探針ASPCR檢測(cè)肺炎支原體微量耐藥突變A2063G方法的建立

郭東星，胡文娟，李 丹，李靜宜，吳趙永，栗紹剛，田秀君，辛德莉

肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae, MP）能夠引起肺炎支原體肺炎（Mycoplasma pneumoniae pneumonia, MPP）和其他呼吸道感染性疾病[1-3]。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素、四環(huán)素類抗生素（多西環(huán)素及米諾環(huán)素等）和氟喹諾酮類藥物是臨床上常用于治療MPP的藥物。其中，氟喹諾酮類藥物是治療成人MPP的主要藥物，由于氟喹諾酮類及四環(huán)素類藥物可能對(duì)兒童的發(fā)育造成一定影響，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素成為治療兒童MPP的首選藥物。但伴隨著抗生素的使用，相應(yīng)的耐藥MP也出現(xiàn)了較大規(guī)模的流行，尤其在亞洲地區(qū)，MP耐藥率呈增高趨勢(shì)[4-5]，給治療相關(guān)疾病帶來(lái)了極大挑戰(zhàn)。

23S rRNA基因可變區(qū)域肽基轉(zhuǎn)移酶環(huán)的點(diǎn)突變可以干擾大環(huán)內(nèi)酯類藥物與rRNA的結(jié)合，是MP對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥的主要機(jī)制[6-7]。其中，A2063G是最常見(jiàn)的突變，可導(dǎo)致MP對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物較高水平的耐藥性[4，6，8-11]。前期研究結(jié)果表明，在MP感染者體內(nèi)，耐藥菌株與敏感野生菌株以混合菌群的形式存在[12]，耐藥菌群所占比例與臨床用藥種類、劑量及治療效果密切相關(guān)。建立有效的檢測(cè)MP菌群中耐藥MP比例的方法，對(duì)于制定MPP臨床治療方案和研究MP耐藥發(fā)生發(fā)展規(guī)律具有重要意義。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，MP在感染者體內(nèi)是以混合菌群的狀態(tài)存在，另有病例報(bào)道稱，MP感染者體內(nèi)菌株的藥物敏感性可能隨著治療的進(jìn)程會(huì)發(fā)生變化[13]。因此，在MP感染者體內(nèi)，支原體菌群可能隨著治療藥物的使用和病程的進(jìn)展發(fā)生耐藥變異，并在一定的選擇壓力下，菌群中耐藥菌株和敏感菌株的相對(duì)占比也在不斷發(fā)生變化。目前臨床中常用的檢測(cè)方法僅能夠檢測(cè)是否MP感染或是否存在耐藥MP，無(wú)法檢測(cè)耐藥MP的相應(yīng)占比。

本課題組前期建立了檢測(cè)咽拭子樣本中MP耐藥突變的ASPCR方法[12]。但在之前的研究中，ASPCR方法多為染料法[12，14-15]，在檢測(cè)臨床樣本時(shí)往往會(huì)出現(xiàn)非特異性的擴(kuò)增，在結(jié)果分析時(shí)須要結(jié)合擴(kuò)增曲線和熔解曲線進(jìn)行判讀，對(duì)臨床檢測(cè)人員的技術(shù)要求較高，且會(huì)耗費(fèi)一定時(shí)間，一旦出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增就會(huì)直接影響耐藥菌株比例計(jì)算結(jié)果的準(zhǔn)確性，進(jìn)而須要對(duì)樣本進(jìn)行重新檢測(cè)。因此，為了克服以上缺陷，我們對(duì)前期的染料法ASPCR進(jìn)行了改進(jìn)，建立了檢測(cè)MP A2063G耐藥突變的探針ASPCR方法，并對(duì)該方法的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度和檢測(cè)臨床樣本的性能進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 咽試子樣本 本研究中用于方法驗(yàn)證的58份臨床咽拭子樣本采集自2014年民航總醫(yī)院兒科門診及住院的臨床診斷為疑似MMP的2～12歲患兒。

1.1.2 菌株 MP標(biāo)準(zhǔn)株M129（ATCC 29342）為本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期保存菌株，大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、人型支原體、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、黏液奈瑟菌、銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌、梨狀支原體、發(fā)酵支原體、假單胞菌、解脲支原體等用于驗(yàn)證方法特異性的臨床分離菌株，均由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院檢驗(yàn)科饋贈(zèng)。

1.1.3 主要試劑和儀器 基因組提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化及質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司。配制實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系用的TaqManTMUniversal Master Mix II和ABI Prism@7500型熒光定量PCR儀均為Thermo Fisher公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 方法建立 引物/探針組合設(shè)計(jì)：根據(jù)MP23S rRNA基因序列（GenBank, accession No.NR_077056）設(shè)計(jì)特異性引物/探針組（SP-2063-F，2063D-R和S2P-AS-18）和非特異性引物/探針組[NU-F（Np），2063D-R 和 N2P-AS-16]（表1）。特異性引物/探針組合在一些特定的基因位點(diǎn)以次黃嘌呤核苷酸代替，以提高特異性引物/探針組合的特異性，最終能夠選擇性地?cái)U(kuò)增含有A2063G突變的DNA模板，用于對(duì)耐藥菌株進(jìn)行定量；而非特異性引物/探針組合能夠擴(kuò)增所有MP DNA模板，用于對(duì)總菌群進(jìn)行定量。

表1 引物及探針序列及其在M129基因組中的位置信息Table 1 Oligonucleotide sequences and locations on the M129 genome

標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建：以M129標(biāo)準(zhǔn)株為模板，擴(kuò)增全長(zhǎng)23S rRNA基因片段，連接至pMD18-T載體中，構(gòu)建含2063位點(diǎn)的野生型質(zhì)粒；在野生型質(zhì)?；A(chǔ)上對(duì)2063位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，構(gòu)建突變型質(zhì)粒，將2種基因型質(zhì)粒梯度稀釋為10～106拷貝/μl后作為標(biāo)準(zhǔn)品備用。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：用特異性引物/探針組和非特異性引物/探針組分別擴(kuò)增含A2063G突變型標(biāo)準(zhǔn)品（3復(fù)孔，Ct=Ct平均值±標(biāo)準(zhǔn)差），橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值（lg），縱坐標(biāo)為相應(yīng)Ct值，分別繪制出定量突變型模板的特異性標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量總MP的非特異性標(biāo)準(zhǔn)曲線。

反應(yīng)體系：TaqManTMUniversal Master Mix II：10 μl，10 μmol/L 的 SP-2063-F/2063D-R 或 NU-F（Np）/2063D-R 引物各 1 μl，探針 S2P-AS-18或S2P-AS-16 0.5 μl，DNA 模板 1.0 μl，ddH2O 6.5 μl，總體積 20.0 μl。

擴(kuò)增條件：60 ℃ 30 s；95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40循環(huán)；60 ℃ 30 s，熒光檢測(cè)信號(hào)激發(fā)基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分別選為FAM和NFQ-MGB。

1.2.2 方法性能驗(yàn)證

1.2.2.1 檢測(cè)MP特異性驗(yàn)證 采用非特異性引物/探針組擴(kuò)增臨床常見(jiàn)感染呼吸道且易與MP發(fā)生交叉反應(yīng)的菌種（大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、人型支原體、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、黏液奈瑟菌、銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌、梨狀支原體、發(fā)酵支原體、假單胞菌、解脲支原體）和M129標(biāo)準(zhǔn)菌株擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行比較，以驗(yàn)證新建探針ASPCR方法檢測(cè)MP的特異性。

1.2.2.2 檢測(cè)MP A2063G耐藥突變特異性驗(yàn)證 主要從以下2個(gè)方面進(jìn)行驗(yàn)證：①用特異性引物/探針組分別擴(kuò)增等量的突變型（2063G）與野生型（2063A）DNA模板，比較2者的Ct值的差值（△Ct），△Ct值的大小代表了特異性引物/探針組區(qū)分2種基因型能力的強(qiáng)弱，即△Ct值越大表明該方法檢測(cè)A2063G突變的特異度越好；②用特異性引物/探針組測(cè)定野生型和突變型混合模板的Ct值，比較其Ct值與特異性引物/探針組擴(kuò)增對(duì)應(yīng)等量的突變型DNA模板的Ct值，2者一致性越好，說(shuō)明該方法檢測(cè)A2063G耐藥突變的特異度越高。

1.2.2.3 檢測(cè)MP靈敏度驗(yàn)證 用非特異性引物/探針組進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)， MP DNA模板為10～106拷貝/反應(yīng)，驗(yàn)證該方法檢測(cè)MP的靈敏度。

1.2.2.4 檢測(cè)MP A2063G耐藥突變靈敏度驗(yàn)證 使用特異性引物/探針組擴(kuò)增105拷貝野生型模板，共重復(fù)3次，定義臨界值=Ct平均值+標(biāo)準(zhǔn)差；使用特異性引物擴(kuò)增突變比例為0.01%～100%的混合模板，得到相應(yīng)的Ct值（Ct平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）并與臨界值進(jìn)行比較，小于臨界值說(shuō)明混合物中存在突變模板，大于臨界值說(shuō)明突變無(wú)法檢出，可檢出最低突變比例即為該方法檢測(cè)A2063G耐藥突變的靈敏度。

1.2.2.5 準(zhǔn)確度驗(yàn)證 用非特異性引物/探針組和特異性引物/探針組分別擴(kuò)增突變模板含量為0.01%～100%的混合DNA，分別根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，計(jì)算出混合模板的突變比例（檢測(cè)突變比例=特異性擴(kuò)增模板拷貝數(shù)/非特異性擴(kuò)增模板拷貝數(shù)×100%）。比較該方法的檢測(cè)突變比例與理論突變比例值，2者一致性越高，則該方法的準(zhǔn)確度越高。

1.2.2.6 檢測(cè)臨床標(biāo)本性能驗(yàn)證 采用新建立的探針ASPCR方法、巢式PCR聯(lián)合DNA測(cè)序法和前期建立的染料ASPCR方法分別檢測(cè)58份臨床咽拭子標(biāo)本，通過(guò)比較該方法與其他2種方法的檢測(cè)結(jié)果，評(píng)價(jià)該方法檢測(cè)MP感染的性能，通過(guò)比較該方法與染料ASPCR方法的檢測(cè)結(jié)果，驗(yàn)證該方法檢測(cè)野生型和耐藥型MP比例的性能。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用配對(duì)t檢驗(yàn)對(duì)新建探針ASPCR與染料ASPCR方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)ASPCR方法與巢式PCR聯(lián)合測(cè)序方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行陽(yáng)性符合率、陰性符合率、總符合率分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 標(biāo)準(zhǔn)曲線特異性引物/探針組（SP-2063-F，2063D-R和S2P-AS-18）和非特異性引物/探針組[NU-F（Np），2063D-R和N2P-AS-16]分別擴(kuò)增含A2063G突變型標(biāo)準(zhǔn)品（3復(fù)孔，Ct=Ct平均值±標(biāo)準(zhǔn)差），繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖1。非特異性標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=-3.15x+38.95，R2=1.00；特異性標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=-3.2044x+38.961，R2=0.999；2條標(biāo)準(zhǔn)曲線幾乎重合，表明新建探針ASPCR方法檢測(cè)模板拷貝數(shù)與相應(yīng)Ct值之間具有良好的相關(guān)性，能夠應(yīng)用該標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。

圖1 擴(kuò)增A2063G的特異性和非特異性標(biāo)準(zhǔn)曲線◆所在直線為非特異性引物/探針組擴(kuò)增A2063G突變型標(biāo)準(zhǔn)品得到的非特異性標(biāo)準(zhǔn)曲線；●所在直線為特異性引物/探針組擴(kuò)增A2063G突變型標(biāo)準(zhǔn)品得到的特異性標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Specific and non-specific standard curves of A2063G

2.2 方法性能驗(yàn)證

2.2.1 檢測(cè)MP特異度驗(yàn)證 新建探針ASPCR方法檢測(cè)用以驗(yàn)證特異性的菌種，均未出現(xiàn)擴(kuò)增信號(hào)，結(jié)果見(jiàn)表2。由此可見(jiàn)，該方法檢測(cè)MP具有良好的特異度。

表2 探針ASPCR方法的特異度Table 2 Specificity of the probe ASPCR

2.2.2 檢測(cè)MP A2063G耐藥突變特異度驗(yàn)證 ①用特異性引物/探針組分別擴(kuò)增105拷貝的突變型（2063G）與野生型（2063A）DNA模板，△Ct值約為10.93（圖2A）；特異性引物/探針組能夠正常擴(kuò)增104和103拷貝突變型模板（見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線），但擴(kuò)增104和103拷貝野生型模板時(shí)，無(wú)擴(kuò)增信號(hào)。②將107拷貝/μl的突變型模板視作突變型比例100%，用106拷貝/μl的野生型質(zhì)粒梯度稀釋含2063G的突變模板，得到突變比例為50%～0.01%的混合模板，對(duì)該混合模板進(jìn)行檢測(cè)，其Ct值仍與相應(yīng)濃度的純突變型模板具有良好的一致性（圖2B）。說(shuō)明特異性引物/探針組能夠有效區(qū)分突變型和野生型，具有良好的檢測(cè)A2063G耐藥突變的特異度。

圖2 探針ASPCR方法特異度驗(yàn)證A.分別為特異性引物/探針組擴(kuò)增105拷貝/μl A2063G突變模板和野生型模板的擴(kuò)增曲線，△Ctab（Ctb- Cta）=10.93；B.◆所在直線為特異性引物/探針組擴(kuò)增A2063G突變型標(biāo)準(zhǔn)品得到的特異性標(biāo)準(zhǔn)曲線，●所在直線為特異性引物/探針組擴(kuò)增梯度稀釋的A2063G突變型模板和5×106拷貝/μl野生型模板的混合物DNAFigure 2 Allelic discrimination of the probe ASPCR assay

2.2.3 靈敏度與準(zhǔn)確度驗(yàn)證 用特異性和非特異性引物/探針組分別擴(kuò)增相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品，所得擴(kuò)增曲線梯度均勻，靈敏度均達(dá)10拷貝（圖3～4）。

圖3 特異性引物/探針組擴(kuò)增A2063G突變基因的靈敏度特異性引物/探針組擴(kuò)增A2063G突變型標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線，從左到右依次為108～101拷貝Figure 3 Sensitivity of the specific primers and probe for testing A2063G

圖4 非特異性引物/探針組擴(kuò)增目的基因的靈敏度非特異性引物/探針組擴(kuò)增A2063G突變型標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線，從左到右依次為108～101拷貝Figure 4 Sensitivity of the non-specific primers and probe

根據(jù)計(jì)算所得臨界值為33.96；使用特異性引物擴(kuò)增突變比例為100%～0.01%的混合模板，得到相應(yīng)的Ct值均＜臨界值（圖5）。用非特異性和特異性引物/探針組同時(shí)擴(kuò)增混合模板，實(shí)際檢測(cè)突變比例與理論突變比例值具有良好的一致性（圖6），說(shuō)明探針ASPCR方法檢測(cè)MP A2063G耐藥突變具有良好的準(zhǔn)確度。另外，當(dāng)理論突變比例為0.01%時(shí)其相應(yīng)的Ct值仍顯著小于臨界值；當(dāng)理論突變模板比例為0.1%時(shí)，與檢測(cè)到的比例具有良好一致性，低于0.1%時(shí)，測(cè)得值將顯著偏離理論值，因此結(jié)合靈敏度和準(zhǔn)確度的驗(yàn)證結(jié)果，最終確定探針ASPCR方法檢測(cè)MP耐藥位點(diǎn)的靈敏度可達(dá)0.1%。

圖5 探針ASPCR方法檢測(cè)A2063G靈敏度圖中直線為特異性引物/探針組擴(kuò)增105拷貝/μl野生型模板得到的臨界值；●為特異性引物/探針組擴(kuò)增A2063G突變模板比例為100%～0.01%的混合物所得Ct值Figure 5 Sensitivity of the probe ASPCR assay

圖6 探針ASPCR方法檢測(cè)A2063G準(zhǔn)確度橫坐標(biāo)軸為A2063G突變模板理論比例，縱坐標(biāo)軸為0.01%～100%的混合模板的檢測(cè)比例Figure 6 Accuracy of of the probe ASPCR assay

2.2.4 臨床標(biāo)本檢測(cè)應(yīng)用 使用新建探針ASPCR方法、染料ASPCR方法和巢式PCR聯(lián)合DNA測(cè)序法分別檢測(cè)58份臨床咽拭子標(biāo)本。探針ASPCR方法和染料ASPCR方法檢測(cè)MP感染陰、陽(yáng)性結(jié)果一致，總陽(yáng)性率相同，均為94.83%（55/58）；巢式PCR聯(lián)合DNA測(cè)序法檢測(cè)MP陽(yáng)性率為75.86%（44/58），ASPCR和巣式PCR方法同時(shí)檢測(cè)為陽(yáng)性樣本44份，同為陰性3份，陽(yáng)性符合率是80.00%，陰性符合率是100%、總符合率是81.00%。其中探針?lè)ê腿玖戏?種ASPCR方法檢測(cè)結(jié)果中野生型、A2063G突變型和混合菌群的樣本數(shù)量分別為20/16（＜S%）、10/14（100%）、20/21（≥20%，＜100%）（見(jiàn)表3）。配對(duì)數(shù)據(jù)t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，t=2.057 ，P=0.044，說(shuō)明染料ASPCR方法檢測(cè)的A2063G耐藥突變比例顯著高于探針ASPCR方法檢測(cè)的結(jié)果。探針ASPCR方法檢測(cè)臨床樣本的擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖7～9。

表3 探針ASPCR方法和染料ASPCR方法檢測(cè)A2063G結(jié)果比較（例）Table 3 Comparison of the results of dye-ASPCR and probe-ASPCR for testing A2063G (cases)

圖7 混合基因型臨床樣本檢測(cè)結(jié)果探針ASPCR方法檢測(cè)混合（野生型+A2063G）臨床樣本的擴(kuò)增曲線：a.是用非特異性引物擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線；b.是A2063G特異性引物擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線圖，說(shuō)明樣本中肺炎支原體是混合菌群，同時(shí)含有野生型和耐藥突變型Figure 7 Results of probe ASPCR testing clinical sample with mixed genotype

圖8 野生型基因型臨床樣本檢測(cè)結(jié)果探針ASPCR方法檢測(cè)野生型臨床樣本的擴(kuò)增曲線：a.是用非特異性引物擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線；b.是A2063G特異性引物擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果（未發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)），說(shuō)明樣本中肺炎支原體均為敏感型，無(wú)耐藥突變Figure 8 Results of probe ASPCR testing clinical sample with wild genotype

圖9 突變基因型臨床樣本檢測(cè)結(jié)果探針ASPCR方法檢測(cè)突變型臨床樣本的擴(kuò)增曲線，特異性引物/探針組和非特異性引物/探針組擴(kuò)增樣本的曲線完全重合，說(shuō)明樣本中肺炎支原體耐藥比例為100%Figure 9 Results of probe ASPCR testing clinical sample with mutant genotype

3 討 論

位于23S rRNA V區(qū)域的A2063G和A2064G點(diǎn)突變能夠干擾大環(huán)內(nèi)酯類藥物與MP rRNA的結(jié)合，是MP耐藥發(fā)生的主要機(jī)制[15-16]。其中，A2063G突變是耐藥MP的最主要突變類型[17-18]。本研究建立了具有高靈敏度的探針ASPCR方法，能夠準(zhǔn)確檢測(cè)微量A2063G耐藥突變。采用該方法能夠研究MP感染者體內(nèi)的不同時(shí)期的23S rRNA變異情況，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)MP藥物敏感性的變化情況，是進(jìn)一步研究大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥發(fā)生發(fā)展機(jī)制的有利工具，并能夠?yàn)榕R床治療方案的制定提供有效依據(jù)。

探針ASPCR方法建立的難點(diǎn)在于特異性引物和相應(yīng)探針組合的設(shè)計(jì)，要求該引物探針組合能夠特異性地?cái)U(kuò)增突變樣本，就需要盡量降低其擴(kuò)增野生型模板的效率但其擴(kuò)增突變型模板的效率不能有明顯影響。理論上，當(dāng)引物3’末端堿基與模板堿基不完全匹配時(shí)，其擴(kuò)增反應(yīng)效率則會(huì)大幅降低，甚至無(wú)法擴(kuò)增，但在研究過(guò)程中我們發(fā)現(xiàn)，特異性引物序列當(dāng)中僅末端堿基不匹配時(shí)，在模板足量的情況下，野生型模板仍能夠有較高程度的擴(kuò)增。為此，除了末端堿基外，我們?cè)谔禺愋砸锏钠渌恢靡苍O(shè)計(jì)了數(shù)個(gè)不完全匹配堿基（次黃嘌呤），以提高特異性引物對(duì)突變型和野生型模板的區(qū)分能力。次黃嘌呤的位置及數(shù)量對(duì)引物的特異性影響很大，須反復(fù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。另外，研究過(guò)程中我們發(fā)現(xiàn)，在特異性引物/探針組合中，除了特異性引物外，探針的序列對(duì)組合的特異性也有一定影響。在本研究中，對(duì)18組引物/探針組合進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)篩選，最終選定表1中所列出的特異性引物/探針組合。

本研究中的探針ASPCR方法是在前期建立的染料ASPCR方法的基礎(chǔ)上重新設(shè)計(jì)引物/探針組合建立的一種新的ASPCR方法。對(duì)2種方法進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)：①2者判讀結(jié)果的方法存在差異。探針ASPCR方法在能夠根據(jù)擴(kuò)增曲線直接讀取結(jié)果，而染料ASPCR方法對(duì)多種上呼吸道感染常見(jiàn)病原體均出現(xiàn)擴(kuò)增反應(yīng)，需要同時(shí)結(jié)合擴(kuò)增曲線（Ct值）和熔解曲線（Tm值）對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判讀。②2種ASPCR方法檢測(cè)臨床樣本的能力不同。臨床樣本檢測(cè)結(jié)果中常有耐藥菌和敏感菌混合存在的情況，采用染料ASPCR方法常會(huì)發(fā)生非特異性擴(kuò)增的情況，此時(shí)其Ct值會(huì)小于其真實(shí)值，最終導(dǎo)致計(jì)算出的MP耐藥比例存在一定誤差，這也是導(dǎo)致2種ASPCR方法檢測(cè)臨床樣本時(shí)，染料ASPCR方法檢測(cè)臨床樣本的耐藥比例高于探針ASPCR方法檢測(cè)結(jié)果（表3）的主要原因，甚至當(dāng)熔解曲線出現(xiàn)雙峰時(shí)，還需要對(duì)樣本進(jìn)行復(fù)查。因此，該方法檢測(cè)臨床樣本的特異性相對(duì)探針ASPCR方法較低，對(duì)實(shí)驗(yàn)者的要求也較高。而本研究中新建立的探針ASPCR方法，因其加入了探針，提高了擴(kuò)增的特異性，可以根據(jù)Ct值即可直接判讀結(jié)果，符合臨床檢驗(yàn)工作人員的判讀習(xí)慣。

本研究將2種ASPCR方法檢測(cè)臨床樣本的結(jié)果與巢式PCR聯(lián)合DNA測(cè)序法的結(jié)果進(jìn)行了比較：ASPCR方法法檢測(cè)MP的陽(yáng)性率高于傳統(tǒng)巢式PCR方法。巢式PCR聯(lián)合DNA測(cè)序法一般只能檢測(cè)出主要基因型，不能檢測(cè)出混合株中的其他微量基因型，在這方面，ASPCR方法檢測(cè)臨床標(biāo)本檢測(cè)能力明顯優(yōu)于傳統(tǒng)巢式PCR聯(lián)合DNA測(cè)序法。另外，本研究中，探針ASPCR方法檢測(cè)臨床樣本結(jié)果顯示，在近一半[45.45%（25/55）]的感染者體內(nèi)，MP以敏感菌和耐藥菌混合菌群的形式存在，且在MP陽(yáng)性樣本中，耐藥菌和敏感菌都可能以優(yōu)勢(shì)菌種的形式存在。這說(shuō)明，在臨床用藥前，很有必要采用ASPCR方法對(duì)臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，分析其中耐藥菌和敏感菌的組成比例及其優(yōu)勢(shì)種群，為臨床用藥選擇提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。