原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者p53基因突變的特征和臨床意義

李艷婷，楊 志

原發(fā)性肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是我國常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，也是目前預(yù)后最差的癌癥之一。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國2020年新增的HCC患者數(shù)占全球新增HCC患者數(shù)的45.3%，而在由癌癥引起的死亡數(shù)排名中，HCC排名第2位[1]。在我國，HBV感染引起的肝硬化是導(dǎo)致HCC的主要原因[2]。研究表明，HBV感染者發(fā)生HCC風(fēng)險較非HBV感染者增加了20倍[3]，而在HCC患者中，有85%～90%的患者均由HBV感染引起的肝硬化進(jìn)展所致[4]，且在確診時多數(shù)已經(jīng)進(jìn)入中晚期。盡管目前針對HCC的綜合治療手段已經(jīng)取得較大進(jìn)展，但該病仍有較高的復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率。因此，進(jìn)一步探索慢性乙型肝炎肝硬化患者進(jìn)展為HCC的作用機制，有可能為慢性乙型肝炎肝硬化患者癌變的早期診斷和治療提供新的思路。p53基因是目前研究最為廣泛的抑癌基因之一。研究證實，人體p53蛋白表達(dá)水平降低可明顯增加慢性乙型肝炎肝硬化相關(guān)的肝細(xì)胞癌發(fā)生風(fēng)險，是HBV誘發(fā)HCC的重要機制[5]。我國既往研究也表明，p53第4外顯子72位密碼子（p53 Arg72Pro）基因多態(tài)性是中國人群HCC發(fā)病的風(fēng)險因素之一[6]。然而，目前關(guān)于p53 Arg72Pro基因多態(tài)性與HCC的相關(guān)性研究仍十分有限。本研究觀察了HCC患者p53 Arg72Pro的突變情況，并分析不同突變類型與患者臨床特征和相關(guān)血清特異性腫瘤標(biāo)志物的關(guān)系及其對預(yù)后的影響，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 對象 選取秦皇島市第三醫(yī)院2019年1月1日—2020年4月30日收治的慢性乙型肝炎肝硬化和HCC患者各120例，分別作為慢性乙型肝炎肝硬化組和HCC組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①HCC患者臨床診斷符合《原發(fā)性肝癌診療指南（2022年版）》[7]中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)；②HCC患者均由慢性乙型肝炎肝硬化進(jìn)展所致或HCC確診前經(jīng)歷慢性乙型肝炎肝硬化病理階段；③患者首次就診，就診前未行手術(shù)、化療或放射性治療；④患者年齡≥18周歲；⑤慢性乙型肝炎肝硬化患者臨床診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015年更新版）》[8]中的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并有梅毒、結(jié)核或獲得性人類免疫缺陷性疾病等傳染性或自身免疫障礙性疾病患者；②伴有肝外惡性腫瘤或轉(zhuǎn)移性肝癌者；③臨床資料數(shù)據(jù)不全或缺失者。另選取同期于我院行體格檢查的120例健康體檢者作為健康對照組。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會審查并批準(zhǔn)同意（科教第2021-3號），所有研究對象入組前均簽訂知情同意書。

1.2 p53 Arg72Pro基因多態(tài)性檢測方法

1.2.1 外周血基因組DNA提取 所有研究對象于入組當(dāng)天抽取靜脈血5～10 ml，靜置30 min后，以3000 r/min離心10 min，分離上層血清置于EP管中，做好標(biāo)記，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用由上海語純生物科技有限公司提供的血液基因組提取試劑盒提取患者DNA用于檢測p53 Arg72Pro的基因型。

1.2.2 引物設(shè)計 參照Malakar等[9]研究，設(shè)計p53 Arg72Pro引物序列，其中上游引物序列為5’-TTGCCGTCCCAAGCAATGGATGA-3’，下游引物序列為5’-TCTGGGAAGGGACAGAAGATGAC-3’，預(yù)計擴(kuò)增DNA片段長度為199 bp。

1.2.3 PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件設(shè)定 PCR擴(kuò)增體系，包括 DNA 模板 5.0 μl，上下游引物各 2.0 μl，Mix Taq 酶 0.5 μl，4 × dNTP 4.0 μl，buあer 5.0 μl，三蒸水31.5 μl，共計50.0 μl。將上述反應(yīng)體系與混勻器快速混勻后，放入PCR儀中，進(jìn)行如下循環(huán)：首先預(yù)變性94 ℃，2 min；然后，變性94 ℃ 30 s，退火60 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 1 min，共計50個循環(huán)；最后72 ℃下延伸10 min，4 ℃保存。

1.2.4 基因多態(tài)性結(jié)果鑒定 取10 μl p53 Arg72Pro PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與10 μl限制性內(nèi)切酶BstUI （New England Biolabs公司）于60 ℃下溫育過夜，加入到3.0%瓊脂糖凝膠上樣孔，以5 V/cm電泳30 min后在凝膠成像系統(tǒng)中可觀察到3種條帶（即不同基因型），對電泳結(jié)果進(jìn)行攝像并保存。

1.3 HBV DNA檢測 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）法檢測HCC患者HBV DNA載量，檢測試劑盒和PCR擴(kuò)增儀分別購自東北制藥集團(tuán)遼寧生物醫(yī)藥有限公司和上海宏石醫(yī)療科技有限公司。具體過程為：①核酸提取，吸取50 μl血清樣本并加入提取液震蕩混勻，于100 ℃下金屬浴10 min后，11 000 r/min離心10 min，抽取上清液待用；②qRT-PCR檢測，配置PCR反應(yīng)液 36 μl（包括 35.6 μl HBV 反應(yīng)混合液和 0.4 μl Taq酶），抽取2 μl分別加入待測樣本、陽性對照和陰性對照中，混勻后瞬時離心，置于PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增，反應(yīng)條件為以 95 ℃ 3 min、94 ℃15 s、60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)，記錄檢測結(jié)果。以HBV DNA≥10.00+102copies/ml 作為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)[10]。

1.4 外周血AFP-L3、GP73及DCP水平檢測 采用化學(xué)發(fā)光法檢測HCC患者血清特異性腫瘤標(biāo)志物甲胎蛋白異質(zhì)體（alpha-fetoprotein L3,AFP-L3）、高爾基糖蛋白-73（golgiprotein 73, GP73）、 異 常 凝 血 酶 原（des-γ-carboxyprothrombin, DCP）水平，檢測試劑盒和全自動化學(xué)發(fā)光分析儀均由北京熱景生物技術(shù)股份有限公司提供。所有觀察指標(biāo)檢測過程嚴(yán)格按照試劑盒和儀器說明書步驟進(jìn)行。

1.5 隨訪 對所有HCC出院患者進(jìn)行電話或門診隨訪，隨訪截止日期為2022年4月30日，記錄隨訪患者死亡信息，并計算患者生存率。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計數(shù)資料采用頻數(shù)和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗。連續(xù)性數(shù)值變量呈正態(tài)分布，采用±s表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，3組間比較采用單因素方差分析，若3組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，則采用LSD-t檢驗進(jìn)行兩兩比較。計算3組間等位基因的分布頻率，通過χ2檢驗，分析是否符合Hard-Weinberg遺傳平衡定律。應(yīng)用多項分類 Logistic回歸分析計算相對危險度（以O(shè)R值表示）和95% CI。以α=0.05作為顯著性檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 基本情況 HCC組男性84例（70.0%），女性36例（30.0%），年齡范圍41～68歲，平均（54.18±10.94）歲。慢性乙型肝炎肝硬化組男性80例（66.7%），女性40例（33.3%），年齡范圍42～65歲，平均（55.12±10.07）歲。健康對照組男性77例（64.2%），女性43例（35.8%），年齡范圍34～68歲，平均（52.43±9.80）歲。各組之間性別和年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。詳見表1。

表1 3組患者基本資料比較（ ±s）Table 1 Comparison of basic data in 3 groups ( ±s)

表1 3組患者基本資料比較（ ±s）Table 1 Comparison of basic data in 3 groups ( ±s)

注：*. F值

項目 HCC組(n=120) 慢性乙型肝炎肝硬化組(n=120) 健康對照組(n=120) F/χ2值 P值年齡 (歲 ) 54.18±10.94 55.12±10.07 52.43±9.80 0.628* 0.122性別[例(%)]0.929 0.628男84 (70.0) 80 (66.7) 77 (64.2)女36 (30.0) 40 (33.3) 43 (35.8)

2.2 p53 Arg72Pro PCR擴(kuò)增和電泳結(jié)果 p53 Arg72Pro經(jīng)PCR擴(kuò)增、BstUI酶切和電泳后，可觀察到3種電泳條帶，第1泳道為Pro/Pro純合子，只有366 bp 1個片段；第2泳道為Arg/Arg純合子，分別產(chǎn)生215 bp和151 bp 2個片段；第3泳道為Pro/Arg雜合子，共產(chǎn)生了366 bp、215 bp和151 bp 3個片段。詳見圖1。

圖1 經(jīng)PCR擴(kuò)增和BstUI酶切后p53 Arg72Pro電泳圖Figure 1 The electrophoregram of p53 Arg72Pro after PCR amplification and BstUI digestion

2.3 p53 Arg72Pro等位基因和基因型分析 p53 Arg72Pro Arg等位基因在HCC組、慢性乙型肝炎肝硬化組和健康對照組的分布頻率分別為45.8%、59.6%和62.9%，Pro等位基因在上述各組的分布頻率分別為54.2%、40.4%和37.1%。經(jīng)χ2檢驗，3組基因型分布頻率符合Hard-Weinberg平衡定律（HCC組：χ2=3.104，P=0.078；慢性乙型肝炎肝硬化組：χ2=0.973，P=0.324；健康對照組：χ2=0.039，P=0.844）。將HCC組分別與慢性乙型肝炎肝硬化組和健康對照組比較，當(dāng)以Arg/Arg基因型作為對照時，Pro/Pro基因型者發(fā)生HCC的風(fēng)險分別升高了1.916和2.250倍（P均＜0.05）；當(dāng)以Arg等位基因作為對照時，攜帶Pro等位基因者發(fā)生HCC的風(fēng)險分別 升高了1.353和1.427倍（P均＜0.05）。詳見表2。

表2 p53 Arg72Pro在3組中的基因型分布[例（%）]Table 2 Distribution of p53 Arg72Pro genotypes in 3 groups [cases(%)]

2.4 不同p53 Arg72Pro基因型HCC患者臨床特征比較 3種p53 Arg72Pro基因型HCC患者間，年齡、巴塞羅那臨床肝癌（Barcelona clinic liver cancer, BCLC）分期和是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，Pro/Pro型HCC患者發(fā)病年齡明顯小于Arg/Pro型和Arg/Arg型患者，而BCLC分期為C/D期和伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者比例明顯高于Arg/Pro型和Arg/Arg型患者（P均＜0.05）。詳見表3。

表3 3種p53 Arg72Pro基因型HCC患者臨床特征比較Table 3 Comparison of clinical features of 3 p53 Arg72Pro genotypes in HCC patients

2.5 不同p53 Arg72Pro基因型HCC患者HBV DNA載量和血清特異性腫瘤標(biāo)志物比較 3種p53 Arg72Pro基因型HCC患者間，血清特異性腫瘤標(biāo)志物AFP-L3、GP73、DCP水平和HBV DNA陽性率比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。其中，Pro/Pro型患者HBV DNA陽性率明顯高于Arg/Arg型，血清特異性腫瘤標(biāo)志物AFP-L3、GP73、DCP水平均明顯高于Arg/Arg型和Arg/Pro型患者，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。詳見表4。2.6 不同p53 Arg72Pro基因型HCC患者生存率比較 對所有HCC患者進(jìn)行隨訪，隨訪時間為2～24個月，中位隨訪時間為11個月。隨訪期間死亡38例，無患者失訪。其中，Arg/Arg型患者死亡5例，生存率為83.3%，Arg/Pro型和Pro/Pro型患者死亡33例，生存率為63.3%，不同p53 Arg72Pro基因型患者間生存率比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.159，P=0.041）。詳見圖2。

表4 3種p53 Arg72Pro基因型HCC患者HBV DNA陽性率和血清特異性腫瘤標(biāo)志物比較Table 4 Comparison of HBV DNA positive rates and serum tumor markers of 3 p53 Arg72Pro genotypes in HCC patients

圖2 3種p53 Arg72Pro基因型HCC患者生存曲線Figure 2 Survival curve of HCC patients with 3 p53 Arg72Pro genotypes

3 討 論

HBV感染是HCC的重要誘因，患者多經(jīng)歷慢性乙型肝炎肝硬化等階段，其癌變的進(jìn)展可涉及多個病理過程[11-12]。然而，目前關(guān)于慢性乙型病毒性肝炎肝硬化癌變的具體分子機制仍不完全清楚。研究發(fā)現(xiàn)，并非所有患者均可進(jìn)展為HCC，而即使對于癌變患者，其癌變的進(jìn)展時間也存在較大差異[13]。這提示部分患者基因易感性可能在慢性乙型肝炎肝硬化癌變的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。p53基因位于染色體17p13.1，是目前研究最為廣泛的腫瘤抑制基因之一，該基因參與了DNA損傷修復(fù)，并具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡功能，是維持人類基因組穩(wěn)定的重要基因[14]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，p53基因突變與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。其中，位于72位密碼子的CGC/CCC主要編碼精氨酸和脯氨酸，具有單核苷酸多態(tài)性，可明顯增加惡性腫瘤的發(fā)生風(fēng)險[15-16]。然而，目前關(guān)于p53基因是否參與了慢性乙型肝炎肝硬化患者癌變的過程仍然存在一定爭議。早期有國外學(xué)者研究認(rèn)為p53 Arg72Pro基因多態(tài)性與HCC之間并無統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性[17]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，p53 Arg72Pro基因多態(tài)性不僅與慢性乙型肝炎肝硬化患者的病毒感染狀態(tài)顯著相關(guān)，且可明顯增加慢性乙型肝炎肝硬化進(jìn)展為HCC的風(fēng)險[18-19]。國內(nèi)雖有學(xué)者得到類似的結(jié)論[20]，但目前p53 Arg72Pro基因多態(tài)性與HCC患者臨床特征和血清特異性腫瘤標(biāo)志物關(guān)系，及其對預(yù)后的影響仍不清楚，因此，明確HCC患者p53 Arg72Pro的突變情況，對慢性乙型肝炎肝硬化患者癌變的早期診斷具有重要意義。

本研究首先分析p53 Arg72Pro不同基因分型在HCC組、慢性乙型肝炎肝硬化組和健康對照組中的分布特點，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，將HCC組與健康對照組比較，攜帶Pro等位基因患者發(fā)生HCC的風(fēng)險增加了1.427倍，而與慢性乙型肝炎肝硬化組相比，HCC的風(fēng)險增加了1.353倍（P均＜0.05）。該結(jié)果提示，p53 Arg72Pro Pro等位基因與慢性乙型肝炎肝硬化癌變存在一定關(guān)聯(lián)，可能會增加該類患者罹患HCC的風(fēng)險。已有研究證實，p53 Arg72Pro突變后形成的Pro等位基因是結(jié)腸癌、肺癌和乳腺癌等惡性腫瘤的潛在危險因素，其主要原因可能與Pro等位基因降低了p53基因抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)化和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效率有關(guān)[21]。Pro等位基因還可阻止病毒致癌蛋白因子降解，導(dǎo)致乙型病毒性肝炎肝硬化患者癌變的風(fēng)險增加[22]。除此之外，還有研究認(rèn)為Pro等位基因增加慢性乙型病毒性肝炎肝硬化患者癌變風(fēng)險可能與該等位基因影響病毒在體內(nèi)的復(fù)制水平有關(guān)[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，在HCC患者中，Pro/Pro型患者HBV DNA的陽性率明顯高于Arg/Arg型患者，提示攜帶Pro等位基因的HCC患者體內(nèi)HBV DNA復(fù)制水平可能更高。

在以上基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步分析了HCC患者不同p53 Arg72Pro基因分型間臨床特征和血清特異性腫瘤標(biāo)志物水平的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Pro/Pro型HCC患者年齡明顯低于Arg/Pro和Arg/Arg型患者，而BCLC分期為C/D期和伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者比例明顯高于Arg/Pro型和Arg/Arg型患者。以上結(jié)果提示，攜帶Pro/Pro基因型的慢性乙型肝炎肝硬化患者可能較早進(jìn)入癌變階段，且與HCC的進(jìn)展程度密切相關(guān)。AFP-L3是AFP的一種亞型，只能由腫瘤細(xì)胞分泌，是目前美國FDA推薦用于HCC診斷的特異性腫瘤標(biāo)志物[24]。GP73是位于高爾基體的跨膜蛋白，在肝細(xì)胞中幾乎不表達(dá)，而在病毒感染導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷時其表達(dá)水平可明顯增高。DCP則為肝惡性腫瘤細(xì)胞使凝血酶原前體羧化不足而產(chǎn)生的一種特異性腫瘤標(biāo)志物。大量研究證實，GP73和DCP是HCC早期診斷重要標(biāo)志物，同時與患者預(yù)后密切相關(guān)[25]。本研究中，Pro/Pro型HCC患者的AFP-L3、GP73、DCP水平均明顯高于Arg/Arg型和Arg/Pro型患者（P均＜0.05）。以上結(jié)果提示，HCC患者p53 Arg72Pro基因型與目前主流的HCC血清特異性腫瘤標(biāo)志物具有較高的相關(guān)性。

此外，本研究對不同p53 Arg72Pro基因型HCC患者的生存率進(jìn)行觀察。由上述分析可知，Pro等位基因可能是導(dǎo)致HCC和疾病進(jìn)展的主要等位基因。因此，為進(jìn)一步驗證Pro等位基因是否增加了HCC患者的死亡風(fēng)險，本研究將攜帶有Pro等位基因的患者（Arg/Pro或Pro/Pro型）作為一組，將Arg純合子型患者（Arg/Arg）作為一組，比較2組患者的生存率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相較于p53 Arg72Pro純合子型（Arg/Arg）患者，Arg/Pro型和Pro/Pro型患者的生存率明顯較低（P＜0.05），說明p53 Arg72Pro基因多態(tài)性與患者預(yù)后具有密切相關(guān)。然而值得注意的是，影響HCC患者預(yù)后的因素復(fù)雜，患者治療方式和生活環(huán)境等均可能對疾病進(jìn)展情況造成影響，而p53 Arg72Pro基因多態(tài)性可能僅僅是影響患者生存率的因素之一。國外學(xué)者Prapiska等[26]發(fā)現(xiàn)，在陰莖癌患者中，p53 Arg72Pro基因突變引起的p53蛋白表達(dá)異常與惡性腫瘤的臨床和組織病理學(xué)進(jìn)展有關(guān)，是腫瘤細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和死亡的獨立預(yù)測因子，其主要原因可能是p53蛋白表達(dá)降低促進(jìn)了腫瘤組織內(nèi)血管生成。然而，在HCC患者中，攜帶Pro等位基因者病理進(jìn)展速度較快，預(yù)后較差的主要分子機制有待進(jìn)一步分析驗證。

綜上所述，p53 Arg72Pro基因突變與HCC存在密切關(guān)聯(lián)，且與多個HCC血清特異性腫瘤標(biāo)志物密切相關(guān)，可能是加速患者癌變進(jìn)展過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，該位點突變有可能成為慢性乙型肝炎肝硬化患者進(jìn)展為HCC的重要預(yù)測因子。