活血消癭方調(diào)控Fas系統(tǒng)對(duì)結(jié)節(jié)性甲狀腺腫大鼠模型甲狀腺細(xì)胞凋亡的影響*

裴 迅，趙勇，李揚(yáng)，房璁璁，付暢

（湖北省中醫(yī)院/湖北省陳氏癭病學(xué)術(shù)流派傳承工作室，湖北 武漢 430074）

結(jié)節(jié)性甲狀腺腫是一種常見(jiàn)的甲狀腺疾病，多數(shù)患者無(wú)自覺(jué)癥狀，只有少數(shù)患者會(huì)出現(xiàn)頸前不適、腫塊壓迫感、呼吸和吞咽困難等癥狀[1]。中醫(yī)學(xué)并沒(méi)有結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的病名，主要根據(jù)其臨床表現(xiàn)將其歸類(lèi)為“癭瘤”“肉癭”等范疇[2]。目前，結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的發(fā)病率正在逐年增加，對(duì)于其相關(guān)實(shí)驗(yàn)和臨床研究也日益得到關(guān)注。臨床研究證實(shí)，使用西醫(yī)治療結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的手段有限，且具有副作用和并發(fā)癥[3]。因此，有必要探究療效顯著且副作用小的新療法。近年來(lái)，中藥治療結(jié)節(jié)性甲狀腺腫因具有穩(wěn)定、副作用小等優(yōu)點(diǎn)，逐漸得到廣泛的關(guān)注[4]?；钛`方治療結(jié)節(jié)性甲狀腺腫具有較為肯定的療效，且具有很好的安全性[5]，但具體藥物作用機(jī)制尚不明確。本研究擬通過(guò)構(gòu)建結(jié)節(jié)性甲狀腺腫大鼠模型以探究活血消癭方是否通過(guò)Fas系統(tǒng)參與調(diào)控甲狀腺細(xì)胞凋亡，以此闡明活血消癭方治療結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的機(jī)制，從而為中藥治療結(jié)節(jié)性甲狀腺腫提供新的思路和途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 5周齡健康SPF級(jí)SD雄性大鼠60只，體質(zhì)量（150±10）g，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（鄂）2015-0018。所有大鼠均在本院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心于恒溫（20 ℃）、恒濕（50%）、12 h晝夜循環(huán)的SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、進(jìn)水。本研究已得到湖北省中醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有實(shí)驗(yàn)操作均符合動(dòng)物倫理委員會(huì)要求，批號(hào)：20190312。

1.2 藥物與試劑 活血消癭方由蜣螂蟲(chóng)、土鱉蟲(chóng)、蜈蚣、桃仁、莪術(shù)、貓爪草、王不留行、柴胡等組成。上述藥材均由本院藥劑科提供，取同一批次壓片成型前藥粉，使用生理鹽水分別配制成質(zhì)量濃度為50、100和200 g/L的活血消癭方溶液。丙基硫氧嘧啶（propylthiouracil，PTU）（批號(hào)：P3700000）、左甲狀腺素鈉片（商品名：優(yōu)甲樂(lè)）（批號(hào)：PHR2880）、水合氯醛（批號(hào)：47335-U）均購(gòu)自美國(guó)默克公司；蘇木素-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色試劑盒（批號(hào)：G1120-100）、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)：PC0020）均購(gòu)自北京Solarbio公司；TUNEL試劑盒（批號(hào)：QIA33）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；促甲狀腺激素（thyrotropin，TSH）ELISA試劑盒（批號(hào)：IB-E14160）、游離三碘甲腺原氨酸（free triiodothyronine，F(xiàn)T3）ELISA試劑盒（批號(hào)：IB-E1490）、游離甲狀腺素（free thyroxine，F(xiàn)T4）ELISA試劑盒（批號(hào)：IB-E12117）均購(gòu)自江西艾博因公司；一抗：Fas配體（Fas Ligand，F(xiàn)asL，31 kDa）（批號(hào)：ab186671）、Fas（38 kDa）（批號(hào)：ab110021）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8（Caspase-8，55 kDa）（批號(hào)：ab25901）、Caspase-3（32 kDa）（批號(hào)：ab32351）和GAPDH（36 kDa）（批號(hào)：ab8245）均購(gòu)自英國(guó)abcam公司；高敏型ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：E412-01）、細(xì)胞/組織總RNA提取試劑（Trizol法）（批號(hào)：R401-01）均購(gòu)自南京Vazyme公司；通用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：YT9036）購(gòu)自北京YITA公司；BlazeTaqTMOne-StepGreen RT-qPCR試劑盒（批號(hào)：QP071）購(gòu)自美國(guó)Gene Copoeia公司。

1.3 主要儀器 Voluson E8型彩色多普勒超聲診斷系統(tǒng)（美國(guó)GE公司）；RM2235型病理切片機(jī)（美國(guó)Leica公司）；BX51型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；1600型全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)系統(tǒng)（上海Tanon公司）；9600 Plus型熒光定量PCR系統(tǒng)（江蘇LineGene公司）。

1.4 造模與分組 所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、活血消癭方低劑量組、活血消癭方中劑量組、活血消癭方高劑量組，每組10只?？瞻讓?duì)照組大鼠按照1 mL/100 g體質(zhì)量灌胃生理鹽水，其余各組大鼠均按照1 mL/100 g體質(zhì)量灌胃0.1%PTU溶液[6]（生理鹽水配制）造模。每天09:00:00灌胃1次，連續(xù)灌胃8周。所有大鼠于造模結(jié)束后通過(guò)彩色多普勒超聲發(fā)現(xiàn)甲狀腺兩側(cè)不規(guī)則變化，表面粗糙，呈現(xiàn)多個(gè)大小不一的結(jié)節(jié)，且結(jié)節(jié)回聲強(qiáng)度不同，即可判斷造模成功。

1.5 實(shí)驗(yàn)給藥 自第9周起，每組按照1 mL/100 g體質(zhì)量灌胃不同藥物。陽(yáng)性對(duì)照組大鼠灌胃給予0.1 mg/L的優(yōu)甲樂(lè)[7]；模型組大鼠灌胃給予雙蒸水；活血消癭方低、中、高劑量組分別灌胃給予50、100、200 g/L的活血消癭方溶液。取大鼠與人的等效劑量折算系數(shù)k=0.18，雙蒸水配制，分別相當(dāng)于成人臨床用藥劑量的1倍、2倍、4倍。每天09:00:00灌胃1次，連續(xù)灌胃4周[6]。空白對(duì)照組大鼠正常飼養(yǎng)，不予任何處理。

1.6 觀(guān)察指標(biāo)

1.6.1 留取血液、組織標(biāo)本 灌胃4周后，大鼠禁食12 h，禁水2 h。給予10%水合氯醛腹腔麻醉成功后，使用剪刀在大鼠甲狀軟骨上方剪斷，提起大鼠，將血液收集至5 mL促凝管中，采血量為2 mL。隨后，將大鼠固定在鼠臺(tái)上切開(kāi)皮膚，暴露氣管，找到甲狀腺組織，完整分離后去除周?chē)渌M織，稱(chēng)量組織質(zhì)量。每只大鼠取左側(cè)甲狀腺一部分，浸泡于4%多聚甲醛緩沖液中用于制作組織切片；同時(shí)，取大鼠右側(cè)甲狀腺一部分保存于標(biāo)記好的2 mL凍存管中，置于-20 ℃冰箱中，用于后期RT-PCR和Western blotting檢測(cè)。

1.6.2 制備血清和組織切片 將收集到的血液靜置2 h后，低溫離心10 min分離血清，各收集0.5 mL血清于1.5 mL EP管中，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?；將浸泡于多聚甲醛緩沖液中固定24 h后的甲狀腺組織取出，在通風(fēng)櫥中修復(fù)平整，經(jīng)脫水、包埋等一系列流程制備組織切片，用于進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色、TUNEL染色和免疫組織化學(xué)研究。

1.6.3 血清TSH、FT3和FT4含量 嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清TSH、FT3和FT4含量。

1.6.4 大鼠甲狀腺病理學(xué)變化 將組織切片脫蠟后依次使用蘇木素染色5 min、伊紅染色3 min，脫水，封片，通過(guò)顯微鏡鏡檢，采集圖像分析。

1.6.5 大鼠甲狀腺細(xì)胞凋亡情況 將組織切片脫蠟后依次按照TUNEL試劑盒方法操作進(jìn)行TUNEL染色。顯微鏡拍照后使用Image-Pro Plus 6.0軟件對(duì)圖片進(jìn)行分析。凋亡細(xì)胞呈棕褐色，細(xì)胞核固縮，呈圓形、新月形或不規(guī)則形。凋亡指數(shù)=單個(gè)視野下凋亡細(xì)胞數(shù)量/單個(gè)視野下細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.6.6 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)FasL、Fas、Caspase-8、Caspase-3表達(dá) 將制備好的組織切片脫蠟后置于EDTA緩沖液中進(jìn)行抗原修復(fù)，添加5%牛血清白蛋白封閉30 min，后添加一抗FasL、Fas、Caspase-8、Caspase-3在4 ℃下覆蓋組織孵育過(guò)夜。添加二抗4 ℃孵育50 min，添加DAB溶液顯色。顯色完全后使用蘇木素復(fù)染后脫水干燥，使用中性樹(shù)膠封固。顯微鏡拍照后使用Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算平均光密度（optical density，OD）值。

1.6.7 Western blotting法檢測(cè)FasL、Fas、Caspase-8、Caspase-3蛋白表達(dá)水平 使用蛋白質(zhì)裂解緩沖液裂解甲狀腺組織提取總蛋白；BCA法對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析。取蛋白質(zhì)電泳后轉(zhuǎn)膜、封閉，添加一抗FasL、Fas、Caspase-8、Caspase-3、GAPDH在4 ℃孵育過(guò)夜。添加二抗室溫孵育2 h，使用ECL顯影后經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。使用Image-Pro Plus 6.0軟件分析各個(gè)蛋白條帶的灰度值。

1.6.8 RT-PCR法檢測(cè)FasL mRNA、Fas mRNA、Caspase-8 mRNA、Caspase-3 mRNA表達(dá)水平 使用Trizol法提取各組甲狀腺組織RNA。經(jīng)反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，以cDNA為模板通過(guò)BlazeTaqTMOne-StepGreen RT-qPCR試劑盒和熒光定量PCR儀進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。使用2-ΔΔct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。引物序列見(jiàn)表1。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清甲狀腺功能指標(biāo)含量及甲狀腺組織質(zhì)量比較 與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中TSH含量明顯升高（P＜0.05），F(xiàn)T3、FT4含量及甲狀腺組織質(zhì)量均明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和活血消癭方低、中、高劑量組大鼠血清中TSH含量均明顯降低（P＜0.05），F(xiàn)T3、FT4含量及甲狀腺組織質(zhì)量均明顯升高（P＜0.05）；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，活血消癭方低、中劑量組大鼠血清中TSH含量均明顯升高，F(xiàn)T3、FT4含量及甲狀腺組織質(zhì)量均明顯降低（P＜0.05）；活血消癭方高劑量組大鼠血清中TSH、FT3、FT4含量及甲狀腺組織質(zhì)量與陽(yáng)性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見(jiàn)表2）

表2 各組大鼠血清甲狀腺功能指標(biāo)含量及甲狀腺組織質(zhì)量比較（）

注：與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，cP＜0.05；與活血消癭方低劑量組比較，dP＜0.05；與活血消癭方中劑量組比較，eP＜0.05

2.2 各組大鼠甲狀腺組織結(jié)構(gòu)變化 空白對(duì)照組大鼠甲狀腺組織的濾泡排列規(guī)則整齊，大小均一，多呈球形或卵圓形，間質(zhì)無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠甲狀腺組織的濾泡萎縮，上皮細(xì)胞高度腫脹，間質(zhì)存在大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；陽(yáng)性對(duì)照組大鼠濾泡排列整齊，且呈現(xiàn)球形或卵圓形，上皮細(xì)胞腫脹和間質(zhì)間炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況明顯改善；活血消癭方低劑量組大鼠甲狀腺組織濾泡萎縮減少，大小不一，上皮細(xì)胞腫脹減弱，且存在較多的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；活血消癭方中劑量組大鼠甲狀腺組織濾泡萎縮情況得到一定的改善，上皮細(xì)胞腫脹和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)也有一定減少；活血消癭方高劑量組大鼠甲狀腺組織濾泡萎縮情況基本改善，且排列較為整齊，上皮細(xì)胞腫脹和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯改善。（見(jiàn)圖1）

2.3 各組大鼠甲狀腺細(xì)胞凋亡情況 凋亡細(xì)胞呈棕褐色，細(xì)胞核固縮，呈圓形、新月形或不規(guī)則形。與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠甲狀腺細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和活血消癭方低、中、高劑量組大鼠甲狀腺細(xì)胞凋亡指數(shù)均明顯升高（P＜0.05）；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，活血消癭方低、中劑量組大鼠甲狀腺細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯降低（P＜0.05）；活血消癭方高劑量組大鼠甲狀腺細(xì)胞凋亡指數(shù)與陽(yáng)性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見(jiàn)圖2、表3）

表3 各組大鼠甲狀腺細(xì)胞凋亡指數(shù)比較（）

表3 各組大鼠甲狀腺細(xì)胞凋亡指數(shù)比較（）

注：與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，cP＜0.05；與活血消癭方低劑量組比較，dP＜0.05；與活血消癭方中劑量組比較，eP＜0.05

2.4 各組大鼠甲狀腺組織FasL、Fas、Caspase-8和Caspase-3蛋白表達(dá)（免疫組化）比較 與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠甲狀腺組織中FasL、Fas、Caspase-8和Caspase-3的平均光密度值均明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和活血消癭方低、中、高劑量組大鼠甲狀腺組織中FasL、Fas、Caspase-8和Caspase-3的平均光密度值均明顯升高（P＜0.05）；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，活血消癭方低、中劑量組大鼠甲狀腺組織中FasL、Fas、Caspase-8和Caspase-3的平均光密度值均明顯降低（P＜0.05）；活血消癭方高劑量組大鼠甲狀腺組織中FasL、Fas、Caspase-8和Caspase-3的平均光密度值與陽(yáng)性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見(jiàn)圖3、表4）

表4 各組大鼠甲狀腺組織FasL、Fas、Caspase-8 和Caspase-3 的平均光密度值比較（）

表4 各組大鼠甲狀腺組織FasL、Fas、Caspase-8 和Caspase-3 的平均光密度值比較（）

注：與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，cP＜0.05；與活血消癭方低劑量組比較，dP＜0.05；與活血消癭方中劑量組比較，eP＜0.05

2.5 各組大鼠甲狀腺組織FasL、Fas、Caspase-8和Caspase-3蛋白表達(dá)（Western blotting）比較 與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠甲狀腺組織中FasL、Fas、Caspase-8和Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和活血消癭方低、中、高劑量組大鼠甲狀腺組織中FasL、Fas、Caspase-8和Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高（P＜0.05）；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，活血消癭方低、中劑量組大鼠甲狀腺組織中FasL、Fas、Caspase-8和Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）；活血消癭方高劑量組大鼠甲狀腺組織中FasL、Fas、Caspase-8和Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量與陽(yáng)性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見(jiàn)圖4、表5）

表5 各組大鼠甲狀腺組織FasL、Fas、Caspase-8 和Caspase-3 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（）

表5 各組大鼠甲狀腺組織FasL、Fas、Caspase-8 和Caspase-3 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（）

注：與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，cP＜0.05；與活血消癭方低劑量組比較，dP＜0.05；與活血消癭方中劑量組比較，eP＜0.05

2.6 各組大鼠甲狀腺組織FasL mRNA、Fas mRNA、Caspase-8 mRNA、Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠甲狀腺組織中FasL mRNA、Fas mRNA、Caspase-8 mRNA、Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和活血消癭方低、中、高劑量組大鼠甲狀腺組織中FasL mRNA、Fas mRNA、Caspase-8 mRNA、Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯升高（P＜0.05）；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，活血消癭方低、中劑量組大鼠甲狀腺組織中FasL mRNA、Fas mRNA、Caspase-8 mRNA、Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）；活血消癭方高劑量組大鼠甲狀腺組織中FasL mRNA、Fas mRNA、Caspase-8 mRNA、Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量與陽(yáng)性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見(jiàn)表6）

表6 各組大鼠甲狀腺組織FasL mRNA、Fas mRNA、Caspase-8 mRNA、Caspase-3 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較（）

表6 各組大鼠甲狀腺組織FasL mRNA、Fas mRNA、Caspase-8 mRNA、Caspase-3 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較（）

注：與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，cP＜0.05；與活血消癭方低劑量組比較，dP＜0.05；與活血消癭方中劑量組比較，eP＜0.05

3 討 論

結(jié)節(jié)性甲狀腺腫是臨床上常見(jiàn)的結(jié)節(jié)性甲狀腺疾病之一，多數(shù)結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者無(wú)明顯臨床表現(xiàn)，常因合并頸部腫大、甲狀腺功能異?；虍a(chǎn)生壓迫感被發(fā)現(xiàn)[8]。隨著近年來(lái)超聲檢查的普及，多數(shù)患者可通過(guò)體檢被發(fā)現(xiàn)[9]。雖然結(jié)節(jié)性甲狀腺多為良性結(jié)節(jié)，但患者一方面因擔(dān)心結(jié)節(jié)繼續(xù)增大需接受手術(shù)治療，另一方面則因擔(dān)心其惡變，嚴(yán)重困擾患者的生活。因此，控制結(jié)節(jié)的增大及阻止其惡化是當(dāng)前治療的關(guān)鍵。若能明確結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的具體發(fā)生分子機(jī)制，不僅可以為早期診斷提供支持，而且可以為研制針對(duì)性的干預(yù)措施提供幫助。

活血消癭方是我院陳如泉治療結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的經(jīng)驗(yàn)方，具有活血化痰、消癭散結(jié)的功效[10]。吳淑瓊等[11-12]研究發(fā)現(xiàn)，活血消癭方治療結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的顯著效果，且不良反應(yīng)較少。然而，活血消癭方是一種由多成分組成的中藥復(fù)方制劑，在體內(nèi)具有復(fù)雜的代謝過(guò)程，其對(duì)藥物引起的動(dòng)物結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的作用機(jī)制尚不清楚。因此，選擇同等條件下的動(dòng)物模型研究更具有可信度。目前常用的甲狀腺腫造模方法很多，其中抗甲狀腺藥物誘導(dǎo)的甲狀腺腫是一種較為穩(wěn)定、可靠的方法[13]。此外，鼠類(lèi)是常用的造模動(dòng)物，因小鼠甲狀腺體積過(guò)小，為得到足夠的標(biāo)本量，本研究選擇用大鼠作為研究對(duì)象，同時(shí)由于雌激素對(duì)甲狀腺細(xì)胞的功能具有一定的影響，故本實(shí)驗(yàn)選擇雄性大鼠造模。本研究使用抗甲狀腺藥物PTU誘導(dǎo)結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的方法造模。結(jié)果顯示，結(jié)節(jié)性甲狀腺腫大鼠血清中TSH含量明顯升高，F(xiàn)T3、FT4含量及甲狀腺組織質(zhì)量明顯降低，而活血消癭方可降低結(jié)節(jié)性甲狀腺腫大鼠血清中TSH含量，升高FT3、FT4含量及增加甲狀腺組織質(zhì)量，且呈劑量依賴(lài)性。研究證實(shí)，TSH、FT3、FT4是甲狀腺的主要功能指標(biāo)，其水平變化對(duì)于甲狀腺疾病診斷具有重要意義[14]。結(jié)合本研究結(jié)果，推測(cè)活血消癭方可明顯改善甲狀腺功能。同時(shí)，本研究通過(guò)對(duì)甲狀腺組織結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，活血消癭方可明顯減輕結(jié)節(jié)性甲狀腺腫大鼠的甲狀腺組織結(jié)構(gòu)改變，表明活血消癭方可有效改善甲狀腺結(jié)構(gòu)及功能，且療效隨著劑量的升高而呈現(xiàn)一定的上升趨勢(shì)。

細(xì)胞凋亡是一個(gè)自然發(fā)生的程序性細(xì)胞死亡過(guò)程，在成年組織的發(fā)展和穩(wěn)態(tài)中具有重要作用，細(xì)胞凋亡可以清除無(wú)用、多余、有害的細(xì)胞，而異常的細(xì)胞凋亡則會(huì)導(dǎo)致一系列疾病的發(fā)生[15]。目前研究表明，活血消癭方治療甲狀腺腫主要是通過(guò)促進(jìn)甲狀腺細(xì)胞凋亡或控制甲狀腺細(xì)胞增殖實(shí)現(xiàn)的[16]?；钛`方可通過(guò)調(diào)控結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者血清相關(guān)生長(zhǎng)因子的水平抑制甲狀腺濾泡細(xì)胞增生[11]，且可通過(guò)調(diào)控凋亡相關(guān)分子可溶性Fas、FasL誘導(dǎo)甲狀腺細(xì)胞凋亡，縮小甲狀腺結(jié)節(jié)直徑，從而達(dá)到治療效果[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，活血消癭方不僅可以提高結(jié)節(jié)性甲狀腺腫大鼠甲狀腺細(xì)胞凋亡指數(shù)，而且可有效促進(jìn)Fas、FasL、Caspase-8、Caspase-3蛋白和mRNA表達(dá)水平。Fas屬于腫瘤壞死因子和神經(jīng)生長(zhǎng)受體超家族，在調(diào)控細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了重要作用。Fas與其天然配體FasL共同構(gòu)成Fas系統(tǒng)[17]。其中，F(xiàn)as是一種位于細(xì)胞表面的Ⅰ型跨膜蛋白，可通過(guò)與FasL結(jié)合形成一種蛋白復(fù)合體進(jìn)而激活凋亡起始者Caspase-8引發(fā)Caspase蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終激活Caspase-3誘發(fā)細(xì)胞凋亡[18]。本研究結(jié)果表明，活血消癭方可通過(guò)激活Fas系統(tǒng)誘發(fā)Caspase-8、Caspase-3活化，進(jìn)而促進(jìn)結(jié)節(jié)性甲狀腺腫大鼠甲狀腺細(xì)胞凋亡。

本研究通過(guò)活血消癭方干預(yù)PTU誘導(dǎo)的結(jié)節(jié)性甲狀腺腫大鼠，從Fas系統(tǒng)調(diào)控甲狀腺細(xì)胞凋亡角度探究該方的作用機(jī)制，為結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的中醫(yī)治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。然而，本研究尚存在一定的局限性。首先，由于知識(shí)的局限性和片面性，可能對(duì)部分理論和知識(shí)的理解不夠深刻，所得的結(jié)論存在一定的偏差；其次，細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制極其復(fù)雜，多個(gè)通路可以發(fā)生交互作用，共同形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。雖然研究證實(shí)活血消癭方參與調(diào)控Fas系統(tǒng)，但也可能僅是一個(gè)初步的發(fā)現(xiàn)。鑒于以上不足，以后的研究還須不斷完善、修正活血消癭方的治療機(jī)制，得出更令人信服的結(jié)論。