基于番鴨細(xì)小病毒VP3蛋白的間接ELISA方法建立

葉偉成， 云濤， 朱寅初， 倪征， 陳柳， 華炯鋼， 張存

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 杭州 310021)

番鴨細(xì)小病毒病是由番鴨細(xì)小病毒(Muscovy duck parvovirus，MDPV)引起，是一種以喘氣、腹瀉、軟腳、胰壞死和出血及纖維素性腸炎為主要特征的急性敗血性傳染病，因其主要侵害3周齡內(nèi)雛番鴨，故又稱“三周病”[1-3]。番鴨細(xì)小病毒病傳染性極強(qiáng)，發(fā)病率和死亡率高，3周齡以內(nèi)的雛番鴨，發(fā)病率為27%～62%，病死率為40%～65%；患病鴨痊愈后往往成為僵鴨[4-5]，給番鴨養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

MDPV屬細(xì)小病毒科、細(xì)小病毒屬，為單鏈線性DNA病毒。病毒粒子直徑20～22 nm，為圓形或六角形，無囊膜，呈二十面體對(duì)稱?；蚪M長5 136 bp，由左右兩個(gè)開放閱讀框(open reading frame，ORF)和兩端的末端重復(fù)序列(inverted terminal repeats，ITR)組成[6-7]。在兩個(gè)ORF之間間隔18 bp，左側(cè)ORF編碼NS1和NS2兩個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，右側(cè)ORF編碼結(jié)構(gòu)蛋白，結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2和VP3基因的起始密碼子位置不同，但共用同一終止密碼子，即VP1基因含有組成VP2和VP3的全部基因編碼序列，其中VP2結(jié)構(gòu)蛋白具有免疫原性，是病毒刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體的重要蛋白抗原；VP3是主要衣殼蛋白，約占總蛋白的80%[8-9]，也是蛋白抗原核心結(jié)構(gòu)域。

本研究對(duì)番鴨細(xì)小病毒VP3基因進(jìn)行了克隆、原核表達(dá)，并將表達(dá)產(chǎn)物VP3蛋白過鎳柱純化，以純化VP3蛋白作為包被抗原，建立了間接ELISA檢測番鴨細(xì)小病毒抗體的方法，該方法的建立為該病疫苗免疫抗體的檢測和流行病學(xué)調(diào)查提供了技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 病毒、載體、菌種及血清

番鴨細(xì)小病毒由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存，番鴨細(xì)小病毒標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性血清、兔抗番鴨IgG-HRP二抗由本實(shí)驗(yàn)室自制。原核表達(dá)載體pET-28a(+)為本實(shí)驗(yàn)室保存，感受態(tài)細(xì)胞Trans T1、BL21(DE3)購自北京全氏金生物技術(shù)有限公司。鴨病毒性肝炎病毒(DHV)、禽流感病毒(AIV NH9)、呼腸孤病毒(DRV)、鴨坦布蘇病毒(DTMUV)、MDPV等的番鴨陽性血清均由本實(shí)驗(yàn)室制備保存。

1.2 主要試劑與溶液

DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、T載體連接試劑盒、高保真酶、限制性內(nèi)切酶均購自大連寶生物工程有限公司(TaKaRa)；質(zhì)粒小量抽提試劑盒購自O(shè)mega公司；ClonExpress購自Vazyme公司；正辛酸、尿素、protein marker、30%聚丙烯酰胺、SDS、考馬斯亮藍(lán)R-250、卡那霉素、IPTG等試劑和培養(yǎng)基購自上海生物工程有限公司；Ni-NTA蛋白親和層析柱購自Novagen公司。包被液(0.05 mol·L-1碳酸鹽緩沖液，pH 9.6)、洗滌液(PBST，pH 7.4)、封閉液(10%脫脂奶粉的PBST)、血清稀釋液(10%脫脂奶粉及10% FBS的PBST)、底物緩沖液(0.025 mol·L-1檸檬酸，0.05 mol·L-1磷酸氫二鈉，1.11 g·L-1過氧化氫)、底物(取10 mg TMB溶解到1 mL的DMSO中)、終止液(2 mol·L-1硫酸溶液)等自配。

1.3 MDPV VP3基因擴(kuò)增

根據(jù)GenBank發(fā)表的番鴨細(xì)小病毒的序列設(shè)計(jì)了含有NcoI、XhoI酶切位點(diǎn)并帶有插入PET-28a位點(diǎn)同源序列的一對(duì)引物(粗體部分為同源序列)，上游MDPV-VP3-y：5′-agaaggagatataccatggcaga gggaggaagcggag-3′，下游MDPV-VP3-y2：5′-ggtggtgg tggtgctcgagcagattctgagtcaaatac-3′，以抽提的番鴨細(xì)小病毒DNA為模板PCR擴(kuò)增出番鴨細(xì)小病毒的VP3基因，反應(yīng)體系如下：2×buffer 25 μL，2 mmol·L-1dNTPs 10 μL，上下游引物各2 μL，模板2 μL，加水至50 μL。反應(yīng)程序：98 ℃ 2 min；98 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，68 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；68 ℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物VP3基因經(jīng)檢測后回收，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PET-28a-VP3質(zhì)粒的構(gòu)建、表達(dá)及純化

將PET-28a用NcoI、XhoI雙酶切過柱回收與VP3基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行重組反應(yīng)，重組反應(yīng)體系為：2×ClonExpress Mix 5 μL，PET-28a 1 μL，VP3基因PCR產(chǎn)物1 μL，ddH2O 3 μL。重組反應(yīng)：50 ℃，15 min；降至4 ℃或立即置于冰上冷卻，轉(zhuǎn)化于Trans-T1感受態(tài)菌，卡那霉素抗性篩選及PCR鑒定的陽性克隆菌經(jīng)測序驗(yàn)證正確后，抽提質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21表達(dá)菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出含His標(biāo)簽的VP3蛋白，并經(jīng)鎳柱過柱純化獲得純度較高的番鴨細(xì)小病毒VP3蛋白。

1.5 兔抗番鴨IgG的制備

無菌采取3月齡番鴨的血30 mL，分離血清，取番鴨血清10 mL用辛酸-硫酸銨法提取番鴨IgG[10-11]，提取的番鴨IgG經(jīng)透析后用0.01 mol·L-1pH 7.4的PBS配制1 mg·mL-1的濃度，加等量弗氏完全佐劑，用全自動(dòng)樣品快速研磨儀研磨5 min制成均勻乳劑，背部皮下多點(diǎn)免疫1.5 kg左右的新西蘭大白兔2只，每只注射2 mL，首免后第14天和第28天用弗氏不完全佐劑乳化的番鴨IgG加強(qiáng)免疫二次，免疫劑量和途徑同首免，三次免疫后14 d心臟采血分離血清，送華安生物技術(shù)有限公司進(jìn)行兔抗番鴨IgG純化及HRP的標(biāo)記。

1.6 間接ELISA檢測方法的建立

1.6.1 抗原包被濃度與待檢血清最佳稀釋度的確定

純化后的蛋白用包被液稀釋成20.000、10.000、5.000、2.500、1.250和0.625 μg·mL-1，每個(gè)稀釋度16孔重復(fù)，每孔加100 μL，4 ℃包被過夜；洗板3次，拍干后每孔加封閉液400 μL，37 ℃封閉1 h，洗板3次，拍干。加經(jīng)稀釋的血清，每孔100 μL，陽性血清和陰性血清分別用稀釋液按1∶25、1∶50、1∶100、1∶200等4個(gè)稀釋度稀釋，37 ℃孵育1 h；洗板3次，拍干，加1∶2 500倍稀釋酶標(biāo)二抗，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h，洗板3次，拍干后加經(jīng)底物緩沖液作100倍稀釋的底物100 μL，37 ℃避光顯色10 min，每孔加終止液50 μL測定血清D450值[12]。

1.6.2 最佳樣品稀釋液的確定

在最佳抗原濃度包被、封閉液為10%脫脂奶粉的PBST的條件下，用不同的稀釋液將陰陽性血清做100倍稀釋進(jìn)行間接ELISA試驗(yàn)，測定陰、陽性血清D450值，并根據(jù)P/N值確定最佳樣品稀釋液。

1.6.3 最佳封閉液的確定

在最佳抗原濃度包被的條件下，分別用5%、10%、15%的明膠，5%、10%、15%的BSA，5%、10%、15%的小牛血清，10%的脫脂奶粉進(jìn)行封閉。并用不同的樣品稀釋液及選取的最佳稀釋液，將陰、陽性血清作1∶100稀釋，按照間接ELISA的操作方法進(jìn)行試驗(yàn)，確定最佳封閉液。

1.6.4 酶標(biāo)二抗作用濃度的確定

抗原包被濃度、封閉液、血清稀釋液、陰陽血清稀釋濃度都按試驗(yàn)結(jié)果確定的最佳條件，酶標(biāo)二抗體作1∶1 500、1∶2 000、1∶2 500、1∶3 000、1∶3 500、1∶4 000、1∶4 500等7個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度加6孔，即陰陽血清各3個(gè)重復(fù)，進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，測定其D450值。通過對(duì)D450值的分析以及間接ELISA的判定標(biāo)準(zhǔn)，選出二抗的最佳稀釋度。

1.6.5 間接ELISA方法檢測臨界值的確定

按已確定的最佳條件的ELISA檢測方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的15份MDPV陰性血清進(jìn)行檢測，計(jì)算出D450值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，確定陽性樣品的臨界值，當(dāng)待檢樣品D450值大于臨界值時(shí)判定為陽性[12-13]。

1.6.6 特異性試驗(yàn)

采用本試驗(yàn)建立的間接ELISA方法對(duì)番鴨MDPV、鴨肝炎病毒(DHV)、鴨呼腸孤病毒(DRV)、禽流感病毒(AIV)、鴨瘟病毒(DPV)、鴨坦布蘇病毒(DTMUV)等的陽性血清及MDPV陰性血清進(jìn)行檢測，根據(jù)檢測結(jié)果判定間接ELISA方法的特異性。

1.6.7 敏感性試驗(yàn)

將1份MDPV陽性血清作1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200稀釋，1份MDPV陰性血清作1∶100稀釋，按建立的間接ELISA方法進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，測定其D450值。

1.6.8 重復(fù)性試驗(yàn)

批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)。取MDPV陽性血清4份及1份陰性血清，每份樣品分成3份，置-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。在不同時(shí)間取其中的一份樣品，用本試驗(yàn)建立的間接ELISA檢測方法，在同一次包被的酶標(biāo)板上，重復(fù)檢測3次，測定其D450值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

批間重復(fù)試驗(yàn)。取MDPV陽性血清4份及1份陰性血清，每份樣品分成3份，置-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。在不同時(shí)間取其中的一份樣品，用本試驗(yàn)建立的間接ELISA檢測方法，在不同批次包被的酶標(biāo)板上，重復(fù)檢測3次，測定其D450值，對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)算出每份血清樣品的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)變異系數(shù)公式得出每份血清的變異系數(shù)[13-15]。

1.6.9 符合率試驗(yàn)

100份番鴨血清分別以本研究建立的間接ELISA方法和血清學(xué)中和試驗(yàn)進(jìn)行檢測。中和試驗(yàn)在96孔板培養(yǎng)的細(xì)胞上進(jìn)行，MDPV細(xì)胞適應(yīng)毒稀釋到每單位劑量200 TCID50，與等量倍數(shù)遞進(jìn)稀釋的血清混合，37 ℃孵育1 h后，接種長成單層DEF細(xì)胞的96孔板，每個(gè)血清稀釋度設(shè)5個(gè)重復(fù)，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后觀察細(xì)胞病變。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室中和試驗(yàn)方法結(jié)果，中和抗體滴度大于或等于1∶16判為陽性，小于1∶16判為陰性。統(tǒng)計(jì)計(jì)算兩種方法的符合率[12-15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 MDPV VP3基因的原核表達(dá)

2.1.1 PCR擴(kuò)增VP3基因

以MDPV基因組DNA為模板，用引物MDPV-VP3-y、MDPV-VP3-y2擴(kuò)增出與預(yù)期結(jié)果符合，大小1 650 bp左右的特異性條帶(圖1)。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖譜

2.1.2 PET-28a-VP3質(zhì)粒的構(gòu)建、表達(dá)及純化

構(gòu)建好的PET-28a-VP3質(zhì)粒，經(jīng)測序驗(yàn)證后轉(zhuǎn)化BL21表達(dá)菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4 h，離心棄上清，菌體用包涵體洗脫液重懸(20 mmol·L-1Tris-HCl、10 mmol·L-1EDTA、1% Triton-X100)，然后加1%溶菌酶，37 ℃作用15 min后在冰上用超聲波裂解40 min，離心棄上清(留樣1～2電泳)，沉淀用包涵體洗脫液、不含1% Triton-X100的包涵體洗脫液先后各洗2次，洗后的沉淀用8 mol·L-1的尿素溶解獲得含His標(biāo)簽的VP3蛋白(圖2)，并經(jīng)鎳柱純化獲得純度較高的番鴨細(xì)小病毒VP3蛋白。

M—蛋白Marker；1～2—洗前上清；3～5—洗3次的上清；6～7—尿素溶解后上清；8～9—尿素溶解后沉淀。

2.2 HRP標(biāo)記的兔抗番鴨IgG的制備

3月齡番鴨的血清經(jīng)辛酸-硫酸銨法提取，獲得較純的番鴨IgG(圖3)，經(jīng)透析后的番鴨IgG用弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑多點(diǎn)皮下免疫兔子3次后，經(jīng)瓊擴(kuò)試驗(yàn)結(jié)果表明，兔抗番鴨IgG的效價(jià)為1∶8，心臟采血分離血清，送華安生物技術(shù)有限公司進(jìn)行兔抗番鴨IgG純化及HRP的標(biāo)記，獲得HRP標(biāo)記的兔抗番鴨IgG的抗體1 mL。

M—蛋白Marker；1～3—提取的番鴨IgG。

2.3 間接ELISA檢測方法的建立

2.3.1 最佳抗原包被濃度與待檢血清最佳稀釋度的確定

間接ELISA測得的D450值見表1，VP3蛋白以5.000 μg·mL-1濃度包被，血清以1∶100稀釋時(shí)，陽性血清D450值(P)為1.025，陰性血清D450值(N)為0.088，P/N為11.648，比其他蛋白包被量和血清稀釋度組合都高。因此，確定最佳抗原包被濃度為5.000 μg·mL-1，血清稀釋度為1∶100。

表1 抗原最佳包被濃度及血清最佳稀釋濃度的確定

2.3.2 待檢血清最佳稀釋液的確定

從表2中可見，封閉液為10%脫脂奶粉的PBST時(shí)，血清樣品稀釋液為10%脫脂奶粉的PBST或含10%脫脂奶粉及10% FBS的PBST時(shí)效果都比較好，但后者效果略好于前者，因此，我們選用含10%脫脂奶粉及10% FBS的PBST作為樣品的稀釋液。

表2 不同樣品稀釋液對(duì)ELISA檢測結(jié)果的影響

2.3.3 最佳封閉液確定

從表3可見，在這幾種封閉液封閉的情況下，10%脫脂奶粉的PBST或含10%脫脂奶粉及10% FBS的PBST效果優(yōu)于其他稀釋液，稀釋樣品血清時(shí)，非特異性反應(yīng)都較低。使用這兩種樣品稀釋液時(shí)，封閉液用含5%～10% BSA或5%明膠或5%～10% FBS或10%脫脂奶粉的PBST無明顯差異。本實(shí)驗(yàn)后續(xù)考慮使用方便、價(jià)格等選用含10%脫脂奶粉的PBST作封閉液。

表3 不同封閉液、樣品稀釋液對(duì)ELISA結(jié)果的影響

2.3.4 酶標(biāo)二抗最佳稀釋度的確定

在其他條件不變的情況下，酶標(biāo)二抗體作1∶1 500、1∶2 000、1∶2 500、1∶3 000、1∶3 500、1∶4 000、1∶4 500等7個(gè)稀釋度各加6孔，即陰陽血清各3個(gè)重復(fù)，進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，測定其D450值，計(jì)算出陰陽性血清的平均值及P/N(表4)。從表中可見酶標(biāo)二抗體作1∶2 500稀釋時(shí)，P/N最高為8.660，所以二抗的最佳稀釋度為1∶2 500。

表4 酶標(biāo)二抗最佳稀釋度的確定

2.3.5 臨界值確定

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室保存的15份陰性血清測定的D450值，計(jì)算出其平均值為0.142 7，標(biāo)準(zhǔn)差為0.019 4。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，本ELISA試驗(yàn)的臨界值(陽性判定值)為0.201。

2.3.6 特異性試驗(yàn)

用本試驗(yàn)建立的間接ELISA檢測抗體的方法對(duì)MDPV、AIV、DTMUV、DHV、DPV、DRV等陽性血清及MDPV陰性血清進(jìn)行檢測，測定D450值，結(jié)果除MDPV陽性血清為陽性外，其余病毒血清及MDPV陰性血清D450值都在0.167 2以下，均為陰性，說明該方法具有良好的特異性。

2.3.7 敏感性試驗(yàn)

MDPV陽性血清作100倍稀釋后，稀釋至3 200倍，每稀釋度重復(fù)加2孔，并設(shè)有MDPV陰性血清對(duì)照(2孔)進(jìn)行間接ELISA檢測抗體的試驗(yàn)，測定的D450值見表5。從測定結(jié)果可見，陽性血清稀釋至1 600倍時(shí)，D450值是0.318，大于0.201為陽性，說明本試驗(yàn)建立的間接ELISA檢測抗體的方法有較高的敏感性。

表5 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.8 重復(fù)性試驗(yàn)

按建立的間接ELISA檢測抗體的方法對(duì)5個(gè)血清樣品進(jìn)行批內(nèi)、批間重復(fù)性試驗(yàn)，根據(jù)測定的D450值計(jì)算出平均值、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)(表6)。批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)的變異系數(shù)在4.2%～8.3%，批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)為2.3%～8.7%，均小于 10%，說明該間接ELISA方法重復(fù)性好。

表6 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.9 符合率試驗(yàn)

由表7可見，兩種方法檢測的結(jié)果存在一定的差異，這主要是兩種方法的敏感性不同，間接ELISA比血清中和試驗(yàn)敏感所致。然而兩種方法的符合率還是比較高的，陽性符合率為91.7%(66/72)，陰性符合率87.9%(29/33)，總符合率90.5%(95/105)。說明本試驗(yàn)建立的間接ELISA檢測番鴨細(xì)小病毒抗體的方法是可行的，完全可用于臨床疫苗免疫效果的監(jiān)測，流行病學(xué)的調(diào)查等。

表7 間接ELISA與中和試驗(yàn)檢測結(jié)果的比較

3 討論

本試驗(yàn)采用原核表達(dá)帶有His標(biāo)簽的番鴨細(xì)小病毒VP3蛋白作為包被抗原，原核表達(dá)抗原的表達(dá)量高，帶有His標(biāo)簽，提取純化都比較簡單方便，并經(jīng)試驗(yàn)證明，表達(dá)的VP3蛋白不與常見的水禽病毒陽性血清發(fā)生交叉反應(yīng)，特異性強(qiáng)，適合作為間接ELISA檢測抗體的包被抗原。經(jīng)抗原最佳包被濃度及血清最佳稀釋度的試驗(yàn)分析，確定抗原最佳包被濃度為5 μg·mL-1，血清的最佳稀釋比例為1∶100，在此條件下，P/N值最大，試驗(yàn)的特異性較高。

在間接ELISA檢測抗體的試驗(yàn)中，二抗也非常重要，鴨與番鴨的IgG盡管在血清學(xué)上有交叉反應(yīng)，但兩者還是有較大的區(qū)別，如用鴨的二抗來替代番鴨二抗就會(huì)降低ELISA試驗(yàn)的敏感性，從而會(huì)使一些陽性樣品出現(xiàn)假陰性，而市面上沒有番鴨的二抗可購買。為此，本試驗(yàn)采用辛酸-硫酸銨沉淀法提取純化番鴨IgG。該方法操作簡便，提取的純度、含量都較高。提取的番鴨IgG經(jīng)透析后用弗氏佐劑制成乳劑免疫新西蘭大白兔，制備了兔抗番鴨IgG的酶標(biāo)二抗，試驗(yàn)表明，制備的兔抗番鴨IgG酶標(biāo)二抗，特異性強(qiáng)，敏感性高，在間接ELISA試驗(yàn)中的最佳濃度為1∶2 500。

在ELISA試驗(yàn)中為了降低非特異性反應(yīng)，需要封閉液對(duì)包被好的板進(jìn)行封閉，目的是封閉液中的蛋白可非特異性地將板中沒有結(jié)合包被物的位點(diǎn)封閉掉，這樣之后加入的抗原或抗體就不會(huì)再和板發(fā)生非特異性的結(jié)合，常用的封閉液有BSA、牛血清、脫脂乳、明膠等，明膠作為封閉液時(shí)由于不容易洗干凈未結(jié)合的明膠，封閉效果不好，本試驗(yàn)也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。而其他三者成分與牛的血清或牛奶有關(guān)，目前在家禽上使用的疫苗都含有這些成分，如活疫苗的保護(hù)劑是5%蔗糖的脫脂乳，病毒培養(yǎng)的營養(yǎng)液含4%的小牛血清，因此在多次免疫后，動(dòng)物的血清中難免有牛血清及脫脂乳的抗體，從而增加了ELISA檢測結(jié)果的背景。為了消除這個(gè)原因帶來的影響，本試驗(yàn)進(jìn)行了不同樣品稀釋液對(duì)間接ELISA結(jié)果影響的試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10%脫脂奶粉的PBST或同時(shí)含有10%脫脂奶粉及10%小牛血清的PBST作為樣品稀釋液，就大大降低了陰性血清的D450值，P/N上升，從而增強(qiáng)了該方法的特異性及敏感性。

本試驗(yàn)通過一系列試驗(yàn)，建立了間接ELISA檢測番鴨細(xì)小病毒抗體的方法，該方法特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性好、與中和試驗(yàn)總符合率達(dá)90%以上，為鴨群免疫番鴨細(xì)小病毒后抗體的監(jiān)測，番鴨細(xì)小流行病學(xué)的調(diào)查提供了一種操作簡便、快速的檢測方法。同時(shí)試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)用10%脫脂奶粉的PBST或同時(shí)含有10%脫脂奶粉及10%小牛血清的PBST作為樣品稀釋液，可中和掉樣品血清中含有小牛血清、脫脂乳的抗體而大大降低了BSA、牛血清、脫脂乳作為封閉液的本底，從而提高了間接ELISA方法特異性及敏感性。這也為建立其他家禽間接ELISA檢測抗體的方法提供理論基礎(chǔ)及參考。