基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接探討湖南省“兒童預防方”防治新型冠狀病毒肺炎的作用機制

彭麗琪，姚昆鵬，蔡虎志，唐燕萍，劉越美，陳青揚，陳新宇

(1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208)

迄今為止，由新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)引發(fā)的新型冠狀病毒肺炎(簡稱新冠肺炎)已成為全球范圍內(nèi)的疫情大流行，世界衛(wèi)生組織宣布新冠肺炎疫情為“國際關注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件”。截至2021年3月，全球已有超過1.2億人感染SARS-CoV-2，共計270萬余人死于新冠肺炎[1]，對人類生命健康構(gòu)成巨大威脅。SARS-CoV-2具有人群易感性，主要經(jīng)呼吸道飛沫和密切接觸傳播。機體感染SARS-CoV-2后表現(xiàn)為發(fā)熱、干咳等，重癥病情進展迅速，甚至引發(fā)器官組織的急性損傷、變性及壞死，預后極差。

為充分發(fā)揮湖湘中醫(yī)藥在疫情防控中的作用，湖南省中醫(yī)藥管理局組織國醫(yī)大師熊繼柏、新冠肺炎疫情防控省級中醫(yī)醫(yī)療救治專家組組長陳新宇等專家，結(jié)合湖南省地域及氣候特點，研究制定了“成人預防方”和“兒童預防方”。目前，預防方已在全省機關、企事業(yè)單位、學校等范圍內(nèi)得到全面推廣，用于抗疫前線和隔離、密切接觸人群的疾病預防，發(fā)揮出良好的防治效果?！逗鲜⌒鹿诜窝滓咔榉揽刂嗅t(yī)藥診療方案(2021年第二版)》的“兒童預防方”由黃芪、蘇葉、白術(shù)、防風、甘草、蘆根、薏苡仁和連翹組成，具有益氣固表、祛濕卻病、運脾開胃的功效，能提升人體正氣，增強御邪抗病能力。本研究旨在通過網(wǎng)絡藥理學方法預測“兒童預防方”防治COVID-19的活性成分、關鍵靶點，分析其潛在作用機制，為今后疫情防控和新藥研發(fā)提供基礎。

1 材料與方法

1.1 篩選藥物和COVID-19疾病靶點通過檢索TCMSP(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)、BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/index.php)和ETCM(http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/)數(shù)據(jù)庫，依據(jù)“OB≥30%，DL≥0.18”和“Score cutoff≥20、AdjustedP-value<0.05”的篩選條件，搜索活性成分及其藥物靶點。利用Universal Protein Resource(https://www.uniprot.org/)將靶點名稱校正為“Gene Symbol”，剔除無對應基因名和非人源靶點。利用GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://omim.org/)、DrugBank(https://www.drugbank.com/)、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)和PharmGkb(https://www.pharmgkb.org/)數(shù)據(jù)庫，以“COVID-19”為關鍵詞，檢索COVID-19疾病靶點。

1.2 構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點”拓撲網(wǎng)絡將藥物靶點和疾病基因?qū)隫enny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)中映射，二者交集靶點即為防治COVID-19的潛在作用靶點。利用R語言編輯腳本文件，安裝并運行Bioconductor數(shù)據(jù)工具(http://www.bioconductor.org/)，將共有基因“Symbol”轉(zhuǎn)化為“Entrez ID”。通過Cytoscape 3.8.2構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點”可視化網(wǎng)絡。

1.3 構(gòu)建交集靶點蛋白互作網(wǎng)絡將交集靶點批量導入STRING(https://cn.string-db.org/)數(shù)據(jù)庫中。選擇物種為“Homo sapiens”，設置“minimum required interaction score>0.90”，得到交集靶點蛋白互作網(wǎng)絡。調(diào)整網(wǎng)絡中的節(jié)點位置，使其排列緊湊且有序，以便觀察各節(jié)點的互作關系。

1.4 構(gòu)建核心靶點網(wǎng)絡將交集靶點蛋白設置節(jié)點屬性，批量導入Cytoscape軟件中，利用“CytoNCA”插件分析PPI網(wǎng)絡中的核心靶點。利用Excle中位數(shù)公式，計算出各節(jié)點BC、CC、DC、EC、LAC、NC的中位值。根據(jù)中位值大小篩選出每項均大于中位值的靶點。構(gòu)建“兒童預防方”防治COVID-19核心靶點網(wǎng)絡圖，導出核心靶點的拓撲參數(shù)。

1.5 GO功能和KEGG通路分析利用R語言軟件編輯腳本文件，設置過濾條件“P值<0.05”。從Bioconductor數(shù)據(jù)工具中查找“BioManager”、“DOSE”、“clusterProfiler”、“enrichplot”和“pathview”引用包對應安裝命令，運行腳本進行安裝。進行GO功能、KEGG通路分析，搜索“Description”與COVID-19相關的信號通路，繪制通路示意圖。

1.6 分子對接選取核心靶點網(wǎng)絡和“藥物-活性成分-靶點”拓撲網(wǎng)絡中的共有基因。結(jié)合“藥物-活性成分-作用靶點”拓撲網(wǎng)絡中Degree值排名，得到排名前6的小分子配體。利用PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)查找小分子配體的2D結(jié)構(gòu)，將小分子配體2D結(jié)構(gòu)在ChemBio3D Ultra 16.0軟件中轉(zhuǎn)化為3D結(jié)構(gòu)，進行“最小自由能”優(yōu)化。通過UniProt搜索靶點基因“Entry”，將“Entry”復制到PDB(https://www.pdbus.org/)數(shù)據(jù)庫，查找靶點基因的三維結(jié)構(gòu)。使用PyMOL對蛋白受體進行去水、去小分子配體等。利用AutoDock Tool對蛋白受體進行加氫。在二維結(jié)構(gòu)下繪制活性口袋。通過AutoDock Vina、PyMOL軟件對分子對接結(jié)果進行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 藥物及COVID-19疾病靶點篩選通過TCMSP、BATMAN-TCM、ETCM數(shù)據(jù)庫篩選出418種有效活性成分。利用UniProt將靶點標準化，選取與人相關的靶點，得到1 715個藥物靶點。活性成分與其靶點數(shù)量關系，見Fig 1。通過GeneCards、OMIM、DrugBank、TTD和PharmGkb數(shù)據(jù)庫聯(lián)合篩選疾病靶點，剔除重復值，得到1 289個疾病靶點。通過Venny 2.1.0將藥物靶點與疾病基因取交集，得到266個靶點，占并集靶點的0.97，見Fig 2。

Fig 1 Distribution of active ingredients and corresponding targets

Fig 2 Venn diagram of intersection targets

2.2 “藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡構(gòu)建將藥物及其活性成分、交集靶點賦予各自屬性，通過Cytoscape 3.8.2構(gòu)建“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡，見Fig 3。粉紅色圓形圖標代表活性成分，淡黃色菱形圖標代表交集靶點，淡綠色圓形圖標代表藥物。經(jīng)“Analyse Network”功能計算得出，網(wǎng)絡圖共有609個節(jié)點和2 741條邊，平均鄰數(shù)為8.985，網(wǎng)絡直徑為8，網(wǎng)絡半徑為5，特征路徑長度為3.254。

2.3 蛋白互作網(wǎng)絡分析將交集靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫，選用Multiple proteins工具，將Organism定義為“Homo sapiens”，繪制蛋白相互作用網(wǎng)絡，見Fig 4，5。PPI網(wǎng)絡有248個節(jié)點和1 134條邊，校正后P值<1.0e-16，平均節(jié)點度為9.15，平均局部集聚系數(shù)為0.363。通過MCODE插件提取關鍵蛋白模塊進行描述分析，得到4組核心模塊，見Fig 6。

Fig 3 “Drug-component-target”network

Fig 4 Protein interaction network

Fig 5 PPI network of intersection targets

Fig 6 Core modules for COVID-19 prevention and treatment

2.4 核心靶點預測通過CytoNCA插件分析PPI網(wǎng)絡的核心靶點。第一輪得到64個核心靶點，第二輪得到25個核心靶點，第三輪得到9個核心靶點(Fig 7～9)，即AKT1、JUN、STAT3、IL2、NR3C1、RELA、MAPK1、MAPK3和MAPK14。核心靶點的拓撲信息見Tab 1。

2.5 生物功能通路分析生物功能通路分析得到3 373條GO富集條目和202條KEGG信號通路(P<0.05)。GO功能富集結(jié)果包括生物過程(biological processes，BP)3 030個、細胞組成(cell composition，CC)118個、分子功能(molecular function，MF)225個。選取GO功能富集每組P值排名前10的條目繪制條形圖和氣泡圖，見Fig 10，11。由圖可知，BP主要與抗氧化反應、凋亡信號通路的調(diào)控、活性氧代謝過程、對脂多糖的反應、對細菌起源分子的反應、正向調(diào)節(jié)細胞因子的產(chǎn)生等有關。CC主要與囊腔、膜筏、膜微區(qū)、胞質(zhì)囊腔、分泌顆粒內(nèi)腔、孔復合體等相關。MF主要與細胞因子受體結(jié)合、細胞因子活性、受體配體活動、信號受體激活物的活性、泛素樣蛋白連接酶的結(jié)合、蛋白酶綁定等相關。

選擇KEGG通路分析P-value值排名前30的信號通路繪制條形圖和氣泡圖，見Fig 12，13。由圖可知，靶點主要涉及糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、美洲錐蟲病、人巨細胞病毒感染、卡波濟肉瘤相關皰疹病毒感染、腫瘤壞死因子信號通路等。

Fig 7 First round of screening

Fig 8 Second round of screening

Fig 9 Relationship diagram of core targets

Fig 10 Bar chart of GO function analysis

Tab 1 Topological information of core target proteins

Fig 11 Bubble diagram of GO function analysis

Fig 12 Bar chart of KEGG pathway analysis

2.6 分子對接“藥物-活性成分-靶點”拓撲網(wǎng)絡中Degree值排名前6的小分子配體依次為：槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)、山柰酚(kaempferol)、漢黃芩素(wogonin)、熊果酸(ursolic Acid)和柚皮素(naringenin)。將關鍵成分和核心靶點(RELA、AKT1、STAT3、JUN、MAPK1和MAPK3)進行分子對接，靶點與關鍵活性成分、內(nèi)源性配體的結(jié)合能見Tab 2。結(jié)合能代表分子構(gòu)象穩(wěn)定性，結(jié)合能<0 kcal·mol-1提示分子之間具有結(jié)合活性，<-5.0 kcal·mol-1提示分子之間具有較強的結(jié)合活性。與內(nèi)源性配體相比，核心靶點與關鍵活性成分的結(jié)合能絕對值更大，表明這些活性成分更容易與核心靶點結(jié)合。采用微生信數(shù)據(jù)分析工具(http://www.bioinformatics.com.cn)，設置聚類方向為“row+col”，聚類方法為“complete”，距離方法為“Euclidean”，繪制分子對接結(jié)合能熱圖(Fig 14)。利用PyMOL將構(gòu)象穩(wěn)定的蛋白受體與分子配體進行分子對接，見Fig 15。

Fig 13 Bubble diagram of KEGG pathway analysis

3 討論

COVID-19屬于中醫(yī)學“濕毒疫”、“寒濕疫”等范疇，是一種因感受寒濕、溫熱、濁毒之癘氣引起的呼吸道疾病。病位主要在肺、脾，濕毒壅肺、肺氣郁閉為重要病機。中醫(yī)藥具有精準施治、全面調(diào)治、多靶點干預、多途經(jīng)防治等優(yōu)勢。在新冠肺炎疫情首次暴發(fā)與二次流行期間，中醫(yī)藥能有效阻斷病情蔓延，為危急重癥患者爭取治療先機?；趦和⑽覆蛔恪⒄龤馑靥澋捏w質(zhì)和湖南省地域及氣候特點，本研究確定了“兒童預防方”主要活性成分：quercetin、luteolin、kaempferol、wogonin、ursolic acid、naringenin。研究表明[2]，quercetin能有效結(jié)合SARS-CoV-2主要蛋白酶活性位點，縮短感染持續(xù)時間。luteolin與SARS-Cov-2表面尖峰蛋白結(jié)合防止病毒侵入機體，具有廣泛的抗病毒特性；通過抑制微血管內(nèi)皮細胞cAMP-磷酸二酯酶活性和黏附分子表達來防治肺炎[3]。kaempferol具有強大抗炎和抗纖維化特性[4]，通過多途徑、多靶點、多信號抑制SARS-CoV-2復制。wogonin通過NF-κB信號通路抑制炎性因子的產(chǎn)生，與SARS-CoV-2主要蛋白酶結(jié)合而發(fā)揮抗病毒作用[5]。Ursolic acid能阻斷病毒主要蛋白酶和聚合酶來抑制病毒復制或轉(zhuǎn)錄，揭示了熊果酸對SARS-CoV-2的抑制潛力[6]。naringenin能抑制病原體感染后的細胞自噬，減輕炎癥反應和肺纖維化，常被用于治療兒童氣道炎癥[7]。

Tab 2 Binding energies of core targets and key active ingredients (kcal·mol-1)

Fig 14 Heat diagram of binding energy

Fig 15 Molecular docking diagram

本研究獲取了防治COVID-19關鍵作用靶點：RELA、AKT1、STAT3、JUN、MAPK1和MAPK3。RELA特異性siRNA轉(zhuǎn)染下調(diào)脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)誘導肺泡Ⅱ型上皮細胞凝血和纖溶因子表達，STAT3能抑制干擾素應答、誘導免疫應答[8]。研究證實[9]，SARS-CoV-2感染后AKT1能影響細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄、翻譯、增殖等功能，減少組織損傷并幫助消除病毒感染。JUN是頂級樞紐宿主蛋白之一，既可以被SARS-CoV-2病毒蛋白直接靶向，還能間接參與病毒感染[10]。MAPK1、MAPK3是SARS-CoV-2感染后啟動補體和凝血途徑的關鍵因素，影響著COVID-19重癥患者血管內(nèi)凝血、血栓形成和相關并發(fā)癥的出現(xiàn)[11]。

KEGG通路富集結(jié)果主要與氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡、病毒感染等有關。AGE-RAGE信號通路對骨骼和心臟具有重要的保護作用，并參與氧化應激反應和纖維化轉(zhuǎn)導[12]。脂質(zhì)和動脈粥樣硬化產(chǎn)生的炎癥環(huán)境間接導致COVID-19和病情惡化[13]，其中高密度脂蛋白顆粒水平與病情嚴重程度呈負相關。膽固醇可間接增加患者對SARS-CoV-2的易感性，增加死亡風險[14]。COVID-19和美洲錐蟲病具有相似的作用機制，二者均會出現(xiàn)血管高凝、微血栓沉著和內(nèi)皮質(zhì)病變，預防性抗凝治療可降低患者死亡率[15]。人巨細胞病毒感染是COVID-19患者復發(fā)或繼發(fā)感染的危險因素。此外，感染SARS-CoV-2將誘導巨噬細胞M1極化，促進潛伏巨細胞病毒的再激活[16]?？úㄎ魅饬霭捳畈《緈iRNA能抑制25-羥基膽固醇(25-hydroxycholesterol，25HC)的產(chǎn)生，且25HC已被證明能減少SARS-CoV-2的感染風險[17]。研究表明[18]，SARS-CoV-2輔助蛋白在調(diào)節(jié)宿主對病毒感染的反應方面具有重要作用，能夠激活TNF通路和上調(diào)TNF-α表達，加速誘導細胞凋亡。

本研究從網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術(shù)出發(fā)，初步闡明了“兒童預防方”防治新冠肺炎的作用機制。本研究結(jié)果為科研人員提供初步探索和方向，后期的研究仍需通過實驗展開進一步驗證，旨在為兒童群體防治COVID-19以及藥物研究提供支持。