性較弱。說明WEAE-M 30%在Collagen誘導(dǎo)下對(duì)P-selection表達(dá)有一定的抑制作用，但抑制活性低于陽性組。

Fig 4 Effect of WEAE- M 30% on platelet cAMP and cGMP release induced by collagen

Fig 5 Effect of WEAE-M 30% on contents of TXB2 and

Fig 6 Effect of WEAE-M 30% on intracellular calcium ion concentration of platelets induced by collagen

3 討論

糖蛋白Ⅵ(GPⅥ)為血小板膜糖蛋白受體，僅在血小板和巨核細(xì)胞表達(dá)，GPⅥ可由膠原等激動(dòng)劑誘導(dǎo)活化，繼而引起顆粒內(nèi)容物的釋放和血小板內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[13]。在血小板中，F(xiàn)c-受體-γ鏈與GPVI受體均可表達(dá)，當(dāng)GPVI與膠原蛋白結(jié)合時(shí)，Src家族激酶被激活而引起Syk的酪氨酸磷酸化，此時(shí)兩銜接蛋白將PLCγ2等連接在一起從而形成復(fù)合物，且活化PI3K、PLCγ2蛋白，激活其共同活化途徑的整合素αIIbβ3。αIIbβ3進(jìn)一步導(dǎo)致MAPK家族中JNK、ERK和p38磷酸化，最后引起血小板活化、聚集、釋放等反應(yīng)[14-15]。本研究中，WEAE-M 30%對(duì)Collagen介導(dǎo)的血小板GPVI信號(hào)通路蛋白Src，MAPK信號(hào)通路蛋白p38、ERK蛋白磷酸化水平的表達(dá)均有明顯抑制作用。目前，已發(fā)現(xiàn)多種抗血小板聚集作用的相關(guān)機(jī)制，例如增加血小板細(xì)胞內(nèi)cGMP與cAMP含量，抑制花生四烯酸(AA)的生成以及MAPK、NO、ATP酶的活性等[16]。cGMP和cAMP水平在正常情況下處于動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)血小板細(xì)胞內(nèi)cGMP、cAMP水平稍有升高就會(huì)明顯抑制血小板ATP釋放、抑制血栓素合成、降低鈣離子濃度以及抑制血小板活化[17]。當(dāng)血小板被激活時(shí)，花生四烯酸(AA)會(huì)形成不穩(wěn)定的過氧化物PGG2和PGH2，在血栓素合成酶(TXAS)和PGI2合成酶的催化作用下兩者分別形成血栓烷素TXA2和PGI2。TXA2可引起血管收縮和血小板聚集，PGI2可增加cAMP的含量，從而抑制血小板聚集。由于TXA2和PGI2性質(zhì)非常不穩(wěn)定，迅速代謝難以被檢測，因此人們常對(duì)二者相對(duì)穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物TXB2和6-Keto-PGF1α的濃度變化程度來反映血小板的活化狀態(tài)。血小板顆粒的釋放也是其活化過程的重要步驟，當(dāng)血小板活化時(shí)，血小板需將原存儲(chǔ)于血小板內(nèi)的α-顆粒、致密顆粒和溶酶體中的成分釋放到血小板外，其中從致密顆粒內(nèi)釋放出來的成分主要包括ATP、Ca2+、ADP以及5-HT等[6]。本研究中的WEAE-M 30%可明顯抑制ATP、Ca2+、血栓素TXB2的釋放水平。P-selection是存在于血小板α顆粒膜上的一種糖蛋白，血小板活化后，P-selection在細(xì)胞表面迅速表達(dá)，釋放α粒子，導(dǎo)致白細(xì)胞黏附[18]。本研究中的WEAE-M 30%可明顯抑制的P-selection釋放水平。

綜上所述，WEAE-M 30%抗血小板聚集作用可能是通過抑制血小板活化通路GPVI、MAPK蛋白Src、p38、ERK磷酸化表達(dá)水平，以及抑制血小板典型代表顆粒ATP、P-selection、Ca2+的釋放而發(fā)揮其活性作用。

Fig 7 Effect of WEAE-M 30% on CD62P expression in platelets induced by collagen *P<0.05，**P<0.01 vs blank