針刺對腰椎后路減壓融合內(nèi)固定術(shù)大鼠的抑炎鎮(zhèn)痛作用及Akt/NF-κB通路的影響*

楊文文，許蘭，吳繼新，王增亮

（新疆醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000）

腰椎后路融合減壓內(nèi)固定術(shù)是治療腰椎疾病的常用方法，手術(shù)療效佳，且相對安全，但手術(shù)創(chuàng)傷大，術(shù)后疼痛嚴(yán)重是該手術(shù)存在的最大弊端，因此如何減輕術(shù)后疼痛成為亟待解決的問題[1]。針刺療法通過直接刺激神經(jīng)根，經(jīng)神經(jīng)纖維傳導(dǎo)作用激活下丘腦-垂體-腎上腺軸系統(tǒng)，從神經(jīng)、體液和免疫三方面共同作用，抑制致痛因子釋放，同時促進血液循環(huán)中致痛因子代謝[2]。炎癥反應(yīng)在神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生和維持中發(fā)揮了重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，香葉木素通過抑制炎癥反應(yīng)，可有效緩解椎間盤退變引起的神經(jīng)根性疼痛[3]。葛根素可通過減輕炎癥反應(yīng)治療腰椎間盤突出癥大鼠的神經(jīng)根疼痛[4]。蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/核因子κB（nuclear factorkappa B，NF-κB）信號通路是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的重要信號因子，參與腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白介素（interleukin，IL）等多種炎癥因子的產(chǎn)生與釋放[5]。但是針刺療法能否通過Akt/NF-κB信號通路抑制炎癥反應(yīng)，從而緩解腰椎后路融合減壓內(nèi)固定術(shù)大鼠神經(jīng)性疼痛需要進一步研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 8周齡健康SPF級雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量180～200 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2017-0011。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫（25±1）℃，相對濕度40%～60%，12 h晝夜節(jié)律交替。該實驗經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院倫理委員會審批，審批號：XJYKD29018。

1.2 試劑 TNF-α試劑盒（批號：D731168-0048）、IL-6試劑盒（批號：DG94490Q-48T）、IL-1β試劑盒（批號：QS41588-48T）均購自上海碧云天生物科技有限公司；β-內(nèi)啡肽（β-endorphin，β-EP）（深圳市益百順科技有限公司，批號：JM-01642R2）；P物質(zhì)（substance P，SP）（深圳市文樂生物科技有限公司，批號：EK7186）；5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）（北京奇松生物科技有限公司，批號：QS41983-48T）；氟比洛芬酯（北京泰德制藥股份有限公司，批號：598905）；兔抗鼠Akt抗體（批號：ab8005）、p-Akt抗體（批號：ab38449）、NF-κB抗體（批號：ab220803）和p-NF-κB p65抗體（批號：ab239882）均購自美國Abcam公司。

1.3 主要儀器 GB2024-94型華佗牌無菌針具（蘇州華佗醫(yī)療器械有限公司）；Synergy NEO2多功能酶標(biāo)儀（美國Bio-TEK公司）；TS100倒置顯微鏡（北京派迪威儀器有限公司）；PL-200熱刺痛儀（成都泰盟科技有限公司）；1658001電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

1.4 分組與造模 從50只SD大鼠中隨機取10只作為對照組，其余40只大鼠建立腰椎間盤突出癥模型[6]，具體操作如下：腹腔麻醉大鼠，在尾部距肛門1 cm處斷尾，將尾椎關(guān)節(jié)椎間盤組織中的乳白色膠凍樣髓核組織取出備用。大鼠背部消毒，縱向做一長約3 cm的切口，將L5～6從左側(cè)棘突上鈍性分離，暴露橫突，切除左側(cè)部分L5、L6段的椎板和上下關(guān)節(jié)突，將尾椎髓核組織植入左側(cè)L5神經(jīng)根硬膜囊的交界處，逐層縫合組織；對照組大鼠不植入尾椎髓核組織，其余操作同上。大鼠出現(xiàn)精神萎靡、活動減少，活動速度減慢，步幅和頻率降低，熱痛閾值降低則提示造模成功。3 d后，打開手術(shù)區(qū)，擴大椎板，充分暴露椎間隙，在左側(cè)L5椎弓根植入一枚螺釘，移除突出椎間盤，植入椎間融合器，逐層縫合組織。將造模成功的36大鼠隨機分為模型組（12只）、針刺組（12只）和氟比洛芬酯組（12只）。

1.5 干預(yù)措施 針刺組大鼠于術(shù)后2 h進行針刺“腎俞穴”，參照張露芬[7]的《實驗針灸學(xué)》，大鼠麻醉后固定于鼠板上，于第二腰椎棘突下旁開7 mm位置，用華佗一次性針灸針（規(guī)格：0.22 mm×25 mm）刺入，深度為5 mm，針刺后連接電針儀，波形設(shè)為疏密波，頻率為2 Hz，每次電針20 min，1次/d，連續(xù)5 d；對照組、模型組和氟比洛芬酯組大鼠不做針刺處理；氟比洛芬酯組大鼠于術(shù)后2 h，尾靜脈注射氟比洛芬酯注射液，25 mg/kg，2次/d，兩次時間間隔12 h，連續(xù)5 d；對照組、模型組和針刺組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 熱板致痛實驗測定各組大鼠痛閾值 末次干預(yù)結(jié)束2 h后，把各組大鼠置于熱板上，維持熱板的溫度為（55.0±0.5）℃，觀察各組大鼠在1 min內(nèi)從接觸熱板到舔后足的時間，該時間則為大鼠的痛閾值。

1.6.2 ELISA法檢測各組大鼠血清中IL-6、TNF-α和IL-1β水平及β-EP、5-HT和SP含量 痛閾值測定完成后，各組大鼠斷頸處死，打開胸腔，收集主動脈血，室溫靜置沉淀30 min后，3 000 r/min離心10 min（離心半徑8 cm），吸取上清液為待測樣品。取出酶標(biāo)包被的96孔板，加入稀釋液，孵育30 min，加入待測樣品，37 ℃孵育30 min，棄掉液體后，洗滌5次，加入酶標(biāo)抗體，置于37 ℃水浴鍋中孵育30 min，洗滌5次，加入底物液，37 ℃水浴鍋孵育30 min，加入終止液反應(yīng)15 min，酶標(biāo)儀490 nm處測定吸光度（A）值。

1.6.3 HE染色檢測L5神經(jīng)根組織病理學(xué)改變 血液采集完成后，打開腹腔，剝離L5神經(jīng)根，截取約2 mm，置于4%多聚甲醛中固定，經(jīng)脫水、石蠟包埋后，切成厚度為4 μm的石蠟切片，進行HE染色。

1.6.4 Western blotting法檢測p-Akt、Akt、p-NF-κB p65和NF-κB p65蛋白相對表達量 取L5～6背根神經(jīng)節(jié)，液氮中研磨，裂解液裂解，12 000 r/min離心10 min（離心半徑10 cm），收集上清液，12% SDS-PAGE凝膠電泳，120 V電泳2 h，0.3 A濕轉(zhuǎn)2 h，TBST洗膜，封閉1 h，p-Akt、Akt、p-NF-κB、NF-κB和GAPDH一抗（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，TBST洗膜，ECL顯色，Image J分析條帶灰度值，目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值即為目的蛋白相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件處理數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠痛閾值比較 模型組大鼠痛閾值明顯低于對照組（P＜0.05）；針刺組和氟比洛芬酯組大鼠痛閾值明顯高于模型組（P＜0.05）；氟比洛芬酯組大鼠痛閾值明顯高于針刺組（P＜0.05）。（見表1）

表1 各組大鼠痛閾值比較（）

表1 各組大鼠痛閾值比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與針刺組比較，cP＜0.05

2.2 各組大鼠血清IL-6、TNF-α和IL-1β水平比較 模型組大鼠血清IL-6、TNF-α和IL-1β水平均明顯高于對照組（P＜0.05）；針刺組和氟比洛芬酯組大鼠血清IL-6、TNF-α和IL-1β水平均明顯低于模型組（P＜0.05）；氟比洛芬酯組大鼠血清IL-6、TNF-α和IL-1β水平均明顯低于針刺組（P＜0.05）。（見表2）

表2 各組大鼠血清IL-6、TNF-α 和IL-1β 水平比較（，ng/mL）

表2 各組大鼠血清IL-6、TNF-α 和IL-1β 水平比較（，ng/mL）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與針刺組比較，cP＜0.05

2.3 各組大鼠血清中β-EP、SP和5-HT含量比較 模型組大鼠血清中β-EP含量明顯低于對照組（P＜0.05），SP和5-HT含量均明顯高于對照組（P＜0.05）；針刺組和氟比洛芬酯組大鼠血清中β-EP含量明顯高于模型組（P＜0.05），SP和5-HT含量均明顯低于模型組（P＜0.05）；氟比洛芬酯組大鼠血清中β-EP含量明顯高于針刺組（P＜0.05），SP和5-HT含量均明顯低于針刺組（P＜0.05）。（見表3）

表3 各組大鼠血清中β-EP、5-HT 和SP 含量比較（）

表3 各組大鼠血清中β-EP、5-HT 和SP 含量比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與針刺組比較，cP＜0.05

2.4 各組大鼠L5神經(jīng)根病理學(xué)改變情況 對照組大鼠神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、形態(tài)正常、排列整齊，未見炎癥細(xì)胞浸潤；模型組大鼠神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂、細(xì)胞邊界模糊，明顯水腫，髓鞘發(fā)生崩解，排列不整齊，有大量炎癥細(xì)胞浸潤；針刺組和氟比洛芬酯組大鼠神經(jīng)細(xì)胞排列稍整齊，炎癥細(xì)胞浸潤減少，細(xì)胞輕度水腫。（見圖1）

2.5 各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)p-Akt、Akt、p-NF-κB p65和NF-κB p65蛋白相對表達量比較 4組大鼠背根神經(jīng)節(jié)Akt和NF-κB p65蛋白相對表達量比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。模型組大鼠背根神經(jīng)節(jié)p-Akt和p-NF-κB p65蛋白相對表達量均明顯高于對照組（P＜0.05）；針刺組和氟比洛芬酯組大鼠背根神經(jīng)節(jié)p-Akt和p-NF-κB p65蛋白相對表達量均明顯低于模型組（P＜0.05）；氟比洛芬酯組大鼠背根神經(jīng)節(jié)p-Akt和p-NF-κB p65蛋白相對表達量均明顯低于針刺組（P＜0.05）。（見表4、圖2）

表4 各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)p-Akt 和p-NF-κB 蛋白相對表達量比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與針刺組比較，cP＜0.05

3 討 論

腰椎間盤退行性疾病常見于中老年人群，但隨著生活方式的改變，該類疾病發(fā)病人群逐漸趨于年輕化。腰椎間盤突出、腰椎滑脫以及腰椎管狹窄等都是臨床上常見的腰椎疾病。目前對于該類疾病常采用手術(shù)治療，釘棒系統(tǒng)內(nèi)固定是最常用的治療方法，不僅能使病變錐體在手術(shù)后獲得持久性的穩(wěn)定，而且還能保持手術(shù)區(qū)域錐體間的間距，從而使椎管維持正常形態(tài)。但由于該手術(shù)造成的創(chuàng)傷大，術(shù)后疼痛嚴(yán)重，因此限制了其臨床應(yīng)用[7]。而針刺療法能有效緩解疼痛，如WANG Y等[8]研究表明針刺聯(lián)合神經(jīng)阻滯可提高Ⅰ級腰椎滑脫治療的有效率，減輕患者疼痛，恢復(fù)脊柱功能，提高患者生活質(zhì)量。BUEVICH V等[9]研究表明針刺治療可有效減輕閉鎖性椎間盤突出癥患者疼痛程度。因此，本研究探討針刺療法緩解腰椎后路減壓融合內(nèi)固定術(shù)后大鼠疼痛的作用及可能機制。

腎俞穴來源于《靈樞·背俞》，是治療腰背痛的常用穴位，屬于足太陽膀胱經(jīng)的經(jīng)穴。膀胱經(jīng)統(tǒng)領(lǐng)體表陽氣，循行經(jīng)腰部及下肢后側(cè)，具有舒筋健骨、壯腰補腎之功。《針灸甲乙經(jīng)》記載“腎俞，在第十四錐三分，留七呼，灸三壯”，意為腎俞位于第二腰椎棘突下旁開1.5寸。研究發(fā)現(xiàn)，針刺腎俞穴可有效緩解腰椎間盤突出癥大鼠神經(jīng)痛[10]。氟比洛芬酯是臨床上常用的非甾體類抗炎鎮(zhèn)痛藥，具有良好的鎮(zhèn)痛效果，因此本研究用氟比洛芬酯作為陽性對照藥物。當(dāng)外界刺激達到剛好使大鼠出現(xiàn)痛覺時，這一臨界值則為大鼠的痛閾。當(dāng)大鼠感受到痛覺時，則會做出生理性痛反應(yīng)，常表現(xiàn)為一種屈肌反射。本研究通過將大鼠置于熱板上，記錄大鼠做出屈肌反射的時間，以此判斷大鼠對疼痛的敏感程度。結(jié)果顯示與對照組比較，模型組大鼠痛閾值降低，而與模型組比較，針刺組和氟比洛芬酯組大鼠痛閾值升高。提示腰椎后路減壓融合內(nèi)固定術(shù)后大鼠對疼痛的敏感程度增強，針刺和氟比洛芬酯治療后大鼠對疼痛的敏感程度降低。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致腰腿痛的主要原因，炎癥因子的大量產(chǎn)生導(dǎo)致神經(jīng)根損傷，從而引起腰腿痛。研究表明，氯胺酮能通過抑制神經(jīng)根炎癥反應(yīng)，緩解腰椎間盤突出大鼠疼痛和椎間盤退變[11]。補陽還五湯能抑制炎癥因子產(chǎn)生，減輕腰椎管狹窄患者術(shù)后疼痛[12]。臨床研究表明，健腰利筋湯聯(lián)合牽引復(fù)位能有效緩解腰椎間盤突出癥患者疼痛和腰部功能障礙，減輕病變部位的炎癥反應(yīng)[13]。因此，本研究檢測了大鼠血清炎癥因子含量，結(jié)果顯示模型組大鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α含量明顯高于對照組，針刺組和氟比洛芬酯組大鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α含量明顯低于模型組。提示針刺可降低腰椎后路減壓融合內(nèi)固定術(shù)后大鼠炎癥反應(yīng)。

SP作為一種興奮性遞質(zhì)，能起到傳遞疼痛信息的作用，是痛覺傳導(dǎo)的重要參與者。SP主要分布于中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)，能通過刺激巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞等釋放促炎因子，將痛覺信號傳遞到大腦，從而產(chǎn)生痛覺。此外，P物質(zhì)可引起組織水腫，造成局部大量氫離子聚集，從而使感受器細(xì)胞膜產(chǎn)生動作電位，將疼痛信號傳遞至中樞系統(tǒng)[14]。臨床研究證明，內(nèi)熱針可有效緩解膝關(guān)節(jié)半月板縫合術(shù)后遺留的疼痛，而且能降低患者血清中P物質(zhì)濃度[15]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，5-HT分布于下丘腦、松果仁等部位，是一種單胺類活性物質(zhì)。外周血中高濃度5-HT可引起神經(jīng)末梢受體激活，從而產(chǎn)生強烈的疼痛，同時5-HT能通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)可促進SPP釋放[16]。β-EP是一種能夠調(diào)節(jié)痛覺的阿片肽類抑制性神經(jīng)肽，分布于下丘腦、垂體和腎上腺等部位，不僅具有鎮(zhèn)痛效應(yīng)，同時還可調(diào)節(jié)體溫、炎癥反應(yīng)和內(nèi)分泌等。正常狀況下，β-EP不具有活性，在血漿中僅少量存在，當(dāng)機體受到疼痛刺激時，垂體大量釋放β-EP，可抑制SP釋放，同時抑制感覺神經(jīng)元傳遞痛覺。此外，機體受到傷害時，β-EP激活參與調(diào)節(jié)激素水平，發(fā)揮免疫抑制作用，降低炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[17]。本實驗中模型組大鼠血漿中5-HT和SP含量明顯高于對照組，而β-EP含量明顯低于對照組，針刺組和氟比洛芬酯組大鼠血漿中5-HT和SP含量明顯低于模型組，而β-EP含量明顯高于模型組。結(jié)果提示：針刺可降低致痛物質(zhì)產(chǎn)生，同時促進鎮(zhèn)痛物質(zhì)產(chǎn)生。炎癥因子大量釋放，常損傷神經(jīng)根，引起疼痛。本研究HE染色檢測L5神經(jīng)根結(jié)果顯示：對照組大鼠神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、形態(tài)正常、排列整齊，未見炎癥細(xì)胞浸潤；模型組大鼠神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂、細(xì)胞邊界模糊，明顯水腫，髓鞘發(fā)生崩解，排列不整齊，有大量炎癥細(xì)胞浸潤；針刺組和氟比洛芬酯組大鼠神經(jīng)細(xì)胞排列稍整齊，炎癥細(xì)胞浸潤減少，細(xì)胞輕度水腫。結(jié)果提示：針刺可改善腰椎后路減壓融合內(nèi)固定術(shù)后大鼠腰椎神經(jīng)損傷。

Akt/NF-κB信號通路在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用，LING D Y等[18]研究表明嗎啡能通過PI3K-Akt-NF-κB通路抑制炎癥微環(huán)境對慢性脛骨癌痛的促進作用。HE W等[19]研究表明穿心蓮內(nèi)酯可通過調(diào)節(jié)Notch1/Akt/NF-κB軸對結(jié)核分枝桿菌感染的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生抗炎作用。因此本研究通過蛋白印跡法檢測Akt/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達，結(jié)果表明模型組大鼠背根神經(jīng)節(jié)p-Akt和p-NF-κB p65蛋白相對表達量明顯升高，而針刺組和氟比洛芬酯組大鼠背根神經(jīng)節(jié)p-Akt和p-NF-κB p65蛋白相對表達量明顯降低。提示針刺可抑制Akt/NF-κB信號通路激活。

綜上所述，針刺可抑制腰椎后路減壓融合內(nèi)固定術(shù)后炎癥反應(yīng)，緩解疼痛，其可能是通過抑制Akt/NF-κB信號通路發(fā)揮作用。本研究結(jié)果可為針刺緩解腰椎間盤突出、腰椎管狹窄等腰椎疾病術(shù)后疼痛提供理論依據(jù)。