一測多評法同時測定蒲公英配方顆粒中5種成分的含量*

施文婷，鄧桂海，文珊，黎桃敏，張?zhí)m蘭，劉權(quán)震，梁志毅

（廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室，廣東 佛山 528244）

蒲公英是菊科植物蒲公英（Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.）、堿地蒲公英（Taraxacum borealisinense Kitam.）或同屬數(shù)種植物的干燥全草[1]。其主要產(chǎn)于北半球溫帶至亞熱帶地區(qū)，在我國主要分布于華北、東北、西北、西南等地區(qū)[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，蒲公英含有酚酸類、黃酮類、多糖類、萜類及甾醇類等多種有效成分[3-5]，具有抗癌、抗氧化、降血糖、抗血栓、免疫調(diào)節(jié)等多重藥理作用，同時蒲公英具有清熱解毒、健胃消炎、散結(jié)、利尿活血的功效，臨床上主要用于治療炎癥、疔毒癰腫、腫瘤、高脂血癥、前列腺等疾病[6-10]。

蒲公英配方顆粒由蒲公英藥材炮制成飲片后，經(jīng)過提取、濃縮和制劑工藝精制而成，具有藥性強、藥效好、免煎煮、服用方便等優(yōu)勢，臨床應(yīng)用廣泛[11]。一測多評法借助相對校正因子，只需測定一個成分（內(nèi)標(biāo)物），即可實現(xiàn)對多個有效成分的定量分析，同時降低了檢測成本，在中藥質(zhì)量控制方面得到廣泛應(yīng)用[12-13]。本研究通過建立一測多評法，以咖啡酸為內(nèi)標(biāo)物，同時測定蒲公英配方顆粒中單咖啡酰酒石酸、新綠原酸、綠原酸和菊苣酸的含量，以期為蒲公英配方顆粒的質(zhì)量控制及后續(xù)研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Thermo U3000型高效液相色譜儀（美國賽默飛公司）；Waters Arc型高效液相色譜儀（美國沃特世公司）；Milli-Q Direct型超純水系統(tǒng)（德國默克公司）；XP26型百萬分之一天平、ME204E型萬分之一天平均購自瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥 綠原酸對照品（批號：110753-201817，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為96.80%）、咖啡酸對照品（批號：110885-201703，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.7%）均購自中國食品藥品檢定研究院；單咖啡酰酒石酸對照品（批號：wkq20043006，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.10%）、新綠原酸對照品（批號：wkq18030107，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.00%）、菊苣酸對照品（批號：wkq20030403，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.56%）均購自四川省維克奇生物科技有限公司；乙腈、甲醇為色譜純均購自德國默克公司；醋酸為色譜純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；其他試劑為分析純。本研究所用10批蒲公英配方顆粒（編號：S1～S10）由廣東一方制藥有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[14]采用Waters Xbridge C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm，美國沃特世公司），流動相為乙腈（A）-0.5%醋酸溶液（B），梯度洗脫（0～25 min，5%～15%A；25～35 min，15%～35%A；35～50 min，35%A），檢測波長為323 nm，柱溫為35 ℃，進樣量為10 μL，流速為1.0 mL/min。

2.2 混合對照品溶液的制備 分別取單咖啡酰酒石酸、新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、菊苣酸對照品適量，精密稱定，加入50%甲醇定容，制成質(zhì)量濃度分別為556.248 0、53.468 8、54.046 6、54.840 8、388.864 0 μg/mL的混合對照品貯備液。

2.3 供試品溶液的制備[12]取蒲公英配方顆粒約0.2 g，精密稱定樣品質(zhì)量，置于100 mL的具塞錐形瓶中，精密加入水50 mL，密塞，稱定總質(zhì)量，超聲波提取目標(biāo)成分30 min后，取出，放冷后再稱質(zhì)量，補足減失的水溶液質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性試驗[15]分別精密吸取空白溶劑、混合對照品溶液及供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定。結(jié)果顯示，空白溶劑色譜圖中，在單咖啡酰酒石酸、新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、菊苣酸的出峰位置無吸收峰；供試品溶液色譜中，在與混合對照品溶液色譜相同保留時間處有相應(yīng)色譜峰，表明該方法專屬性良好。（見圖1）

2.4.2 線性關(guān)系考察[12]精密量取0.1、0.2、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 mL的單咖啡酰酒石酸（556.248 0 μg/mL）、新綠原酸（53.468 8 μg/mL）、綠原酸（質(zhì)54.046 6 μg/mL）、咖啡酸（54.840 8 μg/mL）、菊苣酸（388.864 0 μg/mL）混合對照品溶液，置于容量瓶中，緩慢滴加50%甲醇溶液定容至10 mL的刻度線處，制成系列濃度的混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄單咖啡酰酒石酸、新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、菊苣酸的峰面積。以對照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y）進行線性回歸。結(jié)果表明各成分的線性關(guān)系在其相應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均有良好的線性關(guān)系。（見表1）

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果

續(xù)表1：

2.4.3 精密度試驗[15]精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，計算得單咖啡酰酒石酸、新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、菊苣酸色譜峰峰面積的RSD均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗[15]取蒲公英配方顆粒樣品適量，精密稱定，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別于制備0、2、4、8、12、24 h后進樣測定，計算得單咖啡酰酒石酸、新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、菊苣酸色譜峰峰面積的RSD均小于3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗[15]取蒲公英配方顆粒樣品適量，精密稱定，按“2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算得單咖啡酰酒石酸、新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、菊苣酸色譜峰峰面積的RSD均小于3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗[12]取同一批次已知成分含量的蒲公英配方顆粒共9份，研細(xì)，每份取約0.5 g，精密稱定后分別置于錐形瓶100 mL中，每組分別加入單咖啡酰酒石酸、新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、菊苣酸對照品溶液，加入量為蒲公英配方顆粒中各成分含量的50%、100%和150%，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算加樣回收率及RSD。平均回收率：單咖啡酰酒石酸為105.20%（RSD=1.76%）；新綠原酸為106.83%（RSD=2.40%）；綠原酸為106.89%（RSD=1.77%）；咖啡酸為102.60%（RSD=2.51%）；菊苣酸為105.30%（RSD=2.91%）。表明該方法準(zhǔn)確度良好。（見表2）

表2 5 種成分的加樣回收率試驗結(jié)果（n=9）

2.5 相對校正因子的確定[16-17]精密吸取“2.4.2”項下混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以咖啡酸為內(nèi)標(biāo)物，計算其他4種成分的相對校正因子（fs/k），公式為fs/k=fs/fk=（As×Ck）/（Ak×Cs）。其中As為內(nèi)標(biāo)物峰面積，Cs為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度，Ak為待測成分峰面積，Ck為待測成分質(zhì)量濃度。結(jié)果見表3。

表3 各成分相對校正因子（n=7）

2.6 耐用性和系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

2.6.1 不同色譜系統(tǒng)及色譜柱對相對校正因子的影響[18]以咖啡酸為內(nèi)標(biāo)物，考察其他4種成分在Thermo U3000型、Waters Arc型2種高效液相色譜系統(tǒng)，以及Waters Xbridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent ZORBAX Extend-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、YMC Triart C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）3種色譜柱下的相對校正因子。結(jié)果見表4。各成分的RSD均小于3%，表明不同色譜系統(tǒng)和色譜柱對各成分相對校正因子無顯著影響。

表4 不同色譜系統(tǒng)、色譜柱對相對校正因子的影響

2.6.2 不同柱溫對相對校正因子的影響[18]采用Waters Arc型高效液相色譜儀、Waters Xbridge C18色譜柱，考察柱溫25、30、35、40 ℃對各成分相對校正因子的影響。結(jié)果見表5。不同柱溫條件下各成分的RSD均小于3%，表明柱溫對各成分相對校正因子無顯著影響。

表5 不同柱溫對相對校正因子的影響

2.6.3 不同流速對相對校正因子的影響[18]采用Waters Arc型高效液相色譜儀、Waters Xbridge C18色譜柱，考察流速0.8、1.0、1.2 mL/min對各成分相對校正因子的影響。結(jié)果顯示不同流速條件下各成分的RSD均小于3%，表明不同流速對各成分相對校正因子無顯著影響。（見表6）

表6 不同流速對相對校正因子的影響

2.6.4 不同進樣體積對相對校正因子的影響[18]采用Waters Arc型高效液相色譜儀、Waters Xbridge C18色譜柱，考察進樣體積2、4、6、8、10、15 μL對各成分相對校正因子的影響。結(jié)果顯示各成分的RSD均小于3%，表明進樣體積的波動對各成分相對校正因子無顯著影響。（見表7）

表7 不同進樣體積對相對校正因子的影響

2.7 待測成分色譜峰的定位[19]在QAMS的應(yīng)用中，目前常用的色譜峰定位方法有相對保留值法、保留時間差法、時間校正法、對照提取物法等方法。保留時間差法計算公式：Δti/s=ti-ts。相對保留值法計算公式：ti/s=ti/ts。本實驗采用相對保留時間進行待測組分色譜峰的定位，以咖啡酸為內(nèi)標(biāo)物，考察其他4種成分在Thermo U3000型和Waters Arc型2種高效液相色譜系統(tǒng)，以及3根不同廠家的色譜柱（Waters Xbridge C18、Agilent ZORBAX Extend-C18、YMC Triart C18）的相對保留時間。采用相對保留值法各成分的RSD均小于3%，表明采用相對保留值法對待測成分的定位是可行的。（見表8）

表8 各成分相對保留時間

2.8 一測多評法與外標(biāo)法測定結(jié)果比較 取10批蒲公英配方顆粒適量，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，分別采用外標(biāo)法和一測多評法測定各成分含量，利用SPSS 20.0軟件對兩組檢測結(jié)果進行配對t檢驗及Pearson相關(guān)性分析。兩種方法之間的相關(guān)系數(shù)r均為1.000，表明兩種方法測定結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），建立的一測多評法具有較好的可信度。（見表9）

表9 外標(biāo)法與一測多評測定結(jié)果比較（%，n=3）

3 討 論

蒲公英作為一種藥食同源植物，在我國傳統(tǒng)食用和藥用方面的應(yīng)用已有幾千年歷史。蒲公英含有多種有效成分，其中酚酸類成分如單咖啡酰酒石酸、新綠原酸、綠原酸和菊苣酸等為其主要活性成分，具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、降血糖和抑制腫瘤等多重藥理作用[20-22]。蒲公英配方顆粒國家標(biāo)準(zhǔn)屬于國家藥品監(jiān)督管理局首批頒布的160個中藥配方顆粒國家標(biāo)準(zhǔn)之一，已于2021年11月1日正式實施。中藥配方顆粒國家標(biāo)準(zhǔn)的執(zhí)行將有助于實現(xiàn)安全性、有效性等多方面的整體質(zhì)量控制。本研究在此基礎(chǔ)上，采用QAMS法同時測定了蒲公英配方顆粒中5種有效成分的含量，并對QAMS法的可行性與適用性進行了探討。計算結(jié)果與外標(biāo)法實測結(jié)果無明顯差異，表明所建立的QAMS方法經(jīng)濟、穩(wěn)定、可行，可為蒲公英配方顆粒的質(zhì)量控制、譜效相關(guān)研究提供基礎(chǔ)，并為其他品種質(zhì)量評價研究提供范例。