煙酰胺單核苷酸對酒精誘導(dǎo)大鼠肝細胞胰島素抵抗的影響

肖 琳，郝麗萍，羅 綱

(1.中南大學湘雅公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學系，湖南 長沙 410078；2.華中科技大學同濟醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學系，湖北 武漢 430030；中南大學湘雅公共衛(wèi)生學院衛(wèi)生毒理學系，湖南 長沙 410078)

胰島素抵抗是貫穿Ⅱ型糖尿病發(fā)生發(fā)展全程的病理基礎(chǔ)[1]。近年來研究表明，過量酒精攝入可能通過引起機體氧化損傷、炎癥反應(yīng)、脂調(diào)素代謝紊亂或胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路損傷等機制誘導(dǎo)外周組織發(fā)生胰島素抵抗，而經(jīng)典的胰島素信號通路PI3K/Akt損傷是其中最為關(guān)鍵的機制之一[2-4]。沉默信息調(diào)節(jié)因子-1(silent information regulator 1，SIRT1)是一種氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(oxidized nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)依賴的組蛋白去乙?；?，可通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路的表達和激活來參與胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[5-6]。我們前期研究顯示，過量酒精代謝可通過降低大鼠肝臟內(nèi)NAD+水平，進一步抑制SIRT1蛋白表達及下游PI3K-Akt通路磷酸化，阻滯胰島素信號傳導(dǎo)而最終誘導(dǎo)肝臟胰島素抵抗，表明補充機體NAD+水平并進一步上調(diào)SIRT1蛋白表達可能是改善酒精誘導(dǎo)肝臟胰島素抵抗狀態(tài)的關(guān)鍵靶點[4]。

煙酰胺單核苷酸(nicotinamide mononucleotide，NMN)是一種自然存在的生物活性核苷酸，作為NAD+前體，其在機體內(nèi)通過煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶催化生成NAD+[7]。研究證實，口服NMN可完好無損的通過消化系統(tǒng)，體內(nèi)的吸收非常迅速，3 min內(nèi)進入血液，15 min內(nèi)增加組織中NMN含量，并迅速提升血液、肝臟等器官中NAD+水平[8]。然而，NMN能否通過補充NAD+水平改善酒精誘導(dǎo)的肝臟胰島素抵抗？潛在機制如何？目前尚未可知。因此，本文以前期研究為基礎(chǔ)，從NAD+/SIRT1通路及下游PI3K-Akt通路探討NMN改善酒精誘導(dǎo)肝臟胰島素抵抗狀態(tài)的相關(guān)機制。

1 材料

1.1 細胞原代大鼠肝細胞。

1.2 實驗動物與試劑雄性SPF級SD大鼠5只，體質(zhì)量(180～220)g，由中南大學實驗動物學部提供。Williams’E培養(yǎng)基(W4125)、IV型膠原酶(C5138)及煙酰胺單核苷酸(純度≥95%，貨號N3501，批號Lot#SLBT9580)均購自于美國Sigma-Aldrich公司；I型鼠尾膠原(杭州欣友生物技術(shù)有限公司)；胎牛血清FBS(美國Gibco)；胰島素(江蘇萬邦醫(yī)藥)；無水乙醇(天津市科密歐試劑公司)；Ex527(美國Selleck)；葡萄糖檢測試劑盒(北京中生北控生物科技有限公司)；肝糖原檢測試劑盒(A043-1-1，南京建成生物工程研究所)；Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒(日本Dojindo)；NAD+檢測試劑盒(美國AAT Bioquest)；RIPA裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；Cocktail磷酸酶抑制劑(德國Roche)；SIRT1抗體、p-PI3K抗體、PI3K抗體、p-Akt抗體、Akt抗體及HRP標記抗兔二抗購自于美國CST公司，ECL化學發(fā)光液及PVDF膜購自于美國Millipore公司。

1.3 儀器ELX800型酶標儀(美國BIOTEK)，Western blot電泳儀(美國Bio-Rad)，凝膠成像系統(tǒng)(美國Syngene)，Master Flex 7524-40循環(huán)泵(德國Barnant)。

2 方法

2.1 原代大鼠肝細胞培養(yǎng)(膠原酶法)[9]大鼠隔夜禁食，消毒后背位固定于蠟板上。正中切口開腹，鈍性分離并游離門靜脈，插入留置針后固定。不含膠原酶的37 ℃預(yù)熱灌流液以10～20 mL·min-1速度灌流，并剪斷下腔靜脈，等流出液體變清亮后，換含膠原酶的37 ℃預(yù)熱灌流液繼續(xù)灌流至肝臟變?yōu)橥咙S色且出現(xiàn)龜裂，停止灌流。分離肝臟至無菌平皿，用預(yù)冷培養(yǎng)基盡可能多吹散肝細胞，后用200目尼龍網(wǎng)進行過濾，4 ℃條件下50g低速離心5 min，重復(fù)3次獲得較高純度的肝細胞，接種于預(yù)鋪鼠尾膠原的培養(yǎng)板，加入含10%FBS的Williams’E培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，用于后續(xù)實驗。

2.2 建立酒精誘導(dǎo)大鼠肝細胞胰島素抵抗模型根據(jù)本課題組前期對酒精誘導(dǎo)大鼠肝細胞胰島素抵抗模型建立條件的摸索，原代大鼠肝細胞經(jīng)含無水乙醇25 mmol·L-1的Williams’E培養(yǎng)基孵育培養(yǎng)24 h后，可發(fā)展為胰島素抵抗模型。酒精作用時間、濃度及模型的穩(wěn)定性在本課題前期研究中已進行驗證[4]。

2.3 CCK-8實驗檢測NMN對原代大鼠肝細胞的毒性將原代大鼠肝細胞接種于96孔板，待細胞生長24 h后，分為空白組、陰性對照組和NMN組，空白組為無細胞的Williams’E培養(yǎng)基組，陰性對照組為有細胞的Williams’E培養(yǎng)基組，NMN組用Williams’E培養(yǎng)基配置終濃度為0.1、0.25、0.5和1 mmol·L-1溶液并分別加入對應(yīng)培養(yǎng)孔(n=5)。培養(yǎng)24 h后加入含10 μL CCK試劑的100 μL培養(yǎng)基溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，于450 nm波長處測定吸光度值(OD)，計算細胞存活率。

2.4 上清中葡萄糖消耗量檢測(葡萄糖氧化酶法)細胞完成干預(yù)后收集細胞上清培養(yǎng)液，嚴格按照試劑盒說明書檢測葡萄糖含量，以無細胞孔作為空白參照，計算細胞葡萄糖消耗量。

2.5 細胞內(nèi)肝糖原合成量檢測收集已完成干預(yù)細胞，采用蒽酮法檢測細胞內(nèi)肝糖原含量，詳細實驗操作參照試劑盒說明書進行。

2.6 肝細胞NAD+含量檢測收集已完成干預(yù)細胞，使用試劑盒內(nèi)裂解液裂解30 min后，在4 ℃條件下轉(zhuǎn)速5 000 r·min-1離心5 min，分離上清液測定NAD+含量，具體實驗操作參照試劑盒說明書進行。

2.7 Western blot檢測SIRT1、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt含量收集已完成干預(yù)細胞，用含PMSF及磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液提取總蛋白，BCA蛋白定量并調(diào)節(jié)各樣品總蛋白濃度一致。用微量上樣針加樣及Marker，80 V穩(wěn)壓電泳，完成后濕法轉(zhuǎn)膜，將蛋白轉(zhuǎn)移至已活化的PVDF膜上，再放入5%的脫脂奶粉封閉液內(nèi)封閉1 h。洗脫緩沖液洗膜3次，加入稀釋比為1 ∶1 000的一抗4 ℃過夜，再洗膜3次，加入稀釋比為1 ∶5 000的二抗孵育1 h，最后洗膜3次，進行顯影，獲得圖像使用Quantity One軟件進行分析。

3 結(jié)果

3.1 不同濃度NMN對原代大鼠肝細胞活性影響如Fig 1所示，在0～1 mmol·L-1的范圍內(nèi)，NMN對原代大鼠肝細胞存活率無明顯影響，參照已有研究使用的有效濃度[10]，后續(xù)選擇0.1 mmol·L-1及0.5 mmol·L-1濃度進行實驗。

3.2 不同濃度NMN對酒精誘導(dǎo)的肝細胞胰島素抵抗模型葡萄糖消耗量及肝糖原含量的影響根據(jù)選擇的NMN干預(yù)濃度設(shè)置5個分組，分別為：對照組(Con)、酒精模型組(Eth)、酒精+低濃度NMN組(Eth+LNMN，NMN濃度為0.1 mmol·L-1)、酒精+高濃度NMN組(Eth+HNMN，NMN濃度為0.5 mmol·L-1)、NMN對照組(NMN，NMN濃度為0.5 mmol·L-1)，干預(yù)24 h后檢測指標。結(jié)果如Tab 1所示，與對照組相比，酒精模型組的葡萄糖利用率及肝糖原含量均明顯下降(P<0.05)，出現(xiàn)明顯的胰島素抵抗狀態(tài)。相反，與酒精模型組相比，高、低濃度的NMN干預(yù)均可明顯升高細胞的葡萄糖利用率及肝糖原含量(P<0.05)，表明NMN具有改善酒精誘導(dǎo)的肝細胞胰島素抵抗的功能。此外，NMN單獨干預(yù)對肝細胞的葡萄糖利用率及糖原含量無明顯影響。

Tab 1 Effects of ethanol and NMN on glucose consumption and glycogen content in primary rat hepatocytes

Fig 1 Effects of NMN on cell viability of primary rat hepatocytes

3.3 不同濃度NMN對酒精誘導(dǎo)的肝細胞胰島素抵抗模型中PI3K-Akt信號通路的影響PI3K-Akt通路磷酸化是胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)不可缺少的關(guān)鍵步驟[5]。如Fig 2所示，與對照組相比，酒精暴露明顯降低細胞內(nèi)PI3K及Akt的磷酸化水平(P<0.01)，阻滯胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。而與酒精模型組相比，高、低濃度的NMN則可明顯增加PI3K及Akt的磷酸化水平(P<0.05)，恢復(fù)胰島素信號通路正常轉(zhuǎn)導(dǎo)，表明NMN改善酒精誘導(dǎo)的肝細胞胰島素抵抗與調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號通路活化密切相關(guān)。

3.4 不同濃度NMN對酒精誘導(dǎo)的肝細胞胰島素抵抗模型中NAD+含量及SIRT1蛋白表達影響NAD+依賴的去乙?；窼IRT1是PI3K-Akt信號通路的上游調(diào)節(jié)蛋白[5]，酒精在肝細胞內(nèi)代謝過程伴隨NAD+向NADH大量轉(zhuǎn)化[4]。如Fig 3所示，酒精暴露明顯降低了細胞內(nèi)NAD+含量(P<0.05)并抑制SIRT1蛋白表達(P<0.05)。與預(yù)期一致的是，高、低濃度的NMN干預(yù)均有效補充了細胞內(nèi)NAD+水平(P<0.01，P<0.05)，同時明顯提高SIRT1蛋白表達水平(P<0.05)，提示NMN極有可能是通過恢復(fù)NAD+/SIRT1通路水平，進一步調(diào)控PI3K-Akt信號通路改善酒精誘導(dǎo)的胰島素抵抗。

3.5 SIRT1抑制劑Ex527對NMN改善酒精誘導(dǎo)的肝細胞胰島素抵抗作用的影響為了進一步驗證NAD+/SIRT1通路在NMN改善酒精誘導(dǎo)的肝細胞胰島素抵抗過程中的關(guān)鍵作用，我們利用SIRT1的抑制劑Ex527進行驗證。設(shè)置4組，分別為：對照組(Con)、酒精模型組(Eth)、酒精+NMN組(Eth+NMN，NMN：0.5 mmol·L-1)和酒精+NMN+Ex527組(Eth+NMN+Ex527，Ex527：10 μmol·L-1)。如Tab 2和Fig 4，與Eth+NMN組相比，Eth+NMN+Ex527組的葡萄糖利用率及肝糖原含量明顯下降(P<0.05)，p-PI3K及p-Akt水平明顯降低(P<

Fig 2 Effects of ethanol and NMN on insulin signaling pathway

Tab 2 Effects of Ex527 on glucose consumption and glycogen content in primary rat hepatocytes

0.01)，但NAD+水平無明顯變化，表明NMN對酒精誘導(dǎo)肝細胞胰島素抵抗的改善效應(yīng)可被Ex527抑制。

Fig 3 Effects of ethanol and NMN on NAD+ content and SIRT1 expression in primary rat hepatocytes n=4)

4 討論

胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路損傷是胰島素抵抗發(fā)生的核心機制之一。在胰島素抵抗狀態(tài)下，肝細胞葡萄糖利用率及糖原含量將明顯降低[11-12]。已有多項研究表明，酒精可能通過抑制PI3K-Akt通路活化而誘導(dǎo)肝細胞、肌細胞、脂肪細胞等多種細胞發(fā)生胰島素抵抗[2,4,13]。相反，通過有效干預(yù)恢復(fù)PI3K-Akt通路活化則能明顯改善細胞胰島素抵抗狀態(tài)[14-15]。在本研究中，酒精暴露可誘導(dǎo)原代大鼠肝細胞發(fā)生胰島素抵抗，NMN干預(yù)則明顯增加了肝細胞葡萄糖利用率及糖原含量，表明NMN對酒精誘導(dǎo)的肝細胞胰島素抵抗狀態(tài)具有良好的改善效應(yīng)。此外，Western blot結(jié)果顯示，NMN能夠明顯增加PI3K-Akt通路的磷酸化水平，提示這種改善效應(yīng)與NMN恢復(fù)PI3K-Akt胰島素信號通路功能密切相關(guān)。然而，NMN如何調(diào)控PI3K-Akt通路，仍未可知。

Fig 4 Ex527 antagonized protective effects of NMN on ethanol-induced hepatic insulin

NAD+是細胞生命活動中參與多種生物學進程必不可少的輔酶。研究顯示，補充NAD+水平對包括肥胖、非酒精性脂肪肝、糖尿病在內(nèi)的多種代謝性疾病有良好的治療效應(yīng)[7,16]。值得注意的是，由酒精在機體內(nèi)代謝引發(fā)的整體NAD+水平降低被認為是酒精造成多種細胞損傷的關(guān)鍵始動環(huán)節(jié)[4,17]。我們前期研究也顯示，酒精阻滯肝細胞PI3K-Akt胰島素信號通路與其抑制NAD+/SIRT1通路密切相關(guān)，以上研究共同提示恢復(fù)NAD+/SIRT1通路極有可能是改善酒精誘導(dǎo)肝細胞胰島素抵抗的有效手段。然而，針對此靶點的研究仍處于起步階段，極為有限的研究顯示另一種NAD+前體煙酰胺核糖可通過補充肝組織NAD+水平改善酒精引發(fā)的小鼠肝損傷[18]。此外，白藜蘆醇可能通過調(diào)控酒精代謝過程，補充NAD+水平以改善酒精誘導(dǎo)的胰島素抵抗[4]，而相較于白藜蘆醇，NMN作為NAD+前體，具有更為直接補充機體NAD+水平的效力。在本研究中，酒精暴露可降低原代大鼠肝細胞的NAD+水平及SIRT1表達量，而NMN干預(yù)可明顯恢復(fù)NAD+水平、SIRT1表達量以及PI3K-Akt的磷酸化水平；相反，在SIRT1的抑制劑Ex527存在的情況下，盡管NMN有效恢復(fù)了酒精降低的NAD+水平，Ex527仍然阻斷了NMN上調(diào)PI3K-Akt磷酸化水平的作用，以上結(jié)果均表明，NMN可通過上調(diào)NAD+/SIRT1通路，進一步調(diào)控PI3K-Akt通路活化而改善酒精誘導(dǎo)的肝臟胰島素抵抗。

綜上所述，NMN具有改善酒精誘導(dǎo)肝臟胰島素抵抗的作用，其機制與NMN恢復(fù)NAD+/SIRT1通路功能，并進一步活化胰島素信號通路PI3K-Akt相關(guān)，這不僅為NMN干預(yù)防控酒精誘導(dǎo)2型糖尿病提供了依據(jù)，同時也為NMN干預(yù)防控更多的酒精相關(guān)疾病提供了機制參考。