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    關(guān)于單抗原液車間設(shè)計(jì)的探討

    2022-11-08 02:45:00王可
    化工與醫(yī)藥工程 2022年5期
    關(guān)鍵詞:工藝

    王可

    (吉林醫(yī)藥設(shè)計(jì)院有限公司,吉林 吉林 130000)

    單抗即單克隆抗體,是通過將抗原注入到宿主動(dòng)物體內(nèi)啟動(dòng)機(jī)體免疫應(yīng)答而產(chǎn)生的。單抗藥物在病毒性疾病、自身免疫性疾病、惡性腫瘤及烈性傳染病的防治領(lǐng)域有著突出的作用,在COVID-19 防治中也有著不俗的表現(xiàn)。我國(guó)單抗都是采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行表達(dá),主要以中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系(CHO)為主。在抗體純化過程中除了要考慮回收率和純度以外,還需有效的滅活和清除病毒。單抗原液車間生產(chǎn)的原液不適用熱力滅菌工藝,通常選擇無菌操作的非最終滅菌生產(chǎn)工藝[1],這對(duì)車間環(huán)境以及微生物污染水平的控制要求較高。本文將從單抗原液車間生產(chǎn)工藝及平面布局設(shè)計(jì)方面共同探討單抗原液車間的設(shè)計(jì)方法。

    1 關(guān)于單抗病毒的風(fēng)險(xiǎn)

    CHO 細(xì)胞系是制造許多治療性蛋白質(zhì)的主力。CHO 細(xì)胞的生物安全等級(jí)為一級(jí),CHO 本身存在內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒,這是已經(jīng)被證實(shí)了的,但這種病毒對(duì)人類不具有致病性。從藥物質(zhì)量安全角度出發(fā),遵循SFDA 公布的《人用單克隆抗體質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則》,加入病毒去除和滅活方法。

    此外,基于哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行的培養(yǎng)發(fā)酵,產(chǎn)品被病毒污染是考慮的主要生產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)之一。病毒污染的其他潛在來源可能還有:使用已經(jīng)被污染了的主細(xì)胞種子庫或工作細(xì)胞種子庫;操作員可能帶進(jìn)病毒,污染工藝;細(xì)胞線殘留上一級(jí)仍有活力的病毒。因?yàn)椴溉閯?dòng)物細(xì)胞為帶入的病毒污染物提供了合適的宿主細(xì)胞,因此病毒量可能會(huì)隨著細(xì)胞培養(yǎng)而放大,進(jìn)而可能增加生產(chǎn)過程的整體風(fēng)險(xiǎn)。

    2 單抗原液車間的設(shè)計(jì)理念

    為了最小化病毒污染的風(fēng)險(xiǎn)或降低將污染物攜帶至最終產(chǎn)品的風(fēng)險(xiǎn),盡量減輕生產(chǎn)環(huán)境的微生物負(fù)載,所有帶有病毒風(fēng)險(xiǎn)的工藝步驟應(yīng)該在各自獨(dú)立生產(chǎn)間中完成,采取單向流設(shè)計(jì)。單向流是通過將車間分為供應(yīng)側(cè)走廊(共用的供應(yīng)走廊,進(jìn)入工藝間的人物流通道)和廢棄物走廊(用于收集各個(gè)生產(chǎn)工藝間潛在被污染的物料的共用走廊)實(shí)現(xiàn)的。在廢棄物走廊收集的物料和廢棄物需經(jīng)過充分處理后,才能轉(zhuǎn)運(yùn)至供應(yīng)側(cè),要避免攜帶污染物。物料經(jīng)過雙扉式滅菌柜去污后,才能從返回走廊進(jìn)入潔凈區(qū)。

    3 生產(chǎn)工藝核心內(nèi)容的設(shè)計(jì)要點(diǎn)

    單抗原液的生產(chǎn)工藝主要概括為兩個(gè)階段:上游細(xì)胞的培養(yǎng)、發(fā)酵和下游的純化。細(xì)胞種子經(jīng)搖瓶、WAVE 反應(yīng)器、一、二、三級(jí)種子培養(yǎng)擴(kuò)增后進(jìn)入發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵結(jié)束后經(jīng)離心機(jī)進(jìn)入下游進(jìn)行純化。離心后的料液經(jīng)過層析、超濾后變成原液。原液生產(chǎn)過程中還有輔助系統(tǒng):培養(yǎng)基配制、緩沖液配制以及CIP 等系統(tǒng),如圖1 和圖2所示。具體的工藝流程描述如下:

    圖1 上游生產(chǎn)工藝圖Fig.1 Upstream production process diagram

    圖2 下游生產(chǎn)工藝圖Fig.2 Downstream production process diagram

    具體的工藝流程描述如下:

    (1)細(xì)胞復(fù)蘇:細(xì)胞復(fù)蘇和凍存講究“慢凍快溶”,復(fù)蘇時(shí)一定要將凍存在液氮或-80 ℃中凝固的細(xì)胞凍存液快速融化至37 ℃,使胞外凍存時(shí)的冰晶迅速融化,避免冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶,對(duì)細(xì)胞造成損害。

    (2)細(xì)胞傳代培養(yǎng)

    懸浮細(xì)胞培養(yǎng),懸浮培養(yǎng)是指細(xì)胞在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖,能連續(xù)培養(yǎng)和連續(xù)收獲的培養(yǎng)技術(shù)。通常待培養(yǎng)液中酚紅指示劑變黃,在已紫外滅菌后的超凈臺(tái)上吸出或倒出細(xì)胞懸液至離心管中離心,棄去舊培養(yǎng)液,加新培養(yǎng)液,充分吹打以分散細(xì)胞。吸取適量細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,或直接取適量細(xì)胞懸液至新培養(yǎng)瓶中,再補(bǔ)加一定量新鮮完全培養(yǎng)液進(jìn)行傳代,有些脆弱的細(xì)胞用自然沉降法沉降細(xì)胞,吸去上面舊培養(yǎng)液加入新的完全培養(yǎng)液后吹散進(jìn)行傳代。

    優(yōu)點(diǎn):擴(kuò)大培養(yǎng)比較容易,占地面積小,培養(yǎng)過程簡(jiǎn)單,細(xì)胞增殖快。

    缺點(diǎn):只有少數(shù)細(xì)胞適合懸浮培養(yǎng)。

    貼壁細(xì)胞培養(yǎng),培養(yǎng)貼壁依賴型細(xì)胞最初采用轉(zhuǎn)瓶系統(tǒng)培養(yǎng),這種培養(yǎng)一般用于小量培養(yǎng)到大規(guī)模培養(yǎng)的過渡階段。瓶底中細(xì)胞覆蓋率達(dá)70%~80%時(shí),在經(jīng)紫外滅菌后的超凈臺(tái)上,棄去舊細(xì)胞培養(yǎng)液,加預(yù)熱好的新鮮完全培養(yǎng)液終止消化,輕輕吹打使細(xì)胞脫落且分散均勻,直接吸取適量細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)瓶中或離心去除上清液,加適量新鮮完全培養(yǎng)液吹打重懸細(xì)胞,然后轉(zhuǎn)移適量細(xì)胞懸液至新培養(yǎng)瓶中,再加入一定量完全培養(yǎng)液,搖勻瓶底細(xì)胞液后進(jìn)行培 養(yǎng)。

    優(yōu)點(diǎn):結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,投資少,技術(shù)成熟、重復(fù)性好、放大只需簡(jiǎn)單地增加轉(zhuǎn)瓶數(shù)量。

    缺點(diǎn):勞動(dòng)強(qiáng)度大,占地空間大,單位體積提供細(xì)胞生長(zhǎng)的表面積小、細(xì)胞生長(zhǎng)密度低,培養(yǎng)時(shí)監(jiān)測(cè)和監(jiān)控環(huán)境條件受限制[2]。

    (3)細(xì)胞培養(yǎng)

    我國(guó)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方式大多采用微載體培養(yǎng),微載體培養(yǎng)就是加入微載體,使其懸浮在生長(zhǎng)液中,這樣不能懸浮的細(xì)胞就可以貼附在微載體表面上進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖。這種培養(yǎng)方式兼顧了單層培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn),通常分為連續(xù)灌流和流加培養(yǎng)。

    灌流培養(yǎng),在細(xì)胞培養(yǎng)過程中,不斷向培養(yǎng)器灌流培養(yǎng)液,同時(shí)以相同流量流出。灌流工藝的優(yōu)點(diǎn)是維持較低的培養(yǎng)液濃度,有利于目標(biāo)產(chǎn)品的形成,同時(shí)不斷流出的培養(yǎng)液可以帶出細(xì)胞碎片和副產(chǎn)物,降低細(xì)胞代謝釋放的各種酶類,提高設(shè)備利用率和單位時(shí)間產(chǎn)量。

    流加培養(yǎng),在細(xì)胞培養(yǎng)過程中,采用攪拌式系統(tǒng)連續(xù)懸浮培養(yǎng)。細(xì)胞接種的培養(yǎng)基料液體積一般為終體積的1/2 左右,過程中根據(jù)細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗情況和需求量往培養(yǎng)器中流加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或培養(yǎng)液,補(bǔ)充碳源、氮源、微量元素等,促進(jìn)細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng),提高目標(biāo)產(chǎn)品的收率和品質(zhì)。

    (4)單抗發(fā)酵液分離工藝

    細(xì)胞收獲液的澄清是生物制藥中開啟下游工藝的第一步,為下游純化提供無雜質(zhì)的料液,生物制品的有效成分多為蛋白質(zhì)和多糖等生物活性大分子,因此,在生產(chǎn)中常用的分離方法主要有細(xì)胞破碎技術(shù)、沉淀技術(shù)、離心技術(shù)、過濾技術(shù)和色譜分離技術(shù),通常采用溫和的多階式逐級(jí)分離的方式。如果只采用一種過濾技術(shù),通常會(huì)選用兩級(jí)過濾:首先使用孔徑較大的過濾介質(zhì)去除細(xì)胞或者細(xì)胞碎片;接著使用孔徑緊密的過濾介質(zhì)去除膠體雜質(zhì)。對(duì)于高密度細(xì)胞收獲液,可以選擇絮凝法配合深層過濾。避免下游層析純化柱過早堵塞,降低生物負(fù)載,澄清工藝最后會(huì)配合0.45 μm、0.2 μm 的終端除菌過濾。

    (5)單抗下游純化

    單克隆抗體藥品生產(chǎn)通常包含四個(gè)模塊:上游培養(yǎng)(Upstrem process)、下游純化(Downstrem process)、分析質(zhì)控(Analysis)和制劑(Formulation)[3]。下游就是純化,下游從上游拿到細(xì)胞培養(yǎng)澄清液后,進(jìn)行純化生產(chǎn)得到藥物原液。

    下游純化工藝依靠三種層析柱和兩種濾膜。三種層析柱一般指rProtein A( recombinant protein A)親和層析柱、陽離子交換層析柱(cation exchange chromatography,CEX)和陰離子交換層析柱(anion exchange chromatography,AEX)。兩種濾膜是指除病毒納濾膜(viral filter)和超濾膜(ultrafiltration/diafiltration,UF/DF)。

    (6)病毒的去除

    單抗生產(chǎn)工藝中一般最有效的病毒去除/滅活方法有:低pH 值(pH 值=3.2 保持30~60 min)、加熱(55~65℃保持1 h)、S/D(溶劑/去污劑)、膜過濾(如納濾)等。在抗體工藝流程設(shè)計(jì)中,典型的設(shè)計(jì)是在Protien A 親和層析后加上病毒滅活工藝。將親和層析后的合并洗脫液進(jìn)行低pH 孵育,用強(qiáng)酸緩沖液將洗脫液pH 值調(diào)低(pH 值=3.2 保持30~60 min),然后再迅速用強(qiáng)堿緩沖液將PH 值調(diào)至5.5,以利于下一步精純。盡量縮短蛋白質(zhì)在低pH 值環(huán)境中暴露的時(shí)間。(也有采用磷酸鹽緩沖液代替強(qiáng)酸/強(qiáng)堿HCL/NaOH 進(jìn)行pH 調(diào)節(jié)的,但該方法的缺點(diǎn)是會(huì)導(dǎo)致下一步精純的工藝體積變大,可能會(huì)考慮增加超濾濃縮工藝,使用的較少;而強(qiáng)酸強(qiáng)堿可能會(huì)在過程中增加蛋白沉淀的風(fēng)險(xiǎn))。

    低pH 孵育宜采用一次性混合系統(tǒng)(50~1 000 L),具有低剪切力混合攪拌、在線pH 值檢測(cè)、無需配備CIPSIP,有利于質(zhì)量保證和驗(yàn)證,一個(gè)驅(qū)動(dòng)單元可配合多個(gè)一次性混合系統(tǒng),大大減低固定設(shè)備投資成本,節(jié)約能源。而用于發(fā)酵液純化的親和層析、離子交換層析也具有一定的去病毒能力。單抗工藝中可采用納濾膜過濾作為清除病毒的最終步驟,然后再經(jīng)除菌過濾得到單抗原液(免疫球蛋白)。

    4 工程實(shí)例

    根據(jù)單抗原液生產(chǎn)的特點(diǎn)以及工程設(shè)計(jì)要點(diǎn),結(jié)合工程實(shí)例對(duì)車間的平面設(shè)計(jì)和空調(diào)凈化系統(tǒng)進(jìn)行描述和分析。圖3 為某單抗原液車間的平面圖。

    圖3 單抗原液車間平面圖Fig.3 Monoclonal antibody stock solutionworkshop plane layout

    4.1 平面設(shè)計(jì)

    單抗原液生產(chǎn)車間需要依據(jù)生產(chǎn)工藝和制備流程進(jìn)行設(shè)計(jì)分區(qū),分為上游區(qū)和下游區(qū)兩個(gè)主要的生產(chǎn)區(qū)域。上游區(qū):細(xì)胞復(fù)蘇、細(xì)胞擴(kuò)增、細(xì)胞培養(yǎng)、收獲;下游區(qū):原液純化、超濾和過濾除病毒。根據(jù)生產(chǎn)需要,還需設(shè)置兩個(gè)輔助功能區(qū):培養(yǎng)基配制區(qū)和儲(chǔ)存區(qū)、緩沖液配制和儲(chǔ)存區(qū)。設(shè)置人員進(jìn)入通道和退出通道分開,避免人員退出時(shí)對(duì)清潔區(qū)域造成污染,車間生產(chǎn)人員通過人凈更衣設(shè)施進(jìn)入生產(chǎn)凈化區(qū),并通過供應(yīng)側(cè)走廊進(jìn)入各個(gè)功能間[3]。設(shè)置潔凈物料、非潔凈物料的進(jìn)入口,原輔料通過物流通道和氣鎖進(jìn)入生產(chǎn)凈化區(qū)。上游區(qū)和下游區(qū)使用過的器具和產(chǎn)生的廢棄物通過廢棄物處理走廊進(jìn)入清洗區(qū)進(jìn)行清洗滅菌。設(shè)立獨(dú)立的廢棄物出口,保證廢棄物不會(huì)對(duì)生產(chǎn)凈化區(qū)造成二次污染。

    平面布局堅(jiān)持單向流原則,將車間分為供應(yīng)側(cè)和廢棄物處理走廊。按照人流和物流單向流的理念進(jìn)行整體空間布局,降低微生物污染的風(fēng)險(xiǎn),有效地控制生物負(fù)載和病毒污染。

    4.2 空調(diào)凈化系統(tǒng)

    空調(diào)系統(tǒng)依據(jù)生產(chǎn)區(qū)和準(zhǔn)備區(qū)的分區(qū)原則進(jìn)行分區(qū),防止交叉污染。作為輔助崗位,培養(yǎng)基配制和緩沖液配制兩個(gè)區(qū)域與上下游生產(chǎn)區(qū)相對(duì)獨(dú)立。人凈設(shè)施和供應(yīng)側(cè)走廊、細(xì)胞庫、上游區(qū)、下游區(qū)以及廢棄物處理走廊等分別設(shè)立獨(dú)立的空調(diào)系統(tǒng)。下游區(qū)里純化工藝、原液的超濾和除病毒過濾均設(shè)置在一個(gè)空調(diào)分區(qū)內(nèi)。

    根據(jù)GMP 要求,上游區(qū)和下游區(qū)的潔凈等級(jí)均為C 級(jí)??紤]到單抗產(chǎn)品的工藝特性和產(chǎn)品附加值等因素,空調(diào)系統(tǒng)選擇雙機(jī)熱備的形式確保原液的生產(chǎn)環(huán)境。凈化空調(diào)系統(tǒng)在送風(fēng)系統(tǒng)的終端設(shè)置HEPA,采用定送變排的空調(diào)模式。換氣次數(shù)不低于40 次/h??刂茐翰钐荻?,確保氣流從低污染風(fēng)險(xiǎn)區(qū)向高污染風(fēng)險(xiǎn)區(qū)流動(dòng),即從上游區(qū)流向下游區(qū)。病毒去除和滅活間等污染程度高的房間要保持相對(duì)負(fù)壓狀態(tài)。

    生產(chǎn)車間凈化空調(diào)系統(tǒng)采用定風(fēng)量定新風(fēng)比一次回風(fēng)系統(tǒng)??諝饨?jīng)過初效、中效、高效過濾器三級(jí)過濾送至房間。監(jiān)測(cè)潔凈區(qū)相關(guān)的關(guān)鍵環(huán)境參數(shù),如溫濕度、壓差、風(fēng)速等。當(dāng)環(huán)境溫濕度、壓差超過設(shè)定范圍時(shí),系統(tǒng)聲光報(bào)警和記錄,同時(shí)系統(tǒng)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸檔[4]。潔凈區(qū)各房間合理確定壓差梯度,氣流從清潔走廊流向污物走廊。

    5 單抗原液純化工藝所需設(shè)備的選擇

    5.1 離心機(jī)

    離心機(jī)是利用離心機(jī)轉(zhuǎn)子高速旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生強(qiáng)大的離心力,迫使液體中的懸浮微粒克服擴(kuò)散作用而加快其沉降速度。這里的懸浮微粒往往是指懸浮狀態(tài)的細(xì)胞、細(xì)胞器、病毒和生物大分子等。

    工業(yè)上大多應(yīng)用Disk-stack 離心去除細(xì)胞及其碎片。Disk-stack 離心可以連續(xù)離心,提高處理量,縮短處理時(shí)間。在離心工藝開發(fā)過程中,有很多參數(shù)需要優(yōu)化,如補(bǔ)料的速度、離心機(jī)轉(zhuǎn)速、濾餅層的去除頻率等,這些參數(shù)會(huì)影響到細(xì)胞的穩(wěn)定性、處理的時(shí)間以及抗體收率等。可用通過優(yōu)化這些參數(shù),合理地使各種訴求達(dá)到平衡。

    5.2 過濾器

    利用多孔物質(zhì)作為介質(zhì),借助過濾介質(zhì)的篩分性質(zhì),且一般介質(zhì)表面都在外力的作用下,通過介質(zhì)孔道對(duì)不同的組分進(jìn)行分離、提純、富集的技術(shù)。相對(duì)其他的分離技術(shù),過濾分離技術(shù)應(yīng)用廣泛,工藝簡(jiǎn)單,高效節(jié)能。當(dāng)原液中顆粒含量高時(shí),往往選擇深層過濾。深層過濾介質(zhì)一般由纖維素或聚丙烯纖維柱床、過濾介質(zhì)(如硅藻土)和粘合劑(用于制作平整的界面)組成。由于離心不能完全去除細(xì)胞及其碎片,而切向流成本太高,所以深層過濾通常被用于離心之后,也可以單獨(dú)用于細(xì)胞發(fā)酵液的澄清。由于深層過濾介質(zhì)的孔徑并不均一,所以在深層過濾之后會(huì)緊接一個(gè)除菌過濾工藝,以利于色譜柱的純化。

    5.3 樹脂柱

    親和層析柱rProtein A、陽離子交換層析柱(CEX)、陰離子交換層析柱(AEX)。

    第一根層析柱是親和層析柱rProtein A,生物大分子的層析方法主要分為親和,離子交換,疏水作用及體積排阻。親和層析是利用介質(zhì)上的配基與目標(biāo)蛋白分子有特異性結(jié)合,而對(duì)其他的蛋白質(zhì)及雜質(zhì)不吸附,因此雜質(zhì)從層析柱中流出,被吸附的目標(biāo)生物分子通過改變洗脫液的條件使被分離物質(zhì)與配基解吸附,即可達(dá)到分離純化的目的。它可以去除90%以上的HCP 和DNA,甚至一步就可以獲得抗體純度大于98%,而且在回收率上也有明顯優(yōu)勢(shì),親和捕獲回收率可達(dá)95%。

    第二根柱是陽離子交換層析柱(CEX)[5]。在抗體純化工藝中,CEX 一般使用吸附模式。陽離子交換可以去除HCP、親和層析柱脫落的物質(zhì)以及部分高分子量的聚體等雜質(zhì)。通常陽離子交換層析柱不承擔(dān)去病毒任務(wù),卻可以輔助去除病毒。

    第三根柱就是陰離子交換層析柱(AEX)。陰離子交換在抗體純化工藝中可以去除脫氧核糖核酸、病毒和內(nèi)毒素、親和層析過程中的脫落物質(zhì)、部分聚體以及酸性的HCP,為原液的進(jìn)一步純化建立保障。

    5.4 濾膜

    除病毒納濾膜(Viral Filter)和超濾膜(Ultrafiltration/Diafiltration,UF/DF)。

    6 結(jié)束語

    單抗原液作為生物制品的中間產(chǎn)品,對(duì)車間的設(shè)計(jì)要求較高。本文基于對(duì)單抗原液生產(chǎn)工藝的研究,綜合考慮其生產(chǎn)過程中的生物安全性、工藝特點(diǎn)以及人物流組織,提出單向流的設(shè)計(jì)理念和工藝設(shè)計(jì)要點(diǎn)來和大家共同探討單抗原液車間的設(shè)計(jì)。

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