畜禽源耐黏菌素大腸埃希氏菌的分離鑒定與特性分析

王 瑩，盧葛錦，景 潔，祝令偉，關(guān)佳瑤，鄭 林，孫詩雯，劉銘威，紀(jì) 雪，郭學(xué)軍

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院長春獸醫(yī)研究所，吉林長春 130122)

黏菌素(又稱多黏菌素E)是陽離子多肽家族抗生素的成員之一，黏菌素作為甲烷磺酸黏桿菌素上市已有50余年的歷史[1]。黏菌素通過與革蘭氏陰性菌細(xì)胞外膜脂多糖相互作用，破壞細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致細(xì)菌死亡或者抑制細(xì)菌生長，因此黏菌素是最早對革蘭氏陰性菌具有顯著殺滅活性的抗生素之一[2]。但是由于黏菌素具有神經(jīng)毒性和腎毒性等副作用，從20世紀(jì)80年代開始，已經(jīng)逐漸被低毒性的新型抗生素取代，只在畜牧養(yǎng)殖中用于預(yù)防和治療畜禽胃腸道疾病以及促進(jìn)動物生長。近年來，隨著多重耐藥革蘭氏陰性菌的增多，尤其是耐碳青霉烯腸桿菌的出現(xiàn)，使人畜面臨“無藥可用”的威脅，黏菌素作為治療多重耐藥革蘭氏陰性菌感染的 “最后一道防線”顯得尤為重要[3]。

黏菌素作為動物飼料添加劑已被廣泛使用了半個多世紀(jì)，人們一直認(rèn)為黏菌素耐藥是固有耐藥，無法水平傳遞，直到2015年在中國的養(yǎng)殖場首次發(fā)現(xiàn)了攜帶可移動黏菌素耐藥性基因mcr-1質(zhì)粒的大腸埃希氏菌，隨后對人和多種動物的樣品研究發(fā)現(xiàn)，多種質(zhì)粒都可以攜帶mcr-1基因，而且這些質(zhì)?？梢栽诓煌N的細(xì)菌中進(jìn)行水平傳遞[4]。在發(fā)現(xiàn)mcr-1之后的4年內(nèi)，全球50多個國家和地區(qū)的動物、肉類產(chǎn)品、人類(包括糞便攜帶和感染)和環(huán)境中都報告了mcr-1基因陽性細(xì)菌[5-6]。mcr-1基因在人和動物中的廣泛傳播引起了關(guān)于黏菌素使用政策的全球討論[7]。2016年，歐洲藥品管理局(European medicines agency)將黏菌素耐藥性的風(fēng)險水平從低更新為高[8]。2017年4月30日起，根據(jù)中國農(nóng)業(yè)部2 428號公告，中國大陸地區(qū)禁止使用硫酸黏菌素預(yù)混料作為動物生長促進(jìn)劑[9]。

盡管制定了限制黏菌素在農(nóng)業(yè)中的使用的政策，但其后續(xù)效果還需要進(jìn)行評價。本試驗通過對吉林省長春市3 個畜禽養(yǎng)殖場在2017年和2020年兩個時間點所采集的樣品進(jìn)行耐黏菌素大腸埃希氏菌的分離與鑒定，對分離到的耐黏菌素大腸埃希氏菌進(jìn)行了16 種常用藥物的敏感性測定，并對mcr基因陽性菌株進(jìn)行篩選以及對其所攜帶的復(fù)制子進(jìn)行分型鑒定，以期評估政策施行及產(chǎn)生的影響，并了解耐黏菌素大腸埃希氏菌的耐藥性，以及質(zhì)粒復(fù)制子攜帶情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 2017年5月和2020年12月在長春3 個畜禽養(yǎng)殖場采集373 份糞便樣品，具體見表1。

表1 糞便樣品采集信息

1.1.2 試劑 ECC顯色培養(yǎng)基，法國科瑪嘉公司產(chǎn)品；腦心液體培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，青島高海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；ID肉湯、細(xì)菌鑒定卡、AST肉湯和AST指示劑，美國BD公司產(chǎn)品；瓊脂糖，美國Genview公司產(chǎn)品；DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL 2000，美國TaKaRa公司產(chǎn)品；PBRT 2.0 kit試劑盒，意大利Diatheva生物技術(shù)公司產(chǎn)品。引物均由吉林庫美生物科技公司合成。

1.1.3 儀器 生物安全柜(1300A2)，美國Thermo公司產(chǎn)品；全自動微生物生化鑒定/藥敏系統(tǒng)(BDPhoenixTM-100)、比濁儀(PhoenixSpecTM)，美國BD公司產(chǎn)品；PCR擴(kuò)增儀(ETC-811)，北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司產(chǎn)品；生化培養(yǎng)箱(LRH-70)，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)與純化 將糞便樣品置于4 mL離心管中，并加入2 mL生理鹽水，室溫振蕩10 min后靜置3 min，上清液即為樣品原液。無菌條件下吸取20 μL原液接種于含黏菌素(2 mg/L)的ECC顯色培養(yǎng)基上，37℃恒溫倒置培養(yǎng)16 h。在ECC顯色培養(yǎng)基上挑取藍(lán)色且邊緣光滑的單菌落，劃線接種于黏菌素抗性(2 mg/L)麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，37℃恒溫倒置培養(yǎng)16 h后，在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上挑取1個～5個紅色且邊緣光滑的單菌落，劃線接種于黏菌素抗性(2 mg/L)麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，37℃恒溫倒置培養(yǎng)16 h，進(jìn)行第2次純化。

1.2.2 細(xì)菌的PCR鑒定 將純化好的疑似菌株接種于腦心液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)16 h后，吸取200 μL菌液，12 000 r/min離心2 min，棄去上清，加入50 μL去離子水重懸，95℃加熱7 min,12 000 r/min離心1 min，上清即為模板。按參考文獻(xiàn)[10]合成大腸埃希氏菌特異性引物16S rDNA，引物序列見表2，對分離菌株進(jìn)行鑒定。利用ERIC-PCR進(jìn)行指紋圖譜的鑒定[11]，去除指紋一致的克隆株，引物序列見表2。

表2 試驗所需引物

1.2.3 黏菌素最低抑菌濃度測定 按照2017年美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(Clinical and laboratory standards institute，CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法檢測分離菌株對黏菌素的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration ，MIC)。黏菌素濃度設(shè)置為16、8、4、2、1、0.5、0.25 mg/L，每株菌設(shè)置3組重復(fù)，以標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922作為質(zhì)控菌株，結(jié)果判讀：以孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度為菌株的MIC值。

1.2.4 藥物敏感性測定 將分離的菌株接種于腦心瓊脂培養(yǎng)基，37℃倒置培養(yǎng)16 h。使用無菌長棉簽蘸取幾個單菌落于ID肉湯中，將菌液調(diào)至0.5～0.6麥?zhǔn)媳葷岫确秶鷥?nèi)，向AST肉湯垂直滴加46 μL AST指示劑，上下緩慢顛倒混勻，加入菌液25 μL，再次上下緩慢顛倒混勻，將肉湯緩緩倒入鑒定卡內(nèi)，把鑒定卡放置于全自動微生物生化鑒定/藥敏系統(tǒng)內(nèi)對菌株進(jìn)行敏感性檢測，根據(jù)全自動微生物生化鑒定/藥敏系統(tǒng)檢測出的結(jié)果對菌株的敏感性進(jìn)行判斷。

1.2.5 耐藥基因mcr的檢測 多重PCR法檢測分離菌株中mcr-1、mcr-2、mcr-3、mcr-4和mcr-5耐藥基因，引物序列[12]見表2，篩選出攜帶mcr耐藥基因的菌株。

1.2.6 質(zhì)粒復(fù)制子基因分型 利用質(zhì)粒復(fù)制子分型試劑盒(PBRT 2.0 kit)確定mcr基因陽性菌株中的質(zhì)粒類型[13]，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在25 g/L瓊脂糖凝膠中于110 V電泳60 min進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 耐黏菌素大腸埃希氏菌的分離鑒定

通過黏菌素抗性ECC顯色培養(yǎng)基篩選和麥康凱顯色培養(yǎng)基純化，大腸埃希氏菌16S rDNA PCR特異性方法進(jìn)行分離鑒定(圖1)，從373份糞便樣品中獲得耐黏菌素(2 mg/L)大腸埃希氏菌分離株929株。經(jīng)ERIC-PCR指紋圖譜鑒定(圖2)，去除克隆株383株，最終獲得耐黏菌素大腸埃希氏菌546株，其中141株耐黏菌素大腸埃希氏菌分離自2017年樣品，405株耐黏菌素大腸埃希氏菌分離自2020年樣品。

M.DL 2 000 DNA Marker；-.陰性對照；+.陽性對照；1～3.樣品分離株16S rDNA PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物

M.DL 2 000 DNA Marker；1～17.大腸埃希氏菌分離菌株ERIC-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物M.DNA Marker DL 2 000;1-17.ERIC-PCR amplification products of Escherichia coli isolates

2.2 黏菌素最低抑菌濃度

546株耐黏菌素大腸埃希氏菌對黏菌素的MIC的范圍為0.25 mg/L～8 mg/L，其中，2017年141株菌的MIC在2 mg/L～8 mg/L范圍內(nèi)有37株，占比26.24%， MIC在0.25mg/L～1mg/L范圍內(nèi)有104株，占比73.76%；2020年405 株菌的MIC在2 mg/L～8 mg/L范圍 內(nèi)有73 株，占比18.02%， MIC在0.25 mg/L～1 mg/L范圍 內(nèi)有332 株，占比81.98%(表3)。

表3 黏菌素最低抑菌濃度測定結(jié)果

2.3 藥物敏感性試驗結(jié)果

2017年141株耐黏菌素大腸埃希氏菌中，四環(huán)素耐藥率最高為98.58%，其次氨芐西林、氯霉素、哌拉西林、環(huán)丙沙星、莫西沙星和左氧氟沙星耐藥率在48%～80%之間，大多數(shù)菌株對頭孢他啶、阿米卡星、亞胺培南和美洛培南敏感；2020年405 株耐黏菌素大腸埃希氏菌中，氯霉素耐藥率最高為68.15%，略高于四環(huán)素、氨芐西林和哌拉西林耐藥率，大多數(shù)菌株對頭孢他啶、阿米卡星、亞胺培南和美洛培南敏感(表4)。

表4 耐黏菌素大腸埃希氏菌對16種抗菌藥物敏感性結(jié)果

2.4 耐藥譜分析

對546株耐黏菌素大腸埃希氏菌分離株耐受的抗生素種類及其對應(yīng)的耐藥菌株數(shù)、百分比進(jìn)行統(tǒng)計和分析，結(jié)果見表5。2017年分離菌株耐受的抗生素種類有0～12種，僅有3株菌株對所有抗生素全部敏感，以耐受4種抗生素占比最高；2020年分離菌株耐受的抗生素種類有0～13種，有19株菌株對所有抗生素全部敏感，以耐受4種抗生素菌株占比最高。

表5 耐黏菌素大腸埃希氏菌耐受的抗菌藥物種類占比統(tǒng)計

進(jìn)行耐藥性檢測的抗生素有5類，包括氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類、酰胺醇類、氟喹諾酮類和四環(huán)素類。根據(jù)多重耐藥菌的定義，一般定義對3類及3類以上抗生素耐藥的細(xì)菌為多重耐藥菌。2017年菌株中，多重耐藥菌為114株(80.85%，114/141)，其中對3類抗生素耐藥的菌株最多，為58株(41.13%，58/141)，對所檢測的四類抗生素耐藥的有36株(25.53%，36/141)，對所檢測的5類抗生素全部耐藥的有20株(14.18%，20/141)；2020年菌株中，多重耐藥菌為244株(60.25%，244/405)，其中對3類抗生素耐藥的菌株最多，為143株(35.31%，143/405)，對所檢測的四類抗生素耐藥的有71株(17.53%，71/405)，對所檢測的5類抗生素全部耐藥的有30株(7.41%，30/405)。

2.5 mcr基因陽性耐黏菌素大腸埃希氏菌的檢出率統(tǒng)計

在546 株耐黏菌素大腸埃希氏菌中檢測出34株攜帶mcr-1基因的耐黏菌素大腸埃希氏菌(圖3)，未檢測出mcr-2、mcr-3、mcr-4和mcr-5基因。其中2017年141株檢測出攜帶mcr-1基因耐黏菌素大腸埃希氏菌21株，檢出率為14.89%；2020年405株檢測出攜帶mcr-1基因耐黏菌素大腸埃希氏菌13株，檢出率為3.21%。

M.DL 2 000 DNA Marker；-.陰性對照；+.陽性對照；1～3.樣品分離株mcr-1基因擴(kuò)增產(chǎn)物

2.6 質(zhì)粒復(fù)制子分型結(jié)果

通過PBRT試劑盒對34株mcr-1基因陽性耐黏菌素大腸埃希氏菌進(jìn)行常見質(zhì)粒復(fù)制子的分型，共鑒定出12種質(zhì)粒復(fù)制子的類型(表6)。2017年21株mcr-1陽性大腸埃希氏菌共檢出11種質(zhì)粒，各種質(zhì)粒的檢出率分別為IncFII為80.95%(17/21)、IncHI2為66.67%(14/21)、IncFIB為52.38%(11/21)、IncX1為38.09%(8/21)、IncX4為28.57%(6/21)、IncFIIK為28.57%(6/21)、IncI2為23.81%(5/21)、IncFIA為14.29%(3/21)、IncI1α為14.29%(3/21)、IncA/C為9.52%(2/21)、IncB/O為9.52%(2/21) 。2020年13株mcr-1基因陽性耐黏菌素大腸埃希氏菌共檢出7種質(zhì)粒，各種質(zhì)粒的檢出率分別為IncFII為92.31%(12/13)、IncFIB為92.31%(12/13)、IncX1為53.85%(7/13)、IncHI2為46.15%(6/13)、IncI2為38.46%(5/13)、IncX4為7.69%(1/13)、IncI1γ為7.69%(1/13)。

表6 34株mcr-1陽性大腸埃希氏菌質(zhì)粒復(fù)制子類型

3 討論

大腸埃希氏菌是耐藥基因的天然儲存庫，其可以通過性菌毛將攜帶的耐藥基因質(zhì)粒傳遞給其他細(xì)菌，包括非同屬同科細(xì)菌，并在受體菌中發(fā)生進(jìn)一步的重組和變異，造成耐藥基因的水平擴(kuò)散和多重耐藥性的產(chǎn)生，從而將耐藥基因傳播至其他腸桿菌科細(xì)菌或其他病原菌中。黏菌素類抗生素曾是規(guī)?；笄蒺B(yǎng)殖場防治腸桿菌科細(xì)菌感染的重要抗生素之一，在規(guī)?；B(yǎng)殖過程中，由于抗生素的過度使用，造成了多重耐藥以及超級耐藥細(xì)菌的泛濫，近年來細(xì)菌的耐藥情況日益嚴(yán)峻[14-17]。

本試驗中，從檢出的546株耐黏菌素大腸埃希氏菌的耐藥水平(0.25 mg/L≤MIC≤8 mg/L)來看，吉林省長春市內(nèi)的黏菌素耐藥情況尚處于中度水平，共有110株大腸埃希氏菌MIC≥2 mg/L，2020年MIC≥2 mg/L菌株分離率(18.02%，73/405)低于2017年MIC≥2 mg/L菌株分離率(26.24%，37/141)，表明黏菌素禁用政策降低了黏菌素耐藥菌株的分離率。其中34 株mcr-1陽性大腸埃希氏菌的MIC值在4 mg/L～8 mg/L之間，證實攜帶mcr-1基因可以使大腸埃希氏菌對黏菌素產(chǎn)生耐藥，此外沒有攜帶任何已知mcr基因的76株黏菌素耐藥大腸埃希氏菌應(yīng)有其他耐藥機(jī)制導(dǎo)致其對黏菌素耐藥，如pmrA/pmrB雙組分系統(tǒng)突變[19]、新的mcr基因或變體[20]，或者其他未知的機(jī)制。另外，有146株耐黏菌素大腸埃希氏菌MIC值略小，導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因可能有幾種，由于黏菌素的陽離子性質(zhì)、大分子結(jié)構(gòu)在瓊脂中擴(kuò)散不良、藥粉成分以及其異質(zhì)耐藥性，另外傳代培養(yǎng)和儲存后都可能會喪失大腸埃希氏菌的黏菌素抗性[21]。

在16種藥物的藥敏結(jié)果中，除了氯霉素和頭孢噻肟2種抗菌藥物之外， 2020年菌株的其他抗菌藥物的耐藥率比2017年的耐藥率均有所下降，多重耐藥菌株占比也有所降低，但長春地區(qū)分離的耐黏菌素大腸埃希氏菌對四環(huán)素耐藥率一直較高，應(yīng)給予足夠的重視，大多數(shù)菌株對氨芐西林、氯霉素和哌拉西林的耐藥率依然達(dá)到60%以上，有8.64%的菌株耐抗生素的種類超過了10種，多重耐藥菌占比仍達(dá)到60%以上，且耐藥譜較廣。鑒于以上結(jié)果，消除細(xì)菌耐藥性的任務(wù)還任重道遠(yuǎn)，建議經(jīng)常開展菌株的藥敏檢測，并依據(jù)藥敏結(jié)果選擇合適的抗生素以及使用合理的劑量。

本試驗共檢出34 株含mcr-1基因的菌株，其中2020年耐黏菌素大腸埃希氏菌mcr-1檢出率(3.23%，13/405)低于2017年耐黏菌素大腸埃希氏菌mcr-1檢出率(14.89%，21/141)，低于2016年本實驗室中韓一嘯等[10]報道的吉林省長春市豬源大腸埃希氏菌mcr-1的檢出率(100%)，低于2019年孫赫等[18]報道的吉林省動物源樣本mcr-1的檢出率(8.65%)，并且在為了評估中國禁用黏菌素政策變化的影響，沈建忠等[8]調(diào)查了2015年至2018年中國大陸硫酸黏菌素預(yù)混料的生產(chǎn)情況，硫酸黏桿菌素預(yù)混料的產(chǎn)量每年都在下降，從2015年的27 170 t下降到2018年的2 497 t，下降幅度最大的是2016年至2017年(24 563 t至5 112 t)，預(yù)混料活性成分黏菌素的相應(yīng)產(chǎn)量從2015年的2 736 t降至2018年的234 t， 結(jié)果表明我國農(nóng)業(yè)部提出的禁止黏菌素在養(yǎng)殖場作為飼料添加劑使用的政策施行是有效的，并對降低mcr-1流行率產(chǎn)生很大的影響，但是持續(xù)的黏菌素監(jiān)測是必要的，特別是作為黏菌素管理的早期預(yù)警系統(tǒng)。

本試驗在2017年21株mcr-1基因陽性耐黏菌素大腸埃希氏菌中共檢測到12種類型質(zhì)粒，以IncFII為主，為80.95%；在2020年13株mcr-1基因陽性耐黏菌素大腸埃希氏菌中共檢測到7種類型質(zhì)粒，以IncFII和IncFIB為主，均為92.31%。結(jié)果表明，2020年菌株攜帶質(zhì)粒復(fù)制子類型雖少于2017年，但每株菌都至少攜帶兩種類型質(zhì)粒復(fù)制子，可見其所攜帶質(zhì)粒復(fù)制子的多樣性。2020年與2017年相比，IncI2型質(zhì)粒的檢出率有所增加，IncI2質(zhì)粒在攜帶mcr基因的相同的移動元件上還攜帶其他耐藥基因，如blaCTX-M，并且質(zhì)?？梢酝ㄟ^使用阿莫西林等β-內(nèi)酰胺類抗生素(目前仍廣泛用于動物)進(jìn)行廣泛傳播[22]。質(zhì)粒也是基因水平轉(zhuǎn)移(horizontal gene transfer，HGT)的重要媒介，由于它們在HGT中的作用，特別是在抗菌耐藥性的出現(xiàn)和傳播方面，細(xì)菌質(zhì)粒的鑒定和分類受到了廣泛關(guān)注，質(zhì)粒復(fù)制子分型試驗可提供有關(guān)抗生素耐藥質(zhì)粒家族在不同環(huán)境下在腸桿菌科中傳播的進(jìn)一步信息。

綜上所述，雖然我國已經(jīng)在禽畜飼養(yǎng)過程中限制使用黏菌素類抗菌藥物，mcr-1基因陽性大腸埃希氏菌檢出率以及耐黏菌素大腸埃希氏菌的分離率有所降低，但吉林省長春市畜禽源耐黏菌素大腸埃希氏菌多重耐藥情況嚴(yán)重，質(zhì)粒類型復(fù)雜多樣，并且由于畜禽源耐黏菌素大腸埃希氏菌的耐藥基因可能會通過直接接觸食物和水等方式直接或間接傳播給人類，對于黏菌素耐藥菌的潛在危害性仍然不容小覷，應(yīng)當(dāng)對畜牧養(yǎng)殖業(yè)做定期監(jiān)測，正確使用抗生素藥物及用量，避免多重耐藥大腸埃希氏菌的廣泛傳播，危害人類健康。