益腎清絡(luò)活血方對CFA大鼠OPG/RANKL通路的影響及機(jī)制

李丹鳳，王 雯，許 萍，陳修平，李 艷

(1.皖南醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，2.皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院中醫(yī)科，國醫(yī)大師李濟(jì)仁工作室，安徽 蕪湖 241002)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種病因不明以滑膜炎癥增生、軟骨破壞等為特征的自身免疫性疾病，致機(jī)體出現(xiàn)不可逆的關(guān)節(jié)損傷，甚至殘疾，嚴(yán)重影響身心及社會健康[1-2]。目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對于RA患者的治療重點(diǎn)多是免疫抑制加非甾體類消炎藥和抗風(fēng)濕藥，長期服用有一定的副作用[3]。因此，迫切需要開發(fā)一種治療RA的藥物用于臨床。新安醫(yī)家李艷主任在李濟(jì)仁教授清絡(luò)飲(Qing-luo-yin,QLY)基礎(chǔ)上，自擬益腎清絡(luò)活血方(Yisheng-Qingluo-Huoxie prescription,YSF)，臨床療效明顯，但相關(guān)機(jī)制尚未明確。

據(jù)很多文獻(xiàn)報(bào)道RA的機(jī)制，多由于炎癥、免疫的失調(diào)以及骨侵蝕破壞[4-7]，同時(shí)，滑膜炎是關(guān)節(jié)骨侵蝕的主要原因，與一些維持破骨細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)因子缺乏控制密切相關(guān)，如核因子受體激活因子B配體(nuclear factor receptor activator B ligand,RANKL)水平升高和骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)下降。因此，目前RA治療的主要目的是降低免疫炎癥反應(yīng)，抑制關(guān)節(jié)惡病變和骨損傷的發(fā)展，進(jìn)而保護(hù)關(guān)節(jié)功能。故本研究旨在以AIA模型為基礎(chǔ)，初步研究新安YSF方是否在抑制炎癥反應(yīng)及骨保護(hù)方面發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 動物雄性Sprague-Dawley大鼠，體質(zhì)量(200±20) g，6周齡，共32只，購自南京青龍山實(shí)驗(yàn)動物公司，生產(chǎn)許可證：SCXK(上海)，2018-0004。本研究經(jīng)過皖南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)，在SPF動物房適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.2 藥品與試劑QLY成份：苦參、黃柏、黃柏各9 g、萆薢10 g；YSF成份：QLY加炙黃芪30 g、當(dāng)歸15 g、炒菟絲子12 g、仙靈脾12 g、雞血藤15 g、紅藤15 g、法半夏9 g、蒲公英20 g，按照古方與現(xiàn)代劑量的換算倍數(shù)計(jì)算，大鼠每日灌胃YSF與QLY劑量換算成生藥量分別為14.863、9.87 g·kg-1，中藥材購于皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院中藥房；完全弗氏佐劑(CFA)與芽孢桿菌Calmette-Guérin (BCG)購于Rebio Scientific(中國上海)和Rebio Scientific(美國雷德蒙德)。ELISA ：TNF-α、IL-1β(杭州聯(lián)科生物，批號為：A382H01112、A301BH00752)、OPG、RANKL(Biotech，批號：EIA-3509、EIA-3390)；OPG、RANKL、β-actin抗體(ABclonal，貨號分別為：A10551、A2550、AC038)；二抗Anti-Rabbit IgG(Thermo，貨號為：C31460100)；BCA增強(qiáng)型試劑盒(Beyotime，貨號P10010)；化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(USA，貨號P90719)；SDS-PAGE蛋白染色機(jī)上樣緩沖液(Beyotime，貨號P0281S)；蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物(通用型，50X)(Beyotime，貨號：P1045)、RIPA裂解液(Beyotime，貨號：P0013B)；TBS緩沖液(biosharp，貨號BL602A)；ReverAid第一鏈cDNA合成試劑盒(Thermoscientific，貨號01049288)和Universal qPCR Master Mix(BioLabs，貨號10086870)。

1.3 儀器RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；LC-SFJ-10手持式勻漿機(jī)(上海力辰西儀器科技有限公司)；Anthos Zenyth 200 型全波長酶標(biāo)儀(英國 Biochrom 公司)；PCR儀(美國ABI 7500 Real Time PCR System，Applied Biosystems)；核酸蛋白測定儀(美國ABI Qubit 熒光定量)；SimpliAmp PCR儀；EG1150H組織包埋機(jī)、RM2245轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)、HI1210攤片機(jī)、HI1210烤片機(jī)、AutoStainerXL(ST5010)自動載玻片染色機(jī)均購于Leica，德國；BX54光學(xué)顯微鏡、DP27成像系統(tǒng)均購于Olympus，日本；PowerPac Bsic型電泳儀、Mini Subcell GT型水平電泳槽(美國Life Technologies公司)；AlphaImager HP凝膠成像系統(tǒng)(美國ProteinSimpie 公司)；DV215CD型精密電子天平(美國Ohaus公司)。

1.4 方法

1.4.1模型制備 在SPF動物房隔離室適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，制備模型：75%乙醇消毒大鼠左足后跖部，皮下注射CFA 0.1 mL，誘導(dǎo)AIA模型大鼠，隨機(jī)取8只為Normal組大鼠，以生理鹽水代替CFA，剩余大鼠全部予以CFA注射。其中CFA的制備，參照文獻(xiàn)[8]。

1.4.2分組及給藥 按照隨機(jī)數(shù)字法，取8只作為Normal組，剩余造模成功的分為：AIA組，AIA-YSF組和AIA-QLY組，每組各8只，造模首日起，YSF組和QLY組分別給予14.863、0.987 g·kg-1·d灌胃量；剩余Normal與AIA全部予以等劑量生理鹽水。

1.4.3大鼠關(guān)節(jié)炎評分及體質(zhì)量的評估 關(guān)節(jié)炎評分由兩位獨(dú)立的研究人員量化，根據(jù)每只爪子的炎癥表現(xiàn)，評分為1～4分[9]，同時(shí)稱體質(zhì)量，并觀察其一般臨床情況。

1.4.4HE染色法觀察大鼠組織關(guān)節(jié)的病理變化 取大鼠右后肢膝關(guān)節(jié)與踝關(guān)節(jié)，置于10%中性福爾馬林溶液中固定24 h以上，經(jīng)過修塊、固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、展片、撈片、烤片，從染色機(jī)中取出，中性樹膠封片，最后于正置顯微鏡下觀察關(guān)節(jié)組織病理變化。

1.4.5IHC檢測大鼠關(guān)節(jié)中p-p65、MMP3的表達(dá) 取大鼠右后肢關(guān)節(jié)的石蠟切片，通過IHC進(jìn)行定位評價(jià)，并與抗體p-p65、MMP3孵育在4 ℃，按制造商的說明，用二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽進(jìn)行顯色反應(yīng)，胞核蘇木精反染，置顯微鏡下觀察關(guān)節(jié)組織病理變化。

1.4.6Q-PCR分析 用TRIzol試劑裂解滑膜組織。氯仿萃取后，有機(jī)相被丟棄。將水中總mRNA用異丙醇沉淀，再用75%乙醇純化，在SimpliAmp上作為cDNA合成的模板熱循環(huán)器(Thermo Fisher Scientific，Rockford，IL，USA)。獲得的cDNA隨后使用7500 Real-Time PCR系統(tǒng)進(jìn)行qPCR分析。以β-acin為內(nèi)參，根據(jù)2-△△CT法計(jì)算檢測基因的相對表達(dá)量。引物序列詳細(xì)如下：β-actin，F(xiàn)：5′-TGTCCAC CTTCCAGCAGATGT-3′，R：5′-AGCTCAGTAACAGTC CGCCTAGA;OPG-3′，F(xiàn)：5′-CCTTGCCCTGACCACTCT TAT-3′，R：′-CACACACTCGGTTGTGGGT-3′;RANKL，F(xiàn)：5′-GCAGATTTGCAGGACTCGACT-3′;R：5′-CCCC ACAATGTGTTGCAGTT-3′;MMP3，F(xiàn)：5′-GACACCAG CATGAACCTTGTT-3′;R：5′-GGAACCGAGTCAGGAC TATG-3′;TIMP-1，F(xiàn)：5′-CCTTCTGCAATTCCGACCT CGTC-3′;R：5′-CGGGCAGGATTCAGGCTATCTGG-3′。

1.4.7ELISA分析TNF-α、IL-1β、OPG、RANKL的表達(dá) 動物麻醉后，促凝管予以腹主動脈取血，室溫靜置2 h，3 500 r·min-1，離心10 min，根據(jù)試劑盒說明書，檢測血清中各指標(biāo)的定量表達(dá)。

1.4.8Western blot檢測大鼠滑膜中OPG與RANKL蛋白表達(dá) 取大鼠雙后肢的滑膜組織，將其剪成小塊，加入蛋白酶抑制劑(100X)、磷酸酶抑制劑(50X)、蛋白裂解液(RIPA)一定比例的混合液，冰上裂解，于4 ℃、12 000 r·min-1、離心10 min，取上清，BCA試劑盒，定量蛋白質(zhì)含量，SDS稀釋緩沖液稀釋后的樣品沸水變性，分等份，-80 ℃下保存。配制10%的SDS聚丙烯酰胺凝膠，上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、洗滌、顯影，最后用ImageJ軟件分析其灰度值。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體質(zhì)量、關(guān)節(jié)炎癥評分的變化如Tab 1所示，自繼發(fā)性炎癥d 15開始，YSF組的AIA大鼠關(guān)節(jié)炎評分明顯低于AIA模型大鼠，且體質(zhì)量未見明顯下降(P<0.05，P<0.05)，觀察期結(jié)束時(shí)，關(guān)節(jié)炎癥趨于緩和，體質(zhì)量未見明顯異常。

2.2 關(guān)節(jié)病理Normal組大鼠踝關(guān)節(jié)未出現(xiàn)異常病理變化。AIA組較Normal組出現(xiàn)明顯的滑膜浸潤、軟骨破壞以及骨侵蝕。經(jīng)YSF與QLY治療后，大鼠關(guān)節(jié)滑膜腔相對比較完整。但Fig 1示YSF較QLY在滑膜浸潤方面療效明顯。

2.3 YSF經(jīng)免疫組化法在大鼠關(guān)節(jié)中p-p65及MMP3的表達(dá)Fig 2、3示，p-p65以及MMP3在大鼠關(guān)節(jié)部位的陽性表達(dá)，與Normal組比較，AIA組陽性表達(dá)最明顯；QLY次之，YSF與Normal最為接近。

Tab 1 Effect of YSF on weight and arthritis scores and of RA model

Fig 1 Effect of YSF on histopathological changes of rat ankle joints (HE，400×)

Fig 2 Effect of YSF on p-p65 in rat ankle tissues (IHC，400×)

Fig 3 Effect of YSF on MMP3 in rat ankle tissues (IHC，400×)

2.4 RT-PCR檢測滑膜中RANKL、OPG mRNA的表達(dá)結(jié)果Tab 2所示，與Normal組比，AIA組大鼠明顯升高滑膜組織中RANKL的mRNA表達(dá)水平，(P<0.05)，降低OPG的mRNA表達(dá)(P<0.05)。其中YSF下調(diào)了滑膜中RANKL的表達(dá)(P<0.01)，上調(diào)了OPG的mRNA的表達(dá)(P<0.01)。

Tab 2 mRNA expression of RANKL and

2.5 ELISA分析TNF-α、IL-1β、RANKL、OPG、OPG/RANKL的表達(dá)如Tab 3所示，與Normal組相比，血清中TNF-α、IL-1β和RANKL水平在AIA模型中明顯升高(P<0.05，P<0.01，P<0.01)，OPG、OPG/RANKL則明顯下降(P<0.01，P<0.01)，而YSF明顯抑制其炎癥指標(biāo)的升高，升高OPG及OPG/RANKL水平(P<0.01，P<0.01)。

2.6 Western blot檢測大鼠滑膜中OPG與RANKL蛋白的表達(dá)Fig 4示，與Normal組比，AIA組大鼠滑膜中OPG表達(dá)量明顯降低(P<0.01)，RANKL的蛋白表達(dá)則升高(P<0.05)；經(jīng)YSF治療后，OPG明顯高表達(dá)(P<0.05)，而RANKL則明顯低表達(dá)(P<0.01)，遺憾的是，QLY的滑膜蛋白表達(dá)未見明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 討論

傳統(tǒng)中醫(yī)中藥配方，依據(jù)“君臣佐使”理論可以通過增效、減毒來改善RA的臨床癥狀。QLY是新安流派“張一貼”第14代傳人李濟(jì)仁教授療痹病的經(jīng)典名方，以苦參、黃柏、萆薢、青風(fēng)藤為核心藥，尤善治療熱痹。前期課題組經(jīng)過了大量的實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)其具有有效性、相對安全性和成本-效果等優(yōu)勢[10-11]，故選擇其為陽性對照藥，而不是一貫以臨床常用甲氨蝶呤、來氟米特等為對照，此舉亦是在祖國中醫(yī)藥被大力弘揚(yáng)的背景下，選取中藥有效方劑為對照。隨著疾病的進(jìn)展，RA患者后期多出現(xiàn)肝腎虧虛、經(jīng)絡(luò)受阻之象，僅靠單純的清熱除痹、通絡(luò)止痛之法，療效尚未達(dá)到理想預(yù)期。為此，國醫(yī)大師李濟(jì)仁教授嫡系傳人李艷主任在“痿痹統(tǒng)一論”思想指導(dǎo)下，基于益腎固本、氣血雙補(bǔ)的治法，通過QLY加味創(chuàng)制“益腎清絡(luò)活血方”。該方在QLY基礎(chǔ)上增加菟絲子與仙靈脾以溫補(bǔ)腎陽；炙黃芪、當(dāng)歸以補(bǔ)益氣血；雞血藤、紅藤行血止痛；法半夏兼顧祛痰燥濕；重用蒲公英增強(qiáng)基礎(chǔ)方的清熱之功。相對于清絡(luò)飲，該方清泄之性因補(bǔ)益而緩，臨床適應(yīng)面更廣；以腎為綱，通過益腎固精，增強(qiáng)全方強(qiáng)骨通絡(luò)之效。其臨床應(yīng)用廣泛，具有明顯的治療RA效果[12-13]。

Fig 4 Effect of YSF on expression of OPG and RANKL protein in synovial tissues of AA model rats

Tab 3 Effects of YSF on serum TNF-α，IL-1β，OPG，RANKL and OPG/RANKL in AIA model rats

文獻(xiàn)報(bào)道[14]，CFA誘導(dǎo)的RA動物模型具有穩(wěn)定、可靠、價(jià)廉、易獲得的特點(diǎn)，在對稱關(guān)節(jié)受累、軟骨的降解破壞，滑膜炎或浸潤等方面與人的RA具有相似的臨床特征。因此，廣泛應(yīng)用于抗RA藥物的臨床前藥理評價(jià)。加強(qiáng)注射CFA后，發(fā)現(xiàn)AIA大鼠的炎性癥狀逐漸加重，足爪腫脹、AI評分較高，體質(zhì)量減輕。而YSF組體質(zhì)量未見減輕，提示YSF不產(chǎn)生全身毒性。來自活化的巨噬細(xì)胞和滑膜成纖維細(xì)胞的關(guān)鍵促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6等是引起RA炎癥的主要因素[15]，實(shí)驗(yàn)到最后階段，發(fā)現(xiàn)AIA大鼠血清中TNF-α、IL-1β水平異常升高，提示RA中AIA模型建立成功。結(jié)果示YSF下調(diào)TNF-α、IL-1β的表達(dá)，改善炎癥環(huán)境。同時(shí)YSF組組織病理學(xué)參數(shù)、MMP3及p-p65的表達(dá)較AIA組，有強(qiáng)大的抑制作用。此外，破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨破壞通過異常的OPG/RANKL軸發(fā)生，且OPG/RANKL的比值可以決定骨變化方向，比值越低，表明骨流失增加[16]。OPG作為一種RANKL抑制劑，是通過激活破骨細(xì)胞和骨吸收而形成破骨細(xì)胞的關(guān)鍵因子[17]。在本研究中，YSF減輕了AIA大鼠關(guān)節(jié)軟骨和骨的損傷，恢復(fù)了血清和滑膜組織[18]中RANKL水平，增加OPG水平，提高OPG/RANKL比值，可能抑制炎癥誘導(dǎo)的破骨形成，表明YSF對骨的保護(hù)可能與OPG/RANKL的上調(diào)有關(guān)。

綜上，本研究初步發(fā)現(xiàn)YSF對AIA所致關(guān)節(jié)炎局部、全身的炎癥反應(yīng)和骨侵蝕具有一定的抑制作用。其機(jī)制可能與抑制炎癥因子的釋放，促進(jìn)骨保護(hù)，升高OPG/RANKL途徑而減少骨損傷相關(guān)。該研究“以腎為綱”，豐富了新安醫(yī)學(xué)代表理論“固本培元”的基本內(nèi)涵。然而仍存在一些局限性。需要建立更多的體內(nèi)外RA模型，明確YSF治療RA的具體分子機(jī)制，分析RA的關(guān)鍵病理基因和蛋白以及后期臨床上應(yīng)加強(qiáng)YSF的提取工藝或成分，使其在患者體內(nèi)發(fā)揮更明顯的抗RA作用。