鐵包金按摩膏聯(lián)合刮法對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎模型兔關(guān)節(jié)軟骨IL-1β、TNF-α及A20蛋白表達(dá)的影響*

熊 杰，匡浩銘，鐘秀遠(yuǎn)，陳杰，沉琳玲，戎寬，匡建軍,3

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長沙 410000；3.湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，湖南 株洲 412012）

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）為臨床常見病[1]，其癥狀主要為膝關(guān)節(jié)腫脹、疼痛、活動(dòng)障礙等。單純西醫(yī)治療該病效果欠佳，且無法緩解患者的伴隨癥狀。隨著對(duì)中醫(yī)藥治療KOA的深入研究，加之中醫(yī)藥治療該病有“簡、效、廉”的優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用中醫(yī)藥防治KOA越來越受到重視。藥刮療法具有顯著的中醫(yī)特色，對(duì)骨科疾病防治有較好的作用[2]。課題組前期臨床研究證明，鐵包金按摩膏聯(lián)合刮法治療不同部位的骨關(guān)節(jié)炎均有較好的療效。鐵包金藥物刮痧治療肩周炎的總有效率為92.50%（37/40）[3]。鐵包金按摩膏藥刮法治療膝骨關(guān)節(jié)炎的總有效率為86.67%（26/30）[4]。但其作用機(jī)制不明確，限制了其在臨床的進(jìn)一步推廣與運(yùn)用。本實(shí)驗(yàn)以膝骨關(guān)節(jié)炎實(shí)驗(yàn)兔為模型，探索鐵包金按摩膏聯(lián)合刮法對(duì)實(shí)驗(yàn)兔膝關(guān)節(jié)軟組織中A20表達(dá)的影響，以探究鐵包金按摩膏聯(lián)合刮法的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6個(gè)月齡健康新西蘭實(shí)驗(yàn)兔40只，普通級(jí)，雌雄各半，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，購自湖南省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2020-0005。實(shí)驗(yàn)兔飼養(yǎng)于開放式動(dòng)物飼養(yǎng)室（湖南省中醫(yī)藥研究院動(dòng)物房），室溫控制在20～25 ℃，濕度50%～60%，12 h/12 h明暗周期，標(biāo)準(zhǔn)營養(yǎng)顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水。動(dòng)物日常護(hù)理及實(shí)驗(yàn)條件均符合《中華人民共和國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境及設(shè)施標(biāo)準(zhǔn)》。實(shí)驗(yàn)方案得到湖南省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 藥物與試劑 鐵包金按摩膏由湖南省中醫(yī)藥研究院制劑室生產(chǎn)，方藥組成：鐵包金50 g，大黃50 g，川烏25 g，草烏25 g，木瓜25 g，白芷25 g，木鱉子25 g，三棱25 g，莪術(shù)25 g，血竭10 g，木通25 g，當(dāng)歸25 g，肉桂25 g，赤芍25 g，透骨草25 g，乳香25 g，沒藥25 g，洋金花10 g。中藥材均采購于康美藥業(yè)股份有限公司，經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院藥劑科胥新元主任藥師鑒定均為2020年版《中華人民共和國藥典》收錄正品。木瓜蛋白酶（美國Genview公司，批號(hào)：GX-6024）；腫瘤壞死因子-α ELISA檢測(cè)試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司，批號(hào)：ARB13479）；白細(xì)胞介素-1β ELISA檢測(cè)試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司，批號(hào)：SBJ-R0024）；RIPA裂解液（中國長沙維世爾生物，批號(hào)：RA19060）；兔抗鼠A20（英國abcam公司，批號(hào)：AB9234）。

1.3 主要儀器 TS-92型搖床（江蘇其林貝爾儀器制造有限公司）；DYY-6C型恒溫箱（北京六一生物科技有限公司）；M199型切片刀（德國徠卡顯微系統(tǒng)股份有限公司）；YD-315型切片機(jī)（浙江金華益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司）；BMJ-A型包埋機(jī)（常州中威電子儀器）；BA210T顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）；H1650R型臺(tái)式冷凍離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)有限公司）；DYY-6C型電泳儀、DYCZ-24DN型電泳槽、DYCZ-40D型轉(zhuǎn)膜儀均購自北京六一生物科技有限公司；GL-88B型旋渦混合器（江蘇其林貝爾儀器制造有限公司）；JB-13型磁力攪拌器、PHS-3C型精密pH計(jì)均購自中國雷磁；BioPrep-24型生物樣品均質(zhì)儀（杭州奧盛儀器有限公司）。

1.4 造模與分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法從40只實(shí)驗(yàn)兔中選出8只（雌雄各半）作為正常組，僅常規(guī)飼養(yǎng)，不做處理。其余32只實(shí)驗(yàn)兔制作兔KOA模型。具體操作：分別將0.5 mL的2%木瓜蛋白酶水溶液于實(shí)驗(yàn)開始第1、4、7天注入實(shí)驗(yàn)兔右后肢膝關(guān)節(jié)腔進(jìn)行造模[5]。造模結(jié)束1周后，進(jìn)行膝關(guān)節(jié)Lequesne MG評(píng)分[6]，總分≥4分表示造模成功。造模成功后再將32只實(shí)驗(yàn)兔采用隨機(jī)數(shù)字表法分成模型組、刮法組、涂擦組、藥刮組，每組8只（雌雄各半）。

1.5 實(shí)驗(yàn)給藥 各組實(shí)驗(yàn)兔均常規(guī)飼養(yǎng)。根據(jù)《中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》中計(jì)算外用藥物等效劑量的方法，計(jì)算出涂擦組、藥刮組鐵包金按摩膏劑量為6.25 g/kg。造模后1周開始給藥，藥刮組實(shí)驗(yàn)兔在固定狀態(tài)下，腿部剃毛，涂上約12.5 g鐵包金按摩膏后用特制牛角刮痧板沿肢體方向繞膝關(guān)節(jié)部順時(shí)針以約70次/min的頻率刮痧，約3 min或刮至皮膚微發(fā)紅；刮法組實(shí)驗(yàn)兔在固定狀態(tài)下，以純凈水保持潤滑的前提下只行刮法，具體方法同藥刮法；涂擦組實(shí)驗(yàn)兔在固定狀態(tài)下，腿部剃毛，涂上約12.5 g鐵包金按摩膏。以上3組每周周一、周三、周五的09:00:00進(jìn)行干預(yù)，連續(xù)給藥4周。正常組、模型組實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)，不予干預(yù)。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 膝關(guān)節(jié)Lequesne MG評(píng)分 實(shí)驗(yàn)過程中觀察記錄各組實(shí)驗(yàn)兔的體毛色澤、飲食情況、活動(dòng)量及精神狀態(tài)等。末次給藥結(jié)束后1 d，使用Lequesne MG的膝關(guān)節(jié)級(jí)別評(píng)估方法評(píng)估各組實(shí)驗(yàn)兔右膝關(guān)節(jié)局部反應(yīng)、步態(tài)改變、關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍及腫脹程度等情況。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 Lequesne MG 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.6.2 Mankin評(píng)分 末次給藥結(jié)束后1 d，空氣栓塞法處死實(shí)驗(yàn)兔[7]，打開關(guān)節(jié)腔觀察膝關(guān)節(jié)軟骨關(guān)節(jié)面的形態(tài)學(xué)改變、滑膜狀態(tài)、關(guān)節(jié)腔積液情況、關(guān)節(jié)軟骨狀態(tài)。采集各組實(shí)驗(yàn)兔部分膝關(guān)節(jié)軟骨并制成切片，行番紅O-固綠軟骨染色法后，光鏡下觀測(cè)已切片、染色的內(nèi)、外髁的軟骨，按Mankin評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)表層軟骨細(xì)胞分裂增生程度、細(xì)胞排列情況、染色程度、潮線及血管翳生成情況進(jìn)行評(píng)分，并拍攝照片。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 Mankin 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.6.3 軟骨組織中炎癥因子水平 末次給藥結(jié)束后1 d，取出-70 ℃保存的軟骨組織，在1 mg軟骨組織中添加9 mg/L的生理鹽水，置于勻漿器內(nèi)制備勻漿液，5 000 g離心10 min后，收集上清液，利用ELISA試劑盒檢測(cè)TNF-α、IL-1β水平。

1.6.4 軟骨組織中A20表達(dá)水平 取軟骨組織，將50 mg軟骨組織放入研磨皿中裂解，將勻漿組織液12 000 g離心3 min，取上清液，95℃煮沸10 min變性，-20 ℃保存。采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。取20 μL蛋白樣品，加入5 μL的蛋白上樣緩沖液（6×）混勻，加熱5 min后冷卻；按預(yù)定的順序上樣、恒壓電泳，將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，脫脂牛奶封閉1 h，加入稀釋的一抗（兔抗鼠A20，稀釋度為1∶2 000）4 ℃孵育過夜；加入二抗羊抗兔IgG（稀釋度為1∶6 000）室溫孵育1 h，以β-actin為內(nèi)參；ECL顯影、曝光。最后掃描曝光后底片，用Quantity One專業(yè)灰度分析軟件進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組兔膝關(guān)節(jié)Lequesne MG評(píng)分比較 與正常組比較，模型組、刮法組、涂擦組及藥刮組兔膝關(guān)節(jié)Lequesne MG評(píng)分均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，刮法組、涂擦組及藥刮組兔膝關(guān)節(jié)Lequesne MG評(píng)分均明顯降低（P＜0.05）；刮法組兔膝關(guān)節(jié)Lequesne MG評(píng)分與涂擦組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；藥刮組兔膝關(guān)節(jié)Lequesne MG評(píng)分明顯低于刮法組、涂擦組（P＜0.05）。（見表3）

表3 各組實(shí)驗(yàn)兔膝關(guān)節(jié)Lequesne MG 評(píng)分比較（，分）

表3 各組實(shí)驗(yàn)兔膝關(guān)節(jié)Lequesne MG 評(píng)分比較（，分）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與刮法組比較，cP＜0.05；與涂擦組比較，dP＜0.05

2.2 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨病理學(xué)改變情況 正常組兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分布均勻，呈紅染；模型組兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分布不均勻，呈藍(lán)染；刮法組兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分布欠均勻，呈紅藍(lán)相間染色；涂擦組兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分布欠均勻，呈淡紅染；藥刮組兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分布較均勻，呈紅染。（見圖1）

與正常組比較，模型組、刮法組、涂擦組及藥刮組兔膝關(guān)節(jié)軟骨Mankin評(píng)分均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，刮法組、涂擦組及藥刮組兔膝關(guān)節(jié)軟骨Mankin評(píng)分均明顯降低（P＜0.05）；刮法組兔膝關(guān)節(jié)軟骨Mankin評(píng)分與涂擦組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；藥刮組兔膝關(guān)節(jié)軟骨Mankin評(píng)分明顯低于刮法組、涂擦組（P＜0.05）。（見表4）

表4 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織Mankin 評(píng)分比較（,分）

表4 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織Mankin 評(píng)分比較（,分）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與刮法組比較，cP＜0.05；與涂擦組比較，dP＜0.05

2.3 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-α、IL-1β水平比較 與正常組比較，模型組、刮法組、涂擦組及藥刮組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-α、IL-1β水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，刮法組、涂擦組及藥刮組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-α、IL-1β水平均明顯降低（P＜0.05）；刮法組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-α、IL-1β水平與涂擦組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；藥刮組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-α、IL-1β水平明顯低于刮法組、涂擦組（P＜0.05）。（見表5）

表5 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-α、IL-1β水平比較（，ng/L）

表5 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-α、IL-1β水平比較（，ng/L）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與刮法組比較，cP＜0.05；與涂擦組比較，dP＜0.05

2.4 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織中A20蛋白表達(dá)水平比較 與正常組比較，模型組、刮法組、涂擦組及藥刮組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織中A20表達(dá)均明顯下調(diào)（P＜0.05）；與模型組比較，刮法組、涂擦組及藥刮組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織中A20表達(dá)均明顯上調(diào)（P＜0.05）；刮法組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織中A20表達(dá)水平與涂擦組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；藥刮組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織中A20表達(dá)明顯高于刮法組、涂擦組（P＜0.05）。（見圖2、表6）

表6 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織中A20 蛋白表達(dá)水平比較（）

表6 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織中A20 蛋白表達(dá)水平比較（）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與藥刮組比較，cP＜0.05

3 討 論

KOA的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，一般認(rèn)為與遺傳、肥胖、勞動(dòng)過度等因素密切相關(guān)，但其具體發(fā)病機(jī)制尚不明確，近年來炎癥因子等介質(zhì)的表達(dá)成為主流學(xué)說之一。研究發(fā)現(xiàn)IL-1β和TNF-α表達(dá)的增加在KOA患者疾病發(fā)生發(fā)展的過程中起著重要作用[8]。IL-1β作為IL-1的一種亞型，是炎癥調(diào)節(jié)的起始因素。IL-1β通過與軟骨細(xì)胞膜上的IL-1受體相結(jié)合，干擾軟骨細(xì)胞的正常代謝活動(dòng)；同時(shí)可刺激軟骨細(xì)胞及滑膜合成基質(zhì)金屬蛋白酶，使軟骨基質(zhì)內(nèi)溶解蛋白分子的酶類數(shù)量增多，從而間接增強(qiáng)了對(duì)軟骨細(xì)胞的破壞。TNF-α可作用于軟骨細(xì)胞，阻止基質(zhì)大分子如蛋白多糖的生成，刺激軟骨降解酶如中性蛋白酶的生成、分泌，增加軟骨聚蛋白多糖的分解，從而誘發(fā)關(guān)節(jié)軟骨破壞。且IL-1β與TNF-α可相互協(xié)同裂解蛋白多糖及降解膠原片段，促進(jìn)軟骨基質(zhì)剝脫于骨質(zhì)而暴露[9]，從而加重關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)。核因子-κB（nuclear factorκB，NF-κB）是細(xì)胞內(nèi)一條重要信號(hào)通路，對(duì)于維持細(xì)胞的正常生理功能具有重要意義。其廣泛參與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，是導(dǎo)致KOA發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[10-11]。而鋅指蛋白A20可降低NF-κB抑制蛋白激酶復(fù)合物活性、抑制NF-κB抑制蛋白磷酸化過程，干預(yù)NF-κB激活合成釋放，影響下游炎癥通路[12-13]，從而影響KOA的疾病進(jìn)程。

KOA現(xiàn)代中醫(yī)命名為膝痹，《素問·痹論篇》有相關(guān)原文記載?，F(xiàn)代研究亦認(rèn)為骨關(guān)節(jié)痹證多為風(fēng)寒濕邪乘虛襲入骨節(jié)所致[14]。寒性凝滯，濕性重著，故易引起局部氣血運(yùn)行不暢，邪氣聚于骨節(jié)、肌肉、經(jīng)脈，以致痰瘀，瘀則不通，不通則痛。中醫(yī)治法則以祛風(fēng)除濕、散寒止痛、活血通絡(luò)等為主。

鐵包金按摩膏[15]是匡建軍臨床近三十年的經(jīng)驗(yàn)膏方，君藥為鐵包金，《中華本草》謂其根、莖、葉入藥有祛風(fēng)除濕、活血止痛的功效。鐵包金主要含有黃酮、苷類、木脂素、醌類及二聚體等化學(xué)成分。藥理研究表明其根與藤莖的提取物具有較好的保肝和清除自由基的生物活性[16]。川烏、草烏為臣藥，具有祛風(fēng)散寒除濕的功效。烏頭中的烏頭堿具有顯著抗炎、鎮(zhèn)痛作用[17-18]。肉桂亦為臣藥，能夠溫中補(bǔ)腎、散寒止痛，《本草綱目》謂其能堅(jiān)筋骨、通血脈、導(dǎo)百藥。肉桂揮發(fā)油主要成分桂皮醛有明顯的擴(kuò)張皮膚血管作用，可增加體表血流，升高體表溫度[19]。木瓜為佐藥，能舒筋活絡(luò)、祛風(fēng)除痹，是治療筋脈拘急的要藥。木瓜中的多糖能夠抗炎、抗氧化[20]。木鱉子亦為佐藥，能消腫散結(jié)。木鱉子皂苷有抗炎作用[21]。諸藥共奏祛風(fēng)除濕、活血通絡(luò)止痛之功效。刮法是中醫(yī)特色療法之一，通過刮法的物理作用，溫通局部腠理、脈絡(luò)[22]，再加以膏藥，增強(qiáng)藥物吸收的同時(shí)，加強(qiáng)療效。

本研究結(jié)果顯示鐵包金按摩膏聯(lián)合刮法可以改善KOA模型兔膝骨關(guān)節(jié)炎的癥狀，降低Lequesne MG、Mankin評(píng)分及軟骨組織TNF-α、IL-1β的水平，提高實(shí)驗(yàn)兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織中A20的表達(dá)，為鐵包金按摩膏聯(lián)合刮法治療KOA提供了實(shí)驗(yàn)。其作用機(jī)制可能與抑制TNF-α、IL-1β表達(dá)和促進(jìn)A20蛋白表達(dá)有關(guān)。但鐵包金按摩膏成分復(fù)雜，其有效成分及具體作用機(jī)制需進(jìn)一步探索研究。