斜率比法測定水蛭抗凝血活性的實(shí)驗(yàn)室間聯(lián)合驗(yàn)證方法學(xué)

胡宇馳，肖斯婷，楊文良，郭玉東，許華玉，高 華，張 媛，唐黎明，張素慧，樸晉華，王婷婷，張 蕻，芮 菁，華曉東，侯 娟，楊天驕，李 波

(1.北京市藥品檢驗(yàn)研究院，國家藥品監(jiān)督管理局創(chuàng)新藥物安全研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中藥成分分析與生物評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；2.國家藥典委員會(huì)，北京 100061；3.中國食品藥品檢定研究院，北京 102629；4.上海市食品藥品檢驗(yàn)研究院，上海 200233；5.山西省食品藥品檢驗(yàn)所，太原 030001；6.天津市藥品檢驗(yàn)研究院，天津 300070)

水蛭是典型的活血化瘀藥物，收載入《中國藥典》，其功能主治為破血通經(jīng)、逐瘀消癥[1]。已有的研究結(jié)果證明，水蛭的藥理作用有抗凝血、抗血栓形成、抑制血小板聚集、改善血液流變學(xué)、促進(jìn)纖溶等，抗凝血是其主要的作用[2]。部分凝血活酶時(shí)間(APTT)的縮短是很多疾病的典型指標(biāo)，尤其是血瘀證相關(guān)疾病，血液呈現(xiàn)高凝狀態(tài)的血栓性疾病，如心肌梗塞、腦血管病變、肺梗死、深靜脈血栓形成、妊娠高血壓綜合癥和腎病綜合癥等[3]。已有的研究結(jié)果證實(shí)，水蛭具有縮短APTT的作用，整體動(dòng)物試驗(yàn)和離體試驗(yàn)具有規(guī)律的一致性[4]。

本課題組經(jīng)過研究證實(shí)，離體兔血漿中加入水蛭浸提液，浸提液濃度與APTT值的對(duì)數(shù)呈現(xiàn)直線關(guān)系，符合斜率比法測定的統(tǒng)計(jì)模型的要求，幾批藥材的預(yù)測定表明方法可行，初步證明斜率比法是適宜的測定水蛭抗凝血活性的生物檢定方法[5]。本文為進(jìn)一步的方法學(xué)驗(yàn)證研究。通過多家實(shí)驗(yàn)室測定，進(jìn)一步證明方法的科學(xué)性、適宜性和可行性，總結(jié)實(shí)驗(yàn)中的注意事項(xiàng)，并比較斜率比法和《中國藥典》2020年版中收載的凝血酶滴定法的差異。

1 材料與方法

1.1 參加聯(lián)合驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)室在國家藥典委員會(huì)的組織下，由北京市藥品檢驗(yàn)研究院經(jīng)前期研究后提出標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，統(tǒng)一提供藥品，北京市藥品檢驗(yàn)研究院、中國食品藥品檢定研究院、天津市藥品檢驗(yàn)研究院、山西省食品藥品檢驗(yàn)所和上海市食品藥品檢驗(yàn)研究院共5家實(shí)驗(yàn)室按統(tǒng)一的規(guī)程進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。各單位將試驗(yàn)原始記錄、數(shù)據(jù)計(jì)算和試驗(yàn)報(bào)告進(jìn)行整理，復(fù)印件統(tǒng)一提交，數(shù)據(jù)統(tǒng)一進(jìn)行計(jì)算。

1.2 驗(yàn)證用藥品螞蟥飲片，由北京康而福藥業(yè)有限公司提供3批，批號(hào)分別為：20171201、20171202、20171203。采用冰凍粉碎機(jī)粉碎成100目碎末。日本醫(yī)蛭藥材，由貴州信邦制藥股份有限公司提供4批，批號(hào)分別為：20171001、20171002、20170902、20170901，已由提供單位凍干粉碎。脈血康膠囊9批，由生產(chǎn)企業(yè)提供或由市場購置。螞蟥對(duì)照藥材，批號(hào)：121061-201806，購自中國食品藥品檢定研究院。菲牛蛭對(duì)照藥材，批號(hào)：121754-201901，購自中國食品藥品檢定研究院。協(xié)作驗(yàn)證用由北京市藥品檢驗(yàn)研究院統(tǒng)一提供給5家實(shí)驗(yàn)室。

1.3 儀器和APTT試劑全自動(dòng)血液凝固分析儀，包括ACLELTTE PRO和ACLELTTE 700等型號(hào)，Instrumentation Laboratory Company等單位生產(chǎn)，APTT試劑，由Instrumentation Laboratory Co等儀器實(shí)驗(yàn)公司生產(chǎn)，批號(hào)：N0394780等。枸櫞酸鈉，購自北京化學(xué)試劑公司等。凝血酶、纖維蛋白原等，血凝儀及APTT測定試劑等，均由參與單位使用本單位的儀器設(shè)備和試劑。

1.4 動(dòng)物及血漿日本大耳白家兔，5家實(shí)驗(yàn)室各自使用自己實(shí)驗(yàn)室的動(dòng)物。家兔頸總動(dòng)脈取血，3.2%枸櫞酸鈉1 ∶9抗凝，2 500 r·min-1離心15 min制備血漿，將多只(3只以上)兔血漿混勻，備用。

1.5 浸提液制備取水蛭對(duì)照藥材，精密稱定，加入0.9%氯化鈉注射液(1 g ∶10 mL比例)，混勻，4 ℃浸提30 min，低溫高速離心(4 ℃，5 000 r·min-1)制備上清液。吸取上清液，用0.9%的氯化鈉注射液稀釋成5、10、15 g·L-1濃度溶液(加0點(diǎn)，4個(gè)濃度成等差數(shù)列)，適當(dāng)時(shí)候可稀釋成其他適宜的等差系列濃度溶液(如7、14、2或10、20、30 g·L-1)。水蛭藥材脈血康膠囊，精密稱取藥材粉末或膠囊內(nèi)容物，與對(duì)照藥材同法制備相同濃度的浸提溶液。

1.6 APTT測定與活性計(jì)算取活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)測定樣品杯若干，每管依次加入一種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品或供試品溶液20 μL(空白對(duì)照為0.9%氯化鈉溶液)，兔血漿50 μL，APTT試劑50 μL，混勻，應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡，37 ℃±0.5 ℃預(yù)溫180 s，每管再加入CaCl2試劑50 μL，然后立即用血液凝固分析儀測定凝結(jié)時(shí)間，即APTT值。標(biāo)準(zhǔn)品或供試品稀釋液每個(gè)濃度的測定次數(shù)不得少于2次，各濃度的測定次數(shù)應(yīng)相同。測定時(shí)，血漿、標(biāo)準(zhǔn)品或供試品稀釋溶液、APTT試劑、CaCl2試劑的預(yù)溫時(shí)間可根據(jù)儀器或試劑的說明書適當(dāng)調(diào)整，或加樣后按儀器使用說明書進(jìn)行測定。測定順序應(yīng)保證標(biāo)準(zhǔn)品和供試品的平行性，盡量保證相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和供試品稀釋液的測定時(shí)間接近。測定中建議使用空白、S1、S2、S3、T1、T2、T3，空白、T1、T2、T3、S1、S2、S3的順序進(jìn)行測定。將測得的APTT值換算成對(duì)數(shù)，照斜率比法計(jì)算方法計(jì)算供試品抗凝血活性及實(shí)驗(yàn)誤差。試驗(yàn)的可靠性判定應(yīng)成立，本法的可信限率(FL%)不得大于15%。

1.7 相對(duì)準(zhǔn)確度、精密度、線性范圍研究取螞蟥對(duì)照藥材和菲牛蛭對(duì)照藥材，分別稱取0.64、0.8、1.0、1.25、1.56 g，加入10 mL氯化鈉注射液制備浸提液，均按估計(jì)效價(jià)100%與對(duì)照藥材，按照斜率比法測定水蛭抗凝血活性標(biāo)準(zhǔn)草案進(jìn)行試驗(yàn)。即5個(gè)待測溶液的相對(duì)效價(jià)水平分別為64%、80%、100%、125%和156%，在對(duì)數(shù)尺度上呈均勻間隔。每個(gè)效價(jià)水平由4家不同的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行相對(duì)效價(jià)測定，每家實(shí)驗(yàn)室獨(dú)立得到2個(gè)測定值，共8個(gè)測定值按《中國藥典》2020年版附錄通則9401“生物制品生物活性/效價(jià)測定方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算。

相對(duì)準(zhǔn)確度可接受標(biāo)準(zhǔn)：每個(gè)效價(jià)水平相對(duì)效價(jià)測定值的相對(duì)偏差應(yīng)在±20%范圍內(nèi)；以效價(jià)理論值的對(duì)數(shù)(橫坐標(biāo))對(duì)其相應(yīng)的效價(jià)測定值的對(duì)數(shù)(縱坐標(biāo))作直線回歸，回歸方程的斜率應(yīng)在0.80～1.25范圍內(nèi)。中間精密度可接受標(biāo)準(zhǔn)：每個(gè)效價(jià)水平相對(duì)效價(jià)測定值的幾何變異系數(shù)(GCV，%)應(yīng)不大于20%。

線性范圍：相對(duì)準(zhǔn)確度、中間精密度符合要求時(shí)的效價(jià)水平范圍，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中可能出現(xiàn)效價(jià)的范圍應(yīng)該在線性范圍內(nèi)。

1.8 樣品測定驗(yàn)證采用螞蟥對(duì)照藥材，對(duì)3批螞蟥飲片在5家實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行單獨(dú)測定，計(jì)算不同實(shí)驗(yàn)室測定結(jié)果的精密度。采用菲牛蛭對(duì)照藥材，對(duì)4批日本醫(yī)蛭飲片在5家實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行單獨(dú)測定，計(jì)算不同實(shí)驗(yàn)室測定結(jié)果的精密度。采用菲牛蛭對(duì)照藥材，對(duì)9批脈血康膠囊在5家實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行單獨(dú)測定，計(jì)算不同實(shí)驗(yàn)室測定結(jié)果的精密度。采用《中國藥典》2020年版中收載的凝血酶滴定法，各家實(shí)驗(yàn)室對(duì)3批螞蟥飲片、4批日本醫(yī)蛭飲片、9批脈血康膠囊、螞蟥對(duì)照藥材和菲牛蛭對(duì)照藥材進(jìn)行抗凝血酶效價(jià)測定。樣品測定結(jié)果，統(tǒng)計(jì)5家實(shí)驗(yàn)室的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，計(jì)算RSD%。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)室對(duì)照藥材測定抗凝血活性結(jié)果依照驗(yàn)證方案，由4家參加協(xié)作驗(yàn)證的單位，分別采用組織單位準(zhǔn)備的同一批螞蟥對(duì)照藥材和菲牛蛭對(duì)照藥材，在相對(duì)效價(jià)水平分別為64%、80%、100%、125%和156%，每家單位各測定兩個(gè)數(shù)據(jù)，要求是不同人員、不同儀器或不同日期。收到協(xié)作驗(yàn)證的各單位數(shù)據(jù)后，將螞蟥對(duì)照藥材和菲牛蛭對(duì)照藥材的8個(gè)數(shù)據(jù)列表，見Tab 1、2，并將測定值按《中國藥典》2020年版附錄通則9401“生物制品生物活性/效價(jià)測定方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算。各家實(shí)驗(yàn)室的典型數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)示意圖見Fig 1～4。

2.2 相對(duì)準(zhǔn)確度計(jì)算5個(gè)效價(jià)水平相對(duì)效價(jià)測定值的相對(duì)偏差及其置信區(qū)間，見Tab 3、4。

Fig 1 Typical data diagram of slope ratio method for

Fig 2 Typical data of slope ratio method for collaborative

Fig 3 Typical data of slope ratio method for collaborative

Tab 1 Slope ratio method of leeches anticoagulant activity titer determination combined verification test results

Tab 2 Results of slope ratio method and verification of anticoagulant activity titer of phanthrene leeches

Tab 3 Relative deviation of anticoagulant activity of leeches control herbs with different titer levels

Tab 4 Relative deviation of anticoagulant activity of phenanthrene leeches with different titer levels

螞蟥對(duì)照藥材測定相對(duì)偏差均在±20%范圍內(nèi)，以效價(jià)理論值的對(duì)數(shù)(橫坐標(biāo))對(duì)其相應(yīng)的效價(jià)測定值的對(duì)數(shù)(縱坐標(biāo))作直線回歸，回歸方程為Y=0.986 1X+0.001 9，R2=0.959 1。斜率0.986 1在0.8～1.25,見Fig 5。

Fig 5 Logarithmic linear regression diagram of theoretical value and measured value of anticoagulant activity of leeches by slope ratio method

菲牛蛭對(duì)照藥材測定相對(duì)偏差均在±20%范圍內(nèi)，以效價(jià)理論值的對(duì)數(shù)(橫坐標(biāo))對(duì)其相應(yīng)的效價(jià)測定值的對(duì)數(shù)(縱坐標(biāo))作直線回歸，回歸方程為Y=0.980 9X-0.014 2，R2=0.964。斜率0.980 9在0.8～1.25，見Fig 6。

Fig 6 Logarithm linear regression diagram of theoretical and measured anticoagulant activity titer of phenanthrene leeches by slope ratio method

2.3 中間精密度按中間精密度評(píng)價(jià)方法項(xiàng)下計(jì)算公式計(jì)算每個(gè)效價(jià)水平相對(duì)效價(jià)測定值的幾何標(biāo)準(zhǔn)偏差、GCV及其置信上限，見Tab 5、6。

Tab 5 Calculation results of intermediate precision of

Tab 6 Calculation results of intermediate precision

螞蟥對(duì)照藥材的GCV均<20%。菲牛蛭對(duì)照藥材的GCV均<20%。說明在不同人員、不同儀器、不同日期、不同血漿等，多家實(shí)驗(yàn)室測定的中間精密度均符合要求。

2.4 線性范圍以效價(jià)理論值的對(duì)數(shù)(橫坐標(biāo))對(duì)其相應(yīng)的效價(jià)測定值的對(duì)數(shù)(縱坐標(biāo))作圖，采用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，見Fig 5、6。

螞蟥對(duì)照藥材擬合的直線回歸方程為Y=0.986 1X+0.001 9，相關(guān)系數(shù)為0.979 3。表明在64%～156%，都能夠進(jìn)行準(zhǔn)確測定，線性范圍符合要求。

菲牛蛭對(duì)照藥材擬合的直線回歸方程為Y=0.980 9X-0.014 2，相關(guān)系數(shù)為0.981 8。表明在64%～156%，都能夠進(jìn)行準(zhǔn)確測定，線性范圍符合要求。

2.5 樣品測定結(jié)果采用螞蟥對(duì)照藥材，對(duì)3批螞蟥飲片在5家實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行斜率比法測定抗凝血活性，測定結(jié)果見Tab 7，同時(shí)采用《中國藥典》中收載凝血酶滴定法測定活性，結(jié)果見Tab 8。從測定結(jié)果可以看出，3批螞蟥飲片相對(duì)于螞蟥對(duì)照藥材來說，活性為99.5%、94.7%和100.4%，說明抗凝血效果與螞蟥對(duì)照藥材基本相似。進(jìn)行重復(fù)測定，3批螞蟥飲片的RSD%分別為13.9%、15.6%和9.9%，均<20%，說明樣品測定在多家實(shí)驗(yàn)室接測定結(jié)果基本一致，重復(fù)性較好。

采用菲牛蛭對(duì)照藥材，對(duì)4批日本醫(yī)蛭飲片在不同天進(jìn)行重復(fù)測定，測定結(jié)果見Tab 9，同時(shí)采用《中國藥典》中收載凝血酶滴定法測定活性，結(jié)果見Tab 10。從測定結(jié)果可以看出，4批日本醫(yī)蛭飲片相對(duì)于菲牛蛭對(duì)照藥材來說，抗凝血活性在79.4%、80.6%、127.8%和135.2%，4批日本醫(yī)蛭的抗凝血活性差異較大。不同實(shí)驗(yàn)室之間，測定結(jié)果的RSD%分別為15.4%、9.4%、13.5%和12.5%，均<20%，說明不同實(shí)驗(yàn)室之間對(duì)同一樣品測定重復(fù)性較好。凝血酶滴定法測定日本醫(yī)蛭飲片，測定結(jié)果均>16.0 U·g-1符合《中國藥典》的規(guī)定。但凝血酶滴定法多家實(shí)驗(yàn)室測定結(jié)果之間差異較大，包括對(duì)照藥材和飲片，RSD%均>50%，最高達(dá)78%；從測定結(jié)果一致性來看，斜率比法是優(yōu)于凝血酶滴定法的。

選擇菲牛蛭對(duì)照藥材為標(biāo)準(zhǔn)品，采用斜率比法測定9批脈血康膠囊的抗凝血活性，結(jié)果見Tab 11。同時(shí)采用《中國藥典》中收載凝血酶滴定法測定活性，見Tab 12。

從測定結(jié)果可以看出，9批脈血康膠囊相對(duì)于菲牛蛭對(duì)照藥材來說，抗凝血活性在14%～36%，試驗(yàn)均成立，5家實(shí)驗(yàn)室測定結(jié)果RSD%均<20%，斜率比法測定抗凝血活性適用于脈血康膠囊。凝血酶滴定法測定9批脈血康膠囊，多家實(shí)驗(yàn)室測定結(jié)果之間差異較大，RSD%均>50%，最高達(dá)68%；從測定結(jié)果一致性來看，斜率比法是優(yōu)于凝血酶滴定法的。

3 討論

中藥生物活性質(zhì)量控制的關(guān)鍵是實(shí)驗(yàn)誤差的控制，需要在多家實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行方法的重現(xiàn)并得到基本一致的測定結(jié)果，這是目前中藥生物活性測定研究的難點(diǎn)，也是方法建立過程中必須進(jìn)行的一個(gè)步驟[6-7]?！吨袊幍洹?020年版的通則9105“中藥生物活性測定指導(dǎo)原則”中，對(duì)實(shí)驗(yàn)室間的方法學(xué)驗(yàn)證僅有原則性規(guī)定，未見實(shí)操性的詳細(xì)內(nèi)容。本文考慮到斜率比法測定水蛭抗凝血活性是量化測定、采用樣品和對(duì)照品比較的方法，因而參照通則9401“生物制品生物活性/效價(jià)測定方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”來制定驗(yàn)證方案，為中藥生物活性測定方法的實(shí)驗(yàn)室間聯(lián)合驗(yàn)證提供一個(gè)可供參考的實(shí)例[8-12]。

Tab 7 Results of slope ratio method for determination of anticoagulant activity of leeches prepared slices

Tab 8 Results of thrombin titration for determination of the activity of leeches decoction pieces combined with verification

Tab 9 Results of slope ratio method for determination of anticoagulant activity of Japanese medical leeches decoction pieces

Tab 10 Results of thrombin titration for determination of activity of Japanese medical leeches decoction pieces combined with verification

Tab 11 Results of slope ratio method for determination of anticoagulant activity of Maixuekang capsules

Tab 12 Activity of Maixuekang capsules determined by thrombin titration

(1)方法的準(zhǔn)確度。采用螞蟥和菲牛蛭對(duì)照藥材，設(shè)置5個(gè)相對(duì)水平值64%、80%、100%、125%、156%，4家實(shí)驗(yàn)室測定的相對(duì)偏差均<±20%，效價(jià)理論值對(duì)數(shù)(橫坐標(biāo))和對(duì)應(yīng)的效價(jià)測定值對(duì)數(shù)(縱坐標(biāo))呈現(xiàn)明顯的直線關(guān)系，相關(guān)系數(shù)>0.95，斜率在0.95～1.05，說明方法的準(zhǔn)確度較好。

(2)中間精密度。采用對(duì)照藥材經(jīng)5家實(shí)驗(yàn)室間方法學(xué)考察，不同人員、不同儀器、不同日期、不同血漿等，各效價(jià)水平的GCV均≤20%，說明方法的中間精密度符合要求。采用多批次的飲片和脈血康制劑，多家實(shí)驗(yàn)室之間的RSD%均<20%，也說明本法的精密度較好。5家實(shí)驗(yàn)室之間，不同的儀器、人員、試劑等，測定藥材和制劑，結(jié)果均較為一致，證明了斜率比法測定水蛭抗凝血活性的方法的結(jié)果是可以重現(xiàn)性。

(3)線性范圍。從本次驗(yàn)證的結(jié)果來看，當(dāng)測定樣品的活性在對(duì)照品的64%～156%時(shí)，均可認(rèn)為所測得的結(jié)果真實(shí)、可信；如果樣品的活性測定低于對(duì)照品的64%或高于156%時(shí)，應(yīng)重新估計(jì)樣品的活性再次測定。

(4)方法之間的比較。凝血酶滴定法因滴定終點(diǎn)肉眼判定，未設(shè)對(duì)照消除誤差，測定值是離散型函數(shù)，導(dǎo)致結(jié)果的相對(duì)誤差大。與之相比，斜率比法是儀器自動(dòng)判定結(jié)果、對(duì)照藥材消除誤差、結(jié)果是連續(xù)型函數(shù)，客觀性和準(zhǔn)確性都更好，是一種更加科學(xué)的方法。

(5)方法的適宜性。經(jīng)5家實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證，斜率比法適用于螞蟥、日本醫(yī)蛭等不同基源的藥材測定，也適用于脈血康制劑的測定，具有很好的推廣性。

綜上，斜率比法測定水蛭的抗凝血活性，方法準(zhǔn)確、精密、穩(wěn)定，符合方法學(xué)驗(yàn)證的要求，可作為潛在的藥典方法，用于水蛭藥材和相關(guān)制劑的質(zhì)量控制。