電針對腦梗死大鼠腦組織中BDNF/TrkB/PI3K信號通路的影響*

王琮民，閆紀(jì)琳，李海濤，牛麗輝，王敏，苗玲

（1.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院，河北 邯鄲 056000；2.河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河北 邯鄲 056000；3.邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056000）

急性腦梗死屬于神經(jīng)內(nèi)科常見疾病，臨床癥狀主要為偏癱，是一類致死率、致殘率、復(fù)發(fā)率極高的心腦血管疾病[1]。該病發(fā)病原因主要為腦部供血不足，造成腦組織缺血、缺氧性壞死，最終導(dǎo)致神經(jīng)功能受損[2]。目前治療腦梗死的方法主要是服用藥物，如他汀類、阿司匹林等，但是治療效果不佳[3]。而隨著我國老齡人口不斷增加，中老年人對生活的質(zhì)量有了更高的要求，對心腦血管疾病治療也更為重視，因此迫切需要簡單、有效的方法治療急性腦梗死。針灸作為傳統(tǒng)康復(fù)治療手段，操作簡單，在治療急性腦梗死中已經(jīng)得到了認(rèn)可，但大部分文獻(xiàn)報(bào)道僅僅局限于觀察臨床療效方面，對具體的作用機(jī)制鮮有報(bào)道[4]。而腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（Brain-derived neurotrophic factor，BDNF）/酪氨酸激酶（Tyrosine kinase，TrkB）/磷脂酰肌醇3激酶（Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）信號通路作為一種常見的信號通路，在治療腦梗死方面受到很多學(xué)者的關(guān)注。因此，本研究通過改良線栓法建立腦梗死大鼠模型，從BDNF/TrkB/PI3K信號通路方面探索電針對腦梗死大鼠的治療效果，以期為電針治療腦梗死提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 6～7周齡雄性SPF級SD大鼠85只，體質(zhì)量210～230 g，購自北京腦科學(xué)與類腦研究中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2021-0005。所有大鼠均飼養(yǎng)于溫度22 ℃、濕度55%的標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中，自由進(jìn)食進(jìn)水。使用實(shí)驗(yàn)動物遵循國家《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》，并經(jīng)動物倫理委員會批準(zhǔn)通過。

1.2 藥物與試劑 白細(xì)胞介素-8（Interleukin-8，IL-8）ELISA試劑盒（批號：ml037351）、腫瘤壞死因子-ɑ（tumour necrosis factor-ɑ，TNF-ɑ）ELISA試劑盒（批號：ml002859）、白細(xì)胞介素-2（Interleukin-2，IL-2）ELISA試劑盒（批號：ml064292）均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色液（批號：DK0005）購自北京雷根生物技術(shù)有限公司；兔抗BDNF抗體（批號：ab108319）、兔抗TrkB抗體（批號：ab187041）、p-PI3K抗體（批號：ab278545）、PI3K抗體（批號：ab32089）、蛋白激酶B抗體（protein kinase B，AKT）（批號：ab81283）、p-AKT抗體（批號：ab8805）均購自abcam公司；BDNF/TrkB通路抑制劑-K252a（批號：HY-N6732）購自美國MCE公司。

1.3 主要儀器 ZFM-800光學(xué)顯微鏡（上海正晞儀器設(shè)備有限公司）；Bio-Rad iMark酶標(biāo)儀（上海京工實(shí)業(yè)有限公司）；XS-998B06低頻脈沖電針治療儀（上海聚慕醫(yī)療器械有限公司）。

1.4 造模與分組 參照張芳等[5]建立急性腦梗死大鼠模型的方法造模，操作過程如下：隨機(jī)選取70只實(shí)驗(yàn)大鼠術(shù)前1天禁水、禁食，經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉大鼠，仰臥位固定于操作臺上，對頸部皮膚消毒，切開大鼠頸部，分離皮下組織，依次分離頸部總動脈，頸內(nèi)、外動脈，近心端結(jié)扎頸外動脈，尼龍線（3 mm）結(jié)扎右側(cè)頸總動脈，阻斷血流，于頸內(nèi)動脈根部位固定線栓，觀察無出血現(xiàn)象即可縫合傷口并進(jìn)行傷口清潔消毒。大鼠蘇醒后，觀察大鼠狀況，如出現(xiàn)右眼瞼下垂，瞳孔變小等霍納綜合征；運(yùn)動時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；提尾時(shí)左側(cè)前肢內(nèi)收屈曲等癥狀，說明大鼠模型構(gòu)建成功[6]。共有60只大鼠符合上述造模標(biāo)準(zhǔn)，4只大鼠死亡，6只大鼠造模失敗，造模成功率為86%。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、電針組、抑制劑組、電針+抑制劑組，每組15只。剩余15只大鼠作為假手術(shù)組，除不結(jié)扎外，其余操作與造模大鼠相同。

1.5 干預(yù)方法 抑制劑組、電針+抑制劑組大鼠經(jīng)右側(cè)腦室注射K252a，10 μg/kg[7]；假手術(shù)組、模型組、電針組大鼠注射等體積的生理鹽水，1次/d，連續(xù)干預(yù)7 d。電針組、電針+抑制劑組對大鼠百會、風(fēng)府、心俞、內(nèi)關(guān)進(jìn)行電針干預(yù)，電針干預(yù)方法參照大鼠解剖結(jié)構(gòu)及《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[8]確認(rèn)大鼠百會、風(fēng)府、心俞、內(nèi)關(guān)的定位。百會與風(fēng)府為一組，患側(cè)內(nèi)關(guān)與心俞為一組，其中百會、內(nèi)關(guān)接負(fù)極，風(fēng)府、心俞接正極；將各組大鼠均置于操作臺上并用皮筋固定在鼠板上，其中電針組、電針+抑制劑組大鼠進(jìn)行電針干預(yù)，電針治療儀連接0.3 mm×25 mm毫針，直刺4～6 mm，參數(shù)選擇：頻率為10 Hz的疏密波，留針時(shí)間為30 min。1次/d，連續(xù)治療7 d。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 神經(jīng)功能缺損評估 參照Longa[9]的評分標(biāo)準(zhǔn)，對治療后的大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評估：無神經(jīng)功能損傷癥狀計(jì)0分；不能完全伸展左側(cè)前爪或后爪計(jì)1分；行走時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈計(jì)2分；行走時(shí)向左側(cè)傾倒計(jì)3分；無法自發(fā)行走，喪失意識計(jì)4分。

1.6.2 樣本采集及處理 神經(jīng)功能缺損評估完成后，每組隨機(jī)選取10只大鼠，采用戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉大鼠，眼球取血，離心取上清液，用于ELISA檢測血清中炎癥因子水平；處死大鼠，取出腦組織，置于-80 ℃冰箱中保存，用于后續(xù)Western blotting檢測；將剩下各組5只大鼠處死，取出腦組織置于-20 ℃冰箱中保存，用于TTC染色。

1.6.3 大鼠腦梗死面積 取上述“1.6.2”中置于-20 ℃冰箱中的腦組織，從額極開始，每間隔2 mm進(jìn)行一次冠狀面切片，之后放入培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，避光條件下進(jìn)行TTC染色，37 ℃孵育25 min，10%多聚甲醛溶液中固定，拍照并用圖像分析系統(tǒng)檢測大鼠腦梗死面積，腦梗死面積比=（缺血部分面積/切片面積）×100%。

1.6.4 血清IL-8、TNF-ɑ、IL-2水平 取上述“1.6.2”中血清樣本，檢測大鼠血清IL-8、TNF-ɑ、IL-2水平，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.6.5 大鼠腦組織中BDNF/TrkB/PI3K通路相關(guān)蛋白表達(dá) 取上述“1.6.2”中適量腦組織，加入細(xì)胞裂解液，4 ℃、12 000 r/min離心10 min提取總蛋白，BAC蛋白定量試劑盒定量分析、SDS-聚丙烯酰胺（PAGE）凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入稀釋后的BDNF、TrkB、p-PI3K、p-AKT、AKT、PI3K一抗（1∶1 000）、β-actin（1∶2 000），4 ℃恒溫箱過夜；TBST洗滌、加入二抗室溫孵育1 h，ECL試劑盒顯色、凝膠成像儀拍照，分析灰度值，計(jì)算各組大鼠BDNF、TrkB、p-PI3K、p-AKT、PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評分明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，電針組大鼠神經(jīng)功能缺損評分明顯降低（P＜0.05），抑制劑組大鼠神經(jīng)功能缺損評分明顯升高（P＜0.05）；電針+抑制劑組大鼠神經(jīng)功能缺損評分與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；電針+抑制劑組大鼠神經(jīng)功能缺損評分明顯高于電針組，而明顯低于抑制劑組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（見表1）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較（，分）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較（，分）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與電針組比較，cP＜0.05；與抑制劑組比較，dP＜0.05

2.2 各組大鼠腦梗死面積比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦梗死面積明顯增大（P＜0.05）；與模型組比較，電針組大鼠腦梗死面積明顯減小（P＜0.05），抑制劑組大鼠腦梗死面積明顯增大（P＜0.05）；電針+抑制劑組大鼠腦梗死面積與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；電針+抑制劑組大鼠腦梗死面積明顯大于電針組，而明顯小于抑制劑組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（見圖1、表2）

表2 各組大鼠腦梗死面積比比較（，%）

表2 各組大鼠腦梗死面積比比較（，%）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與電針組比較，cP＜0.05；與抑制劑組比較，dP＜0.05

2.3 各組大鼠血清IL-8、TNF-ɑ、IL-2水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清IL-8、TNF-ɑ、IL-2含量均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，電針組大鼠血清IL-8、TNF-ɑ、IL-2含量均明顯降低（P＜0.05），抑制劑組大鼠血清IL-8、TNF-ɑ、IL-2含量均明顯升高（P＜0.05）；電針+抑制劑組大鼠血清IL-8、TNF-ɑ、IL-2含量與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；電針+抑制劑組大鼠血清IL-8、TNF-ɑ、IL-2含量明顯高于電針組，而明顯低于抑制劑組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（見表3）

表3 各組大鼠血清IL-8、TNF-ɑ、IL-2 水平比較（，ng/mL）

表3 各組大鼠血清IL-8、TNF-ɑ、IL-2 水平比較（，ng/mL）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與電針組比較，cP＜0.05；與抑制劑組比較，dP＜0.05

2.4 各組大鼠腦組織中BDNF、TrkB、p-PI3K、p-AKT、PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中BDNF、TrkB蛋白相對表達(dá)量及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT均明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，電針組大鼠腦組織中BDNF、TrkB蛋白相對表達(dá)量及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT均明顯升高（P＜0.05），抑制劑組大鼠腦組織中BDNF、TrkB蛋白相對表達(dá)量及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT均明顯降低（P＜0.05）；電針+抑制劑組大鼠腦組織中BDNF、TrkB蛋白相對表達(dá)量及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT與模型組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；電針+抑制劑組大鼠腦組織中BDNF、TrkB蛋白相對表達(dá)量及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT明顯低于電針組，而明顯高于抑制劑組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（見圖2、表4）

表4 各組大鼠腦組織中BDNF、TrkB、p-PI3K、p-AKT、PI3K、AKT 蛋白相對表達(dá)量比較（）

表4 各組大鼠腦組織中BDNF、TrkB、p-PI3K、p-AKT、PI3K、AKT 蛋白相對表達(dá)量比較（）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與電針組比較，cP＜0.05；與抑制劑組比較，dP＜0.05

3 討 論

腦梗死主要是由于腦部血液流通受阻，致使大腦缺血、缺氧、腦細(xì)胞壞死，與吸煙、年齡、高尿酸血癥及動脈粥樣硬化等危險(xiǎn)因素密切相關(guān)[10]。該病發(fā)病快，發(fā)病率、致死率及致殘率均較高。患者會出現(xiàn)認(rèn)知、語言、運(yùn)動等方面障礙，嚴(yán)重影響了患者的生理、心理和日常生活。腦梗死須進(jìn)行長期康復(fù)治療[11-12]，其中溶栓、抗凝、護(hù)腦等是常見的治療手段，但治療周期較長，加重了患者的心理及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，容易對治療失去信心。因此開發(fā)新的腦梗死治療手段已成為心腦血管領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。本研究通過改良線栓法建立腦梗死大鼠模型，發(fā)現(xiàn)模型大鼠出現(xiàn)右眼霍納綜合征、向左側(cè)轉(zhuǎn)圈、左側(cè)前肢內(nèi)收屈曲等癥狀，這表明造模成功，可進(jìn)行下一步的研究。

中醫(yī)學(xué)又稱腦梗死為“中風(fēng)”，造成該疾病的原因主要與氣血運(yùn)行受阻，清竅失養(yǎng)有關(guān)[13]。針灸作為非藥物治療手段，可以通過刺激穴位達(dá)到通經(jīng)活絡(luò)、活血化瘀的目的，從而改善神經(jīng)功能缺損[14-15]。百會穴可通關(guān)開竅、補(bǔ)神益智、啟閉醒神；心俞為調(diào)理“心”臟要穴；風(fēng)府可調(diào)動五臟六腑之精氣；內(nèi)關(guān)使血、心、脈及神相互聯(lián)系，可起到寧心安神之效。百會配風(fēng)府，輔以心俞、內(nèi)關(guān)，可醒神開竅、調(diào)督通絡(luò)。姚文超等[16]研究表明電針百會、風(fēng)府、心俞、內(nèi)關(guān)聯(lián)合康復(fù)訓(xùn)練，可有效促進(jìn)右側(cè)大腦中動脈缺血模型大鼠血管新生，恢復(fù)神經(jīng)功能；王珊等[17]研究表明電針可以緩解腦缺血再灌注大鼠的腦損傷，提高大鼠運(yùn)動能力。本研究選擇對缺血性疾病具有較好療效的百會、風(fēng)府、內(nèi)關(guān)、心俞進(jìn)行電針干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，電針組大鼠神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死面積均明顯降低。這表明電針治療在一定程度上可以改善腦梗死造成的不良癥狀，但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步探索。

BNDF作為一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，在腦梗死發(fā)生后，有助于縮小腦組織梗死面積及減輕腦損傷，其生物學(xué)功能主要通過受體TrkB發(fā)揮作用。BNDF與TrkB結(jié)合形成二聚體的同時(shí)會誘導(dǎo)TrkB磷酸化，激活下游通路，保護(hù)腦組織，促進(jìn)神經(jīng)元可塑性[18]。PI3K是一種可與營養(yǎng)因子結(jié)合的生長因子，AKT是一種特異性蛋白激酶，一旦受到生長因子、胰島素等影響，便會激活PI3K/AKT信號通路，參與細(xì)胞的生長、增殖、營養(yǎng)代謝等過程。PI3K/AKT信號通路作為BNDF/TrkB下游通路之一，在保護(hù)腦組織和抗細(xì)胞缺血缺氧過程中起著重要作用[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中BDNF、TrkB蛋白相對表達(dá)量及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT均明顯降低，表明抑制BDNF/TrkB/PI3K通路可能是造成大鼠腦損傷的原因。電針組大鼠腦組織中BDNF、TrkB蛋白相對表達(dá)量及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT均明顯升高，表明電針改善腦梗死造成的不良癥狀，可能與激活BDNF/TrkB/PI3K通路有關(guān)。

BDNF/TrkB/PI3K信號通路在一定程度上與炎癥因子釋放有密切關(guān)系。線粒體損傷、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、激活凋亡因子等過程均可導(dǎo)致腦梗死的發(fā)生發(fā)展，其中炎癥反應(yīng)在腦梗死中起著關(guān)鍵作用。腫瘤壞死因子、干擾素、白細(xì)胞介素等炎癥因子是炎癥免疫中的基本介質(zhì)，其中腫瘤壞死因子和白細(xì)胞介素相互拮抗，在疾病治療中共同發(fā)揮抑制炎癥作用[20]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步使用BDNF/TrkB/PI3K通路抑制劑K252a干預(yù)大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與電針組比較，電針+抑制劑組大鼠血清IL-8、IL-2、TNF-ɑ含量均顯著升高，大鼠腦組織中BDNF、TrkB蛋白相對表達(dá)量及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT均明顯降低，提示BDNF/TrkB/PI3K通路抑制劑可逆轉(zhuǎn)電針對大鼠腦梗死的緩解作用。這進(jìn)一步揭示了電針可改善腦梗死造成的不良癥狀，減輕炎癥反應(yīng)，與激活BDNF/TrkB/PI3K信號通路。

綜上所述，電針治療可以有效地改善腦梗死大鼠腦損傷，減輕炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與激活BDNF/TrkB/PI3K信號通路有關(guān)。電針治療腦梗死的作用機(jī)制可能還受其他信號通路的影響，還有待進(jìn)一步研究。