基于粒徑和形貌視角下探究微乳劑是否為納米農(nóng)藥

程敬麗， 梁文龍， 張家棟， 熊秋雨， 趙金浩

(浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部作物病蟲分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江省作物病蟲生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310058)

當(dāng)今全球人口迅速增長(zhǎng)，預(yù)計(jì)到2050年將達(dá)到90億以上[1]，糧食安全生產(chǎn)是全球面臨的關(guān)鍵挑戰(zhàn)，大量的農(nóng)用化學(xué)品尤其是農(nóng)藥的使用，可有效降低病、蟲、草害的脅迫，能夠每年提高全球糧食產(chǎn)量超過30%[2]，但是常規(guī)農(nóng)藥制劑噴施后會(huì)由于界面張力[3]而引起彈跳滑落[4]或聚并流失[5]，不僅導(dǎo)致現(xiàn)有農(nóng)藥利用率低、持效期短，而且脫靶的農(nóng)藥進(jìn)入到環(huán)境中不斷富集，造成農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)和土壤的衰退，并對(duì)生態(tài)及農(nóng)產(chǎn)品安全帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn)[6]，最終影響人類的健康與農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[7]，因此，亟需發(fā)展農(nóng)藥制劑新技術(shù)來(lái)解決這些問題。

優(yōu)化農(nóng)藥制劑及其遞送系統(tǒng)是提高農(nóng)藥利用率和安全性的有效途徑[8-9]。近年來(lái)，納米尺度(1～100 nm)的材料因其具有高的穿透性、滲透性和比表面積等特性[10]，已經(jīng)在化學(xué)、材料、醫(yī)學(xué)、能源和生命科學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，并逐漸在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中形成了一個(gè)新興的交叉學(xué)科[11]。2019年國(guó)際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)首次把納米農(nóng)藥列為全球可持續(xù)性發(fā)展的十大化學(xué)新興技術(shù)之首[12]。但對(duì)于納米農(nóng)藥的定義，各個(gè)國(guó)家和國(guó)際組織尚未統(tǒng)一。目前普遍使用粒徑尺寸去定義納米農(nóng)藥，如Kah等[13]基于顆粒粒徑廣義地將小于1 000 nm，或具有與小尺寸相關(guān)新特性的，或以“納米”為前綴的農(nóng)藥劑型定義為納米農(nóng)藥。在我國(guó)農(nóng)藥傳統(tǒng)劑型中，微乳劑粒徑一般在10～100 nm[14]，外觀為透明狀態(tài)，其粒徑遠(yuǎn)低于一般乳狀液(如水乳劑)，而與納米農(nóng)藥比較接近，有些產(chǎn)品就打著納米農(nóng)藥的概念來(lái)推廣，也有報(bào)道把微乳劑列入納米農(nóng)藥中[15]。

納米農(nóng)藥的定義首先是從粒徑尺寸來(lái)判斷的，此外還具有一些更好的生物活性，比如黃啟良等[16-17]使用納米二氧化硅對(duì)農(nóng)藥進(jìn)行負(fù)載，能夠提高農(nóng)藥在作物上的吸收與輸導(dǎo)，有些還提高了農(nóng)藥在菌絲中的穿透性，負(fù)載后形成的納米農(nóng)藥平均粒徑均在200～300 nm。趙金浩等[18-19]通過使用金屬有機(jī)框架材料ZIF-8負(fù)載咪鮮胺或吡唑醚菌酯后，能提高殺菌劑被油菜吸收與傳導(dǎo)的能力，制備的納米農(nóng)藥平均粒徑均在150 nm左右。趙金浩等[20]采用“納米籠”方法制備的納米噻唑鋅，粒徑只有35 nm左右，提高噻唑鋅的藥效達(dá)10%以上；徐漢虹等[21]通過高分子納米材料負(fù)載典型非內(nèi)吸性農(nóng)藥阿維菌素后，粒徑只有60 nm左右，除了顯著增加生物活性，還能夠通過作物葉片吸收后在體內(nèi)輸導(dǎo)，而商品化的阿維菌素微乳劑即使達(dá)到了納米尺寸100 nm左右，但并未有報(bào)道其具有內(nèi)吸傳導(dǎo)性。距今為止，多數(shù)報(bào)道的納米農(nóng)藥平均粒徑均在1～300 nm。測(cè)試方法除了基于動(dòng)態(tài)光散射(DLS)的激光粒度測(cè)定法，還會(huì)結(jié)合電鏡技術(shù)(SEM或TEM)來(lái)綜合判斷。

因此，本課題組在前期制備納米噻唑鋅、納米咪鮮胺(PD@ZIF-8)、納米吡唑醚菌酯(Pyr@ZIF-8)的研究基礎(chǔ)和技術(shù)手段上，對(duì)市場(chǎng)上能采購(gòu)到的幾種商品化微乳劑，從顆粒粒徑的角度，采用DLS納米粒度測(cè)定儀和掃描電鏡對(duì)微乳劑的微觀粒徑和形貌進(jìn)行探究。

1 材料與方法

1.1 材料

商品化微乳劑(為避免引起歧義與糾紛，特隱去生產(chǎn)廠家的名稱)：4.5%高效氯氰菊酯·甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽微乳劑(微乳劑1，ME-1)、5%高效氯氟氰菊酯微乳劑(ME-2)、5%胺·氯菊殺蟲微乳劑(ME-3)、5%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽微乳劑(ME-4)和0.1%三十烷醇微乳劑(ME-5)。

ZIF-8納米農(nóng)藥：本實(shí)驗(yàn)制備以ZIF-8作為載體的納米咪鮮胺(PD@ZIF-8)作為對(duì)照樣品，詳細(xì)制備方法及結(jié)構(gòu)表征見文獻(xiàn)報(bào)道[18]。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

Zetasizer Nano S90激光粒度分析儀(英國(guó)馬爾文公司)；JSM5600LV掃描電子顯微鏡(日本電子株式會(huì)社)；Zeiss，G300場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(德國(guó)卡爾蔡司股份公司)。

1.3 方法

1.3.1 微乳劑粒徑測(cè)定

不同商品化微乳劑的粒徑分布通過ZS-90馬爾文激光粒度儀進(jìn)行測(cè)定。該儀器以633 nm激光作為光源，掃描角度為90°，測(cè)定范圍為0.3 nm～5 μm。樣品測(cè)定前用水分別稀釋為有效成分含量為10 000、1 000和100 μg·mL-1的溶液。

1.3.2 微乳劑顆粒形貌觀察

分別用水將不同商品化微乳劑稀釋成有效成分含量為100 μg·mL-1的溶液，滴加到導(dǎo)電硅片上，待干燥后進(jìn)行噴金處理。采用熱場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(蔡司G300)對(duì)干燥后微乳劑的顆粒形貌進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與討論

2.1 微乳劑的粒徑及其分布

在噴施農(nóng)藥時(shí)，一般須將商品化農(nóng)藥制劑加水稀釋到一個(gè)對(duì)作物安全的濃度，方能施用。因此，為探究農(nóng)藥顆粒在被稀釋過程中粒徑是否發(fā)生改變，使用馬爾文激光粒度測(cè)定儀對(duì)5種不同的商品化微乳劑，分別用水稀釋成有效濃度含量為100、1 000、10 000 μg·mL-1后，進(jìn)行粒徑測(cè)定，同時(shí)以本實(shí)驗(yàn)室合成的ZIF納米農(nóng)藥(PD@ZIF-8)作為對(duì)照樣品。首先得到各藥劑不同濃度下的粒徑分布圖(圖1)。微乳劑5種產(chǎn)品不同濃度下的粒徑分布并不統(tǒng)一，差異較大，而對(duì)照藥劑ZIF-8納米農(nóng)藥不同濃度下的粒徑分布差異不大，比較統(tǒng)一，平均粒徑都在250～300 nm，變化不大。

圖1 不同稀釋濃度下商品化微乳劑的粒徑分布圖(以ZIF納米農(nóng)藥為對(duì)照)

基于DLS測(cè)定粒徑，可以得到平均粒徑、多分散指數(shù)、累計(jì)粒度分布百分?jǐn)?shù)為50%的粒徑(D50)和累計(jì)粒度分布百分?jǐn)?shù)為90%的粒徑(D90)等主要統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，其中多分散指數(shù)，即相對(duì)偏差，是指示分散度的一個(gè)重要指標(biāo)。各種藥劑的具體粒徑數(shù)據(jù)見表1，可以看出，微乳劑1、微乳劑2和微乳劑3在不同稀釋倍數(shù)下，平均粒徑差異不大，均處于100 nm范圍內(nèi)，然而D90時(shí)，微乳劑1和微乳劑3最大粒徑分別可達(dá)到2 320和3 730 nm。而微乳劑4和微乳劑5在不同稀釋倍數(shù)下均呈現(xiàn)出更寬的粒徑變化趨勢(shì)，平均粒徑最大可達(dá)868.6和851.0 nm，此外D90最大粒徑分別可達(dá)到2 850和5 350 nm，這說(shuō)明微乳劑中農(nóng)藥膠束的形成處于動(dòng)態(tài)平衡中，在稀釋過程中粒徑會(huì)隨不同稀釋程度發(fā)生無(wú)規(guī)律性變化，且可能會(huì)出現(xiàn)破乳后藥物大顆粒析晶的現(xiàn)象，最終造成粒徑不均一，并不都處于以粒徑定義的納米農(nóng)藥范疇內(nèi)。反之，通過對(duì)比測(cè)定同等藥物含量的ZIF納米農(nóng)藥(PD@ZIF-8)，可發(fā)現(xiàn)平均粒徑都在250～300 nm，變化不大，D50和D90均無(wú)顯著的變化。表明液態(tài)化的微乳劑在不同濃度條件下，粒徑分布會(huì)動(dòng)態(tài)寬幅變化，而負(fù)載化的納米農(nóng)藥以固體顆粒形式存在，不同濃度稀釋不會(huì)改變顆粒的粒徑大小。

表1 不同稀釋濃度下商品化微乳劑的粒徑參數(shù)

2.2 微乳劑電鏡下的微觀形貌

農(nóng)藥噴施后，短期以液滴形式附著于作物表面，隨著水分蒸發(fā)，在葉面逐漸干燥，最后微觀下還是以固體狀態(tài)存在，因此，通過掃描電鏡探究同等藥物含量的商品化微乳劑與ZIF納米農(nóng)藥液滴干燥后的顆粒形貌與大小。如圖2所示，商品化微乳劑液滴干燥后盡管依然存在少量以納米尺寸存在的藥物晶體顆粒，但是可觀察到大量的藥物顆粒分布很不均勻，有顆粒聚集現(xiàn)象，有的顆粒高達(dá)微米級(jí)，藥物的分布不均和結(jié)塊造成局部接觸濃度過高，這可能也是影響農(nóng)藥有效利用率與作物產(chǎn)生藥害的主要原因之一。ZIF納米農(nóng)藥(PD@ZIF-8)液滴干燥后，仍然可觀察到單分散的納米顆粒，平均粒徑在129 nm左右[18]，顆粒與顆粒之間相對(duì)獨(dú)立，除了因小顆粒之間的弱相互作用力造成的吸附作用外，沒有明顯的結(jié)塊現(xiàn)象。微乳劑沒有呈現(xiàn)出納米顆粒所具有的更高的持效性、緩釋能力與作物的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)能力等優(yōu)點(diǎn)，可能與微觀下顆粒不均，發(fā)生聚集、結(jié)塊，導(dǎo)致作物吸收轉(zhuǎn)運(yùn)不夠有關(guān)系。

微乳劑分散在水中后有效成分粒徑較小，呈現(xiàn)透明狀態(tài)，主要是借助表面活性劑的增溶作用將液體或固體原藥均勻分散在水中形成的一種水包油型(O/W)膠束，表面活性劑的用量一般為活性物質(zhì)的兩倍以上，并且需要一定量的有機(jī)溶劑和增溶劑。表面活性劑和溶劑的選擇非常關(guān)鍵，否則極易發(fā)生結(jié)晶和轉(zhuǎn)相。鑒于微乳劑中農(nóng)藥膠束的粒徑與形成機(jī)制，膠束應(yīng)歸類為兩親性膠體，而不應(yīng)該是固體納米顆粒，因?yàn)榻M成膠束的單分子或單聚體處于動(dòng)態(tài)平衡中，在特定的場(chǎng)景下，農(nóng)藥膠束的形態(tài)與粒徑可能會(huì)發(fā)生改變，如膠束溶液濃度的改變或者干燥[22]。這與表1不同濃度稀釋下粒徑差異比較大和干燥后電鏡下微觀形貌(圖2)中的結(jié)果也比較吻合。納米農(nóng)藥從其科學(xué)本身屬性來(lái)說(shuō)，其最主要的技術(shù)指標(biāo)為納米尺度，納米制劑要發(fā)揮其納米尺度效應(yīng)，必須保證其噴施到靶標(biāo)作物葉面或者直接使用時(shí)為納米尺度[13]，僅僅制劑分散形態(tài)為納米尺度是不夠的，就像微乳劑，必須兌水稀釋施用，稀釋的過程會(huì)改變制劑的分散狀態(tài)帶來(lái)新的分散，不一定能保證在葉面上是納米級(jí)別的單分散狀態(tài)。

圖2 不同商品化微乳劑與ZIF納米農(nóng)藥的掃描電鏡

3 小結(jié)

本研究基于DLS測(cè)試粒徑基礎(chǔ)上首次結(jié)合SEM技術(shù)，從粒徑大小和微觀形貌特征視角下，對(duì)市場(chǎng)上常見的幾種商品化微乳劑進(jìn)行了詳細(xì)的測(cè)試分析，并與本課題組前期制備的ZIF納米農(nóng)藥進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)幾種商品化微乳劑在稀釋過程中粒徑均無(wú)規(guī)律改變，尤其在掃描電鏡下觀察含藥液滴干燥后顆粒分布不均，有聚集、大顆粒析出現(xiàn)象，而納米農(nóng)藥經(jīng)過不同濃度稀釋后粒徑變化不大，均在1～300 nm，并且在掃描電鏡下觀察微觀形貌也是單分散納米狀態(tài)，不會(huì)聚集，這表明在實(shí)際應(yīng)用場(chǎng)景中均以納米尺度分散狀態(tài)穩(wěn)定存在。因此，單靠動(dòng)態(tài)光散射測(cè)定的粒徑不能判斷微乳劑就是納米農(nóng)藥，還需要參考電鏡技術(shù)觀察微觀下的分散狀態(tài)和粒徑變化情況，本研究為我國(guó)納米農(nóng)藥的發(fā)展提供了分析鑒定技術(shù)方法，也為我國(guó)納米農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)制定提供了數(shù)據(jù)支撐。