紅豆樹籽油制備工藝優(yōu)化及脂肪酸類成分分析*

邢奇妹，周文娟，王春梅，歐余航，傅小偉，張琳婧，倪 林,3

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院，福建 福州 350008；2.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福建 福州 350002；3.自然生物資源保育利用福建省高校工程研究中心，福建 福州 350002）

紅豆樹（Ormosia hosiei Hemsl.&E.H.Wilson）隸屬于豆科紅豆屬植物[1]，又稱鄂西紅豆，主要分布于中國(guó)福建、陜西、云南、廣東等地區(qū)[2]，其根、莖、葉和種子的提取物中含有多種活性成分[3]，均可入藥，具有抗炎鎮(zhèn)痛、活血化瘀等功效，民間用于治療跌打損傷、風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及不明原因的腫痛[4-8]，具有較高的藥用價(jià)值。紅豆樹為福建省重點(diǎn)推廣的經(jīng)濟(jì)樹種，福建地區(qū)種植面積達(dá)400 hm2以上，植物資源豐富。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)紅豆樹種子的含油率在9%以上，然而現(xiàn)有文獻(xiàn)[9]僅分析了紅豆樹種子提取物的化學(xué)成分，其籽油組成成分未見報(bào)道。為進(jìn)一步探究紅豆樹種子的出油率及其籽油脂肪酸成分組成，本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化石油醚加熱回流提取紅豆樹籽油的提取工藝，并利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）分析鑒定紅豆樹籽油中的脂肪酸組成及含量，以期獲得一種高效、簡(jiǎn)單的紅豆樹籽油的提取方法，并為紅豆樹藥用價(jià)值的開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與儀器

1.1 材料 紅豆樹成熟種子采摘自福建省福州市晉安區(qū)北峰山區(qū)，經(jīng)福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院鄒雙全教授鑒定為豆科（Leguminosae）紅豆屬（Ormosia）紅豆樹（Ormosia hosiei Hemsl.&E.H.Wilson）的種子。種子干燥后粉碎備用，留樣保存于福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院制藥工程系。

1.2 試劑 正己烷（批號(hào)：20201021）、無(wú)水乙醇（批號(hào)：20200809）、石油醚（60～90 ℃）（批號(hào)：20200507）、乙醚（批號(hào)：20161109）、焦性沒食子酸（批號(hào)：20160710）、三氟化硼（批號(hào)：20200330）、甲醇（批號(hào)：20200616）、鹽酸（批號(hào)：20190419）、氫氧化鈉（批號(hào)：20200901）均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 主要儀器 ZL03348684型雙列六孔電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；CPA225D型電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；高速多功能粉碎機(jī)（永康市天琪盛世工貿(mào)有限公司）；HX-1050型恒溫循環(huán)器（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；7890A-安捷倫氣相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；CD-2560毛細(xì)管色譜柱（100 m×0.25 mm，0.20 μm）（北京迪馬科技有限公司）。

2 方法

2.1 紅豆樹籽油的提取 精密稱取2.000 g紅豆樹種子粉末置于250 mL圓底燒瓶中，以石油醚為提取溶劑，回流提取，提取液趁熱抽濾，含有油脂的石油醚旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，稱質(zhì)量。紅豆樹籽油提取率按以下公式計(jì)算：提取率=（紅豆樹籽油質(zhì)量/紅豆樹種子粉末質(zhì)量）×100%。

2.2 紅豆樹籽油回流提取的單因素試驗(yàn) 以紅豆樹籽油提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究3個(gè)因素對(duì)紅豆樹籽油提取率的影響，每個(gè)因素設(shè)置5個(gè)水平（見表1），獲得各條件下最佳提取工藝條件。

表1 單因素試驗(yàn)

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)篩選出單因素的最佳工藝條件[10-11]，利用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)提取時(shí)間（X1）、提取溫度（X2）和料液比（X3）設(shè)計(jì)三因素三水平的Box-Behnken試驗(yàn)（見表2），以籽油提取率（Y）為響應(yīng)值，確定紅豆樹籽油提取的最佳工藝條件。通過(guò)響應(yīng)面分析得到回流提取紅豆樹籽油的最佳工藝條件，并按照最佳工藝條件進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，以驗(yàn)證響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平

2.4 紅豆樹籽油脂肪酸成分分析

2.4.1 籽油前處理 稱取優(yōu)化條件下的紅豆樹籽油約0.1 g于圓底燒瓶，加入100 mg焦性沒食子酸、2 mL 95%乙醇、10 mL 12 mol/L鹽酸溶液，混勻后于70～80 ℃水浴中水解40 min。水解結(jié)束冷卻至室溫，加入10 mL 95%乙醇，用乙醚石油醚混合液（1∶1）萃取3次，取上層醚層置于烘箱中（50 ℃）干燥至恒重。干燥提取物裝入離心管，加入2 mL 2%氫氧化鈉甲醇溶液，置于85 ℃水浴30 min，后加入3 mL 14%三氟化硼甲醇溶液，繼續(xù)水浴30 min。冷卻至室溫后，加入1 mL正己烷振蕩萃取2 min后，靜置1 h。取100 μL上清液用正己烷定容至1 mL，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾裝入樣品瓶，待氣相色譜分析。

2.4.2 GC-MS分析條件 色譜柱為CD-2560（100 m×0.25 mm，0.20 μm），進(jìn)樣口溫度為250 ℃；載氣流速為0.5 mL/min；分流進(jìn)樣，分流比為10∶1；檢測(cè)器為FID；檢測(cè)器溫度為250 ℃。升溫程序：130 ℃保持5 min，以4 ℃/min的速率升溫至240 ℃，保持30 min。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 提取時(shí)間 隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，紅豆樹籽油提取率逐漸升高，提取時(shí)間為90 min時(shí)，提取率達(dá)到最大值為10.04%，提取時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，紅豆樹籽油提取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。這可能是因?yàn)樘崛r(shí)間延長(zhǎng)，紅豆樹籽油溶出增加，提取率升高，達(dá)到最適提取時(shí)間后，提取時(shí)間延長(zhǎng)導(dǎo)致紅豆樹籽油成分分解，提取率下降[12]。因此，最優(yōu)回流提取時(shí)間為90 min。（見圖1a）

3.1.2 提取溫度 隨著提取溫度的升高，紅豆樹籽油提取率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，提取溫度為70 ℃時(shí)，提取率達(dá)到最大值為9.98%。這可能是因?yàn)樘崛囟壬?，反?yīng)速率增大，分子熱運(yùn)動(dòng)加快，達(dá)到最適提取溫度后，溫度繼續(xù)升高，籽油成分被破壞，發(fā)生降解，導(dǎo)致提取率下降[13]。因此，最優(yōu)回流提取溫度為70 ℃。（見圖1b）

3.1.3 液料比 隨著液料比的增加，紅豆樹籽油提取率呈現(xiàn)先升高后趨于平緩的趨勢(shì)，液料比為20∶1（mL∶g）時(shí)，提取率達(dá)到最大值為9.84%。這可能是因?yàn)殡S著溶劑用量增加，紅豆樹籽油溶解量增加，提取率升高，達(dá)到最適溶劑用量時(shí)，籽油基本被溶解出來(lái)，再增加溶劑量提取率也不再增加[14]。因此，回流提取最優(yōu)液料比為20∶1（mL∶g）。（見圖1c）

圖1 不同提取條件對(duì)提取率的影響

3.2 響應(yīng)面分析

3.2.1 響應(yīng)面回歸模型建立與方差分析 以提取時(shí)間（X1）、提取溫度（X2）和液料比（X3）3個(gè)因素為響應(yīng)變量，以紅豆樹籽油提取率（Y）為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)三因素三水平的Box-Behnken試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)二次多項(xiàng)式回歸擬合分析，得出紅豆樹籽油提取率的預(yù)測(cè)值對(duì)X1、X2和X3的二次多項(xiàng)式回歸模型方程：Y=10.14+0.011X1-0.054X2+0.12X-0.00975X1X2-0.060X1X3+0.015X2X3-0.21X12-0.24X22-0.64X32。對(duì)回歸模擬進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。

表4 回歸方程方差分析

根據(jù)表4中的分析結(jié)果可知，紅豆樹籽油提取率的模型P=0.000 6＜0.01，表現(xiàn)為顯著，失擬項(xiàng)P＞0.05，表現(xiàn)為不顯著，說(shuō)明該模型擬合成功。表4中一次項(xiàng)X2顯著（P＜0.05），X1和X3不顯著（P＞0.05），說(shuō)明影響紅豆樹籽油提取率各因素的主次順序?yàn)樘崛囟?、液料比、提取時(shí)間；二次項(xiàng)X12、X22和X32均為極顯著（P＜0.01）。

3.2.2 響應(yīng)曲面圖分析 紅豆樹籽油提取率的響應(yīng)曲面圖見圖2。由圖2可見，提取時(shí)間和液料比值交互作用的響應(yīng)面曲面的坡度最大，等高線最密，說(shuō)明提取時(shí)間和液料比的交互作用對(duì)紅豆樹籽油提取率的影響最為顯著。圖2（a）為提取時(shí)間和提取溫度的交互作用對(duì)紅豆樹籽油提取率的影響，可以看出籽油提取率隨提取時(shí)間和提取溫度的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在提取時(shí)間為90 min，提取溫度為70 ℃附近出現(xiàn)最高籽油提取率。圖2（b）為提取時(shí)間和液料比值的交互作用對(duì)紅豆樹籽油提取率的影響，可以看出籽油提取率隨液料比值和提取時(shí)間的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在提取時(shí)間為90 min，液料比為20∶1（mL∶g）附近出現(xiàn)最高籽油提取率。圖2（c）為提取溫度和液料比值的交互作用對(duì)紅豆樹籽油提取率的影響，可以看出籽油提取率隨液料比和提取溫度的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在液料比20∶1（mL∶g），提取溫度為70 ℃附近出現(xiàn)最高籽油提取率。

圖2 各因素對(duì)提取率影響的響應(yīng)曲面圖

3.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 結(jié)合模型擬合和回歸方程進(jìn)行分析，紅豆樹籽油的最佳提取條件為提取時(shí)間93.38min，提取溫度71.27 ℃，液料比為20.05∶1（mL∶g），在該條件下紅豆樹籽油預(yù)測(cè)提取率為10.007%。為進(jìn)一步驗(yàn)證響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性，同時(shí)考慮試驗(yàn)條件的可操作性，采用提取時(shí)間為93 min，提取溫度為71 ℃，液料比為20∶1（mL∶g）進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，得到紅豆樹籽油提取率均值為10.01%，與預(yù)測(cè)值間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.004%，兩者無(wú)明顯差異，說(shuō)明響應(yīng)面法優(yōu)化的工藝條件可靠。

3.3 紅豆樹籽油脂肪酸成分分析結(jié)果 采用GB 5009.168—2016中的方法，通過(guò)GC-MS檢測(cè)紅豆樹籽油中脂肪酸成分組成及各組分含量，氣相色譜分析圖見圖3。

圖3 紅豆樹籽油的氣相色譜分析圖

通過(guò)GC-MS檢測(cè)紅豆樹籽油中脂肪酸成分組成及各組分含量，其結(jié)果見表5。紅豆樹籽油的脂肪酸總檢出率為95.67%，檢出的15種脂肪酸成分中，飽和脂肪酸含量為17.80%，不飽和脂肪酸含量為77.87%。脂肪酸中含量排名前三的成分為亞油酸、油酸、棕櫚酸，其中亞油酸含量高達(dá)48.33%，可作為良好的亞油酸來(lái)源。亞油酸是人體必需的一種n-6系列多不飽和脂肪酸[15]，已有文獻(xiàn)報(bào)道顯示其具有抗黑色素[16]、抗腫瘤[17]、抗真菌[18]、蚜蟲拒食作用[19]、殺螨[20]等活性。值得注意的是，紅豆樹籽油中含有0.77%的α-亞麻酸，其含量與橄欖油相當(dāng)[21]；棕櫚油酸含量（0.12%）高于大豆油（0.08%）；此外，紅豆樹籽油中含有0.48%的二十五碳烯酸。據(jù)研究顯示α-亞麻酸具有降血脂、抗炎、抗氧化、抗癌等生理功能[22]；棕櫚油酸具有控制體質(zhì)量、改善皮膚狀況、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、改善代謝綜合征與炎癥、抑制破骨細(xì)胞形成等功能[23]；二十碳五烯酸具有降血脂、降低心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)、抗腫瘤、抗炎、抗氧化應(yīng)激、穩(wěn)定斑塊及穩(wěn)定細(xì)胞膜等生物活性[24]，是重要的輔助治療藥物和保健品。紅豆樹籽油中高含量的不飽和脂肪酸，在日化行業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥業(yè)等行業(yè)具有良好的市場(chǎng)開發(fā)前景。

表5 紅豆樹籽油的脂肪酸組成及其含量

4 討論

以石油醚為萃取溶劑，回流提取紅豆樹籽油，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析得到回流提取紅豆樹籽油的最佳工藝條件為提取時(shí)間93.38 min，提取溫度71.27 ℃，液料比20.05∶1，在該條件下紅豆樹籽油預(yù)測(cè)提取率為10.007%，驗(yàn)證試驗(yàn)得到的提取率與預(yù)測(cè)值無(wú)明顯差異，響應(yīng)面法優(yōu)化的工藝條件可靠，可為紅豆樹資源利用及開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

經(jīng)GC-MS分析表明，石油醚回流提取得到的紅豆樹籽油中含有15種脂肪酸，其中不飽和脂肪酸含量較高，為77.88%，飽和脂肪酸含量為17.80%，含量排名前三的脂肪酸為亞油酸、油酸、棕櫚酸，其中亞油酸的含量高達(dá)48.33%。