基于CYP1A2、CYP3A4酶活性的蒼耳子炮制減毒機制研究*

黃 成，周仁杰，黃保生,，韓燕全，朋湯義，金傳山，吳德玲

（1.安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院/國家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級實驗室，安徽 合肥 230031；2.安徽中醫(yī)藥大學/中藥復方安徽省重點實驗室/現(xiàn)代藥物制劑安徽省工程技術中心，安徽 合肥 230031）

蒼耳子為菊科植物蒼耳（Xanthium sibirium Patr.）的干燥成熟帶總苞果實，為治療鼻淵頭痛之要藥[1]，至今已有1 800多年藥用歷史。蒼耳子藥材資源豐富，臨床應用廣泛[2-3]。現(xiàn)代研究表明，蒼耳子具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗病毒、降血糖、降血脂、抗腫瘤等藥理作用[4-6]。2020年版《中華人民共和國藥典》一部記載蒼耳子“味辛、苦，性溫，有毒，歸肺經(jīng)”，須炒制去刺后使用[7]。文獻研究表明，蒼耳子對機體毒性影響最主要的部位是肝臟[8-9]。CYP450酶是肝臟中非常重要的Ⅰ相藥物代謝酶，其亞型CYP1A2和CYP3A4分別代謝40%～50%的臨床藥物，在藥物代謝中起到關鍵作用[10-12]，目前尚未見基于CYP450酶活性探討蒼耳子炮制減毒機理的研究。

本實驗通過構建小鼠肝微粒體孵育體系，以咖啡因和咪達唑侖分別作為CYP1A2、CYP3A4兩種酶的探針藥物，用HPLC檢測其消耗量，計算酶的相對活性，并結合血清生化指標檢測及病理切片觀察來確定肝損傷的程度，從而研究蒼耳子的炮制對此兩種CYP酶活性的影響，以及與肝損傷程度間的關系，以期為蒼耳子的炮制減毒機理研究及臨床安全用藥提供依據(jù)，同時為其他毒性藥材的研究提供思路。

1 材 料

1.1 實驗動物 SPF級昆明種雄性小鼠49只，體質量（20.0±2.0）g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0004。動物于12 h光照或黑夜循環(huán)環(huán)境中飼養(yǎng)，保持溫度為（23±2）℃，相對濕度為（50±5）%，自由攝水攝食，適應性飼養(yǎng)4 d后開始實驗。實驗過程符合動物實驗倫理規(guī)范要求。

1.2 儀器與試劑 Nexera XR LC-20AD XR型高效液相色譜儀，包括二元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、SPD檢測器和LabSolutions色譜工作站（日本SHIMADZU公司）；BP211D型電子天平（德國Sartorius公司）；3XZ21K型高速冷凍離心機（上海名元實業(yè)有限公司）。

蒼耳子生品（批號：1911160062，產(chǎn)地：山東）購自亳州市滬譙藥業(yè)有限公司，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學謝冬梅副教授鑒定為菊科植物蒼耳的干燥成熟帶總苞果實；咖啡因對照品（批號：DST200510-001）、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）（批號：DST200712-090）購自成都德思特生物技術有限公司；咪達唑侖注射液（批號：MD200304）購自江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司；地西泮注射液（批號：1902551）購自天津金耀藥業(yè)有限公司；甲醇、乙腈均為色譜級，購自SIGMA公司；蒸餾水購自屈臣氏公司。

蒼耳子炮制品制備：取潔凈的河砂置鍋內，武火加熱至滑利狀態(tài)，測定離鍋底1 cm左右處的溫度，待溫度穩(wěn)定至160 ℃時，投入蒼耳子炒制7 min，炒至表面微黃出鍋，放涼備用[13]。

2 方 法

2.1 蒼耳子水煎液制備 取蒼耳子生品、炮制品各150 g分別加10倍量的水浸泡30 min，武火煮沸后，文火繼續(xù)煎煮30 min，過濾后留存，藥渣加入8倍量水進行二次煎煮并過濾，合并濾液后濃縮至質量濃度為2 g/mL。

2.2 動物分組及給藥方法 將49只昆明小鼠按照體質量隨機分成正常組、蒼耳子生品低劑量組、蒼耳子生品中劑量組、蒼耳子生品高劑量組、蒼耳子炮制品低劑量組、蒼耳子炮制品中劑量組、蒼耳子炮制品高劑量組，每組7只。蒼耳子人用量為10.0 g/d，按照人與小鼠體質量進行劑量換算，蒼耳子生品和炮制品低劑量組（13.0 g/kg）、蒼耳子生品和炮制品中劑量組（26.0 g/kg）和蒼耳子生品和炮制品高劑量組（39.0 g/kg），分別相當于臨床人用劑量的10、20和30倍[14]。各給藥組小鼠按照0.2 mL/10 g體積灌胃生、炒蒼耳子水煎煮液，正常組小鼠灌胃等體積的生理鹽水，1次/d，連續(xù)10 d。實驗期間小鼠自由飲食。

2.3 溶液配制

2.3.1 Cooktail藥物探針 精密稱取10.600 mg咖啡因對照品，加入適量甲醇配制成濃度為9.0 mmol/L的咖啡因母液，按相同方法配制濃度為1.5 mmol/L的咪達唑侖母液，取兩種母液適量混合后配制成咖啡因濃度為15.0 μmol/L、咪達唑侖濃度為2.5 μmol/L的Cooktail混合液。

2.3.2 標準曲線工作液 在滅活過的肝微粒體孵育體系中，加入咖啡因母液適量使其濃度分別為3.0、6.0、12.0、18.0、24.0、30.0 μmol/L，加入咪達唑侖母液使其濃度分別為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μmol/L。

2.3.3 TMS緩沖溶液 稱取0.610 g三羥甲基氨基甲烷（Tris）、0.060 g MgCl2·6H2O、6.850 g蔗糖，混合后以超純水溶解至100 mL，加鹽酸調節(jié)pH值至7.4，4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.4 Tris-HCl溶液 將1 mol/L的Tris-HCl加入超純水分別稀釋成0.10、0.01 mol/L的Tris-HCl溶液。

2.3.5 NADPH溶液 精密稱取3.080 mg NADPH，加入適量的純水配制成50mmol/L的溶液，4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.6 含地西泮的反應終止液 取地西泮注射液（2 mg/mL）1 mL，加入適量甲醇配制成8 μg/mL的溶液，4 ℃儲存?zhèn)溆肹15]。

2.4 小鼠肝微粒體制備 第10天灌胃后禁食24 h，腹腔注射20%烏拉坦溶液麻醉，眼球取血，迅速打開腹腔取出肝臟，頸椎脫臼處死小鼠。用濾紙吸干肝臟表面血液，將肝臟置于下墊冰盒的表面皿中，用剪刀剪開后分別裝入EP管中，稱取1.5 g肝組織加入4倍量的TMS溶液，剪碎，勻漿機攪拌制備勻漿，放入高速冷凍離心機，4 ℃、15 000 r/min離心20 min，取上清液加入0.1 mL的68 mmol/L CaCl2溶液進行沉淀，4 ℃、20 000 r/min離心20 min，取沉淀物加0.1 mol/L的Tris-HCl 1 mL，渦旋1 min混勻，4 ℃、15 000 r/min離心20 min，得到的粉色沉淀即為肝微粒體，將其重新懸于1 mL的0.01 mol/L Tris-HCl中，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹16]。用BCA蛋白質量試劑盒測肝微粒體蛋白的濃度。

2.5 體外孵育 肝微粒體孵育體系總體積為500 μL，取肝微粒體懸液10 μL按照表1的步驟依次加入探針藥物和緩沖液，然后加入NADPH啟動反應，于37 ℃恒溫水浴中孵育30 min，最后加入預冷的地西泮終止液500 μL，12 000 r/min離心15 min，取上清液10 μL進樣分析。

表1 肝微粒體孵育體系加樣順序

2.6 色譜條件 色譜柱為島津Shim-pack GISP-HPLC18（2.1 mm×100 mm，3 μm）；流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫程序如表2所示，流速：0.4 mL/min；檢測波長：254 nm；進樣體積：10 μL；柱溫：30 ℃。

表2 HPLC 測定Cooktail 探針藥物及內標物的洗脫條件

2.7 觀察指標

2.7.1 血清天冬氨酸轉氨酶（AST）、丙氨酸轉氨酶（ALT）活性 取材后按照試劑盒說明書，用ELISA法檢測血清AST、ALT的活性。

2.7.2 肝臟組織病理學變化 將肝臟組織移至4%多聚甲醛溶液中，在固定24 h后，進行脫水和石蠟包埋，制成石蠟切片，隨后進行HE染色，在光學顯微鏡下觀察肝組織病理學變化。

2.7.3 CYP1A2、CYP3A4酶相對活性 通過測定樣品組探針藥物咖啡因和咪達唑侖的峰面積，將其與內標物地西泮的比值代入到標準曲線中，計算出兩種探針藥物在肝微粒體體系中的濃度，正常組的探針藥物濃度為總底物濃度，給藥組濃度為剩余濃度。CYP1A2和CYP3A4兩種酶的相對活性計算公式：酶相對活性=（總底物濃度-剩余濃度）/總底物濃度×100%。

2.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以“均數(shù)±標準差”（）表示，計量資料符合正態(tài)分布且方差齊，多組比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結 果

3.1 方法學驗證

3.1.1 線性關系考察 將兩種藥物的標準曲線工作液按“2.6”項方法進樣，以反應物濃度為橫坐標（X），反應物與底物的峰面積比值為縱坐標（Y）分別繪制標準曲線，得到回歸方程。咖啡因：Y=0.018 4X-0.000 7，r=0.999 9。咪達唑侖：Y=0.054 6X-0.000 3，r=0.999 8。表明在3～30 μmol/L和0.5～5 μmol/L內線性關系良好。

3.1.2 專屬性試驗 空白肝微粒體+內標物、探針藥物+內標物、孵育過的肝微粒體樣品（蒼耳子炮制品中劑量組3號）+內標物的HPLC色譜圖見圖1。在本實驗條件下，各藥物分離完全，無雜質峰干擾，咖啡因、咪達唑侖和地西泮的保留時間分別是4.298、8.988、9.557 min，專屬性良好。

3.1.3 精密度試驗 取10 μL小鼠肝微粒體，加入PBS緩沖液460 μL，60 ℃加熱使肝微粒體失活，冷卻至室溫，加入Cooktail探針藥物10 μL和NADPH 20 μL，按“2.6”項方法進樣，平行測量6次，計算日間精密度，測得咖啡因和咪達唑侖的RSD分別為0.45%和0.35%，符合試驗要求。

3.1.4 穩(wěn)定性試驗 取蒼耳子生品中劑量組4號樣品孵育，然后按照“2.6”項方法在0、2、4、6、12、24 h時分別進樣，結果咖啡因和咪達唑侖的RSD分別為0.63%和1.13%，說明樣品在24 h內基本穩(wěn)定。

3.1.5 重復性試驗 取蒼耳子生品中劑量組6號樣品進行孵育，按照“2.6”項方法連續(xù)進樣6次，咖啡因和咪達唑侖的RSD分別為0.55%和0.75%，符合試驗要求。

3.1.6 加樣回收率試驗 取不同的已知濃度樣品100 μL，加入探針藥物混合液100 μL，共制作6組，按照“2.6”項方法進樣，咖啡因和咪達唑侖的平均加樣回收率分別是102.6%和101.37%，RSD分別是1.60%和1.97%。（見表3）

表3 肝微粒體樣品中咖啡因和咪達唑侖加樣回收率試驗結果（n=6）

3.2 各組小鼠血清AST、ALT活性比較 蒼耳子生品中、高劑量組和蒼耳子炮制品高劑量組小鼠血清AST、ALT活性均高于正常組（P＜0.05或P＜0.01）；蒼耳子生品低劑量組、蒼耳子炮制品中劑量組小鼠血清ALT活性均高于正常組（P＜0.05）；同等劑量下，蒼耳子生品低、中、高劑量組小鼠血清AST、ALT活性均分別高于蒼耳子炮制品低、中、高劑量組，但差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。表明蒼耳子生品和炮制品均能造成小鼠肝損傷，炮制品造成的肝損傷較輕。

表4 各組小鼠血清AST、ALT 活性比較（，U/L）

表4 各組小鼠血清AST、ALT 活性比較（，U/L）

注：與正常組比較，aP＜0.05，bP＜0.01

3.3 各組小鼠肝組織病理變化情況 正常組小鼠肝臟細胞圍繞中央靜脈呈規(guī)則的放射狀排列，大小均勻，排列緊密，細胞核飽滿，結構形態(tài)正常；蒼耳子生品的低、中劑量組小鼠肝臟細胞出現(xiàn)細胞核萎縮現(xiàn)象，蒼耳子生品高劑量組小鼠肝臟細胞出現(xiàn)細胞核萎縮及四周空洞現(xiàn)象；蒼耳子炮制品低劑量組小鼠肝臟細胞形態(tài)基本正常，蒼耳子炮制品中、高劑量組小鼠肝臟細胞出現(xiàn)不同程度的細胞核萎縮及四周空洞現(xiàn)象。（見圖2）

3.4 各組小鼠肝臟微粒體中CYP1A2、CYP3A4活性比較 蒼耳子生品中、高劑量組和蒼耳子炮制品的中、高劑量組小鼠肝臟微粒體中CYP1A2活性均明顯高于正常組（P＜0.05或P＜0.01）；蒼耳子生品高劑量組和蒼耳子炮制品高劑量組小鼠肝臟微粒體中CYP3A4活性均明顯高于正常組（P＜0.05）；同等劑量下，蒼耳子生品低、中、高劑量組小鼠肝臟微粒體中CYP1A2、CYP3A4活性均分別高于蒼耳子炮制品低、中、高劑量組，但差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。表明蒼耳子能誘導這兩種酶的活性，并且炮制后能減輕對這兩種酶的誘導作用。

表5 各組小鼠肝臟微粒體中CYP1A2、CYP3A4相對活性比較（）

表5 各組小鼠肝臟微粒體中CYP1A2、CYP3A4相對活性比較（）

注：與正常組比較，aP＜0.05，bP＜0.01

4 討 論

蒼耳子在臨床上有著廣泛的應用，常用于治療風寒感冒、慢性鼻炎、過敏性鼻炎、皮膚病及風濕性關節(jié)炎等疾病[17]。蒼耳子生品有小毒，由于未經(jīng)炮制或者炮制不當導致的中毒事件時有發(fā)生。其毒性主要表現(xiàn)為對機體臟器的損害，其中對肝臟的損害尤為嚴重[18]。目前關于蒼耳子炮制減毒機理的研究主要集中在炮制前后毒、效成分的變化及對藥效的影響方面[19]，其具體的毒性機制需要進一步研究探討。肝臟是藥物代謝的主要器官，肝臟中CYP1A2、CYP3A4酶是較重要的兩種CYP450亞酶，從對肝藥代謝酶活性影響的角度進行研究有望從新視角探明蒼耳子的炮制減毒機理[20-21]。

本實驗建立了小鼠肝微粒體孵育體系，通過HPLC檢測CYP1A2、CYP3A4酶的特異性代謝物咖啡因、咪達唑侖在孵育過程中的消耗量來觀察不同給藥組酶的相對活性變化。本研究發(fā)現(xiàn)蒼耳子生品低、中、高劑量組和蒼耳子炮制品低、中、高劑量組對CYP1A2酶的誘導作用均高于正常組，且同劑量比較時，蒼耳子生品低、中、高劑量組對CYP3A4酶的誘導作用分別高于蒼耳子炮制品低、中、高劑量組；結合血清AST、ALT的檢測和肝臟HE染色病理切片觀察，本研究發(fā)現(xiàn)蒼耳子生品低、中、高劑量組的肝臟損傷情況分別較蒼耳子炮制品低、中、高劑量組更為嚴重，肝損傷嚴重程度和酶活性升高的趨勢基本一致。本實驗結果表明，相同劑量的蒼耳子生品對CYP1A2、CYP3A4酶的誘導作用高于蒼耳子炮制品，蒼耳子炮制后對CYP1A2、CYP3A4酶活性的誘導作用減弱，可能是蒼耳子炮制減毒的機理之一。由于CYP450酶族系眾多，其活性同時受到環(huán)境、遺傳、飲食、情緒等因素的影響,蒼耳子炮制后對其他CYP450酶的誘導效果如何，還需要進一步研究。