利用熒光SSR標記構(gòu)建歐李種質(zhì)分子身份證1)

劉國彬 姚硯武 曹均

(北京市農(nóng)林科學院林業(yè)果樹研究所，北京,100093)

歐李(Cerasushumilis(Bge.) Sok.)屬薔薇科(Rosaceae)櫻屬(Cerasus)，是我國特有植物資源[1-2]，主要分布在我國東北、華北、西北等干旱、寒冷地區(qū)及華東、華中部分地區(qū)[3-4]，具有重要的生態(tài)、觀賞、食用和保健價值[5-8]。歐李作為北方地區(qū)特色的生態(tài)經(jīng)濟型資源，我國學者在品質(zhì)評價[9]、親緣關(guān)系分析[3，10]、基因克隆[11-12]等方面進行了持續(xù)研究，在歐李資源調(diào)查、收集、開發(fā)與利用方面取得較大進展，選育出了一批優(yōu)良品種[6，13-16]?！笆濉逼陂g，北京市農(nóng)林科學院林業(yè)果樹研究所在國家科技基礎(chǔ)性工作專項“華北山區(qū)經(jīng)濟樹種種質(zhì)資源收集和保存”項目的支持下，收集歐李資源300余份，選育優(yōu)良種質(zhì)50余份，審定良種1個。隨著近年來各地歐李資源的相互引進，不同產(chǎn)地的歐李資源經(jīng)過多次引進后，資源身份信息被人為混淆，因此開展新品種保護、種質(zhì)鑒定及親緣關(guān)系分析等工作對于歐李資源引種、種質(zhì)保護與利用極為重要。

歐李種質(zhì)鑒定與分類的傳統(tǒng)方法主要有形態(tài)學和同工酶分析[17-18]，但由于受環(huán)境影響較大、穩(wěn)定性較差，在種質(zhì)鑒定上存在一定的局限性。隨著分子標記技術(shù)的開發(fā)與應(yīng)用，多種分子標記在植物遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系分析與品種鑒定等方面得到應(yīng)用，包括RAPD、ISSR、SRAP、AFLP、SSR等，其中SSR標記具有共顯性、多態(tài)性高、穩(wěn)定性好等特點，是一種高效的分子標記技術(shù)，和SNP標記一起在BMT測試指南草案中被推薦為適合構(gòu)建品種指紋圖譜數(shù)據(jù)庫的兩項技術(shù)。目前，SSR標記已經(jīng)成功應(yīng)用于葡萄、枸杞、月季、茶樹等植物品種指紋圖譜的構(gòu)建[19-22]，而有關(guān)SSR標記在歐李種質(zhì)分子身份證構(gòu)建上的應(yīng)用較少。

本研究以北京市農(nóng)林科學院林業(yè)果樹研究所收集保存的歐李優(yōu)良種質(zhì)及近緣種李、杏李為試材，利用熒光SSR標記技術(shù)，構(gòu)建15個歐李優(yōu)良無性系的分子身份證，旨在保護歐李優(yōu)新品種的知識產(chǎn)權(quán)，并為歐李種質(zhì)資源的分子鑒定奠定理論基礎(chǔ)和提供分子技術(shù)支撐，這對于歐李及其近緣屬植物新品種選育及品種保護具有重要意義。

1 材料與方法

本研究所用材料均從北京、天津、河北、山西等地歐李自然分布區(qū)收集保存的優(yōu)良種質(zhì)，均為野生資源，通過實生選優(yōu)獲得，共19份(表1)，其中歐李種質(zhì)15份，近緣屬李3份，杏李1份，均通過嫁接方式保存于資源圃內(nèi)。于5月初采集供試歐李及其近緣種的幼嫩葉片，硅膠干燥，用于基因組DNA提取。

1.1 基因組DNA提取與引物篩選

葉片基因組DNA的提取采用CTAB法[23]，加入30～50 μL TE-buffer，紫外分光光度計和0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，稀釋至30 mg·L-1保存?zhèn)溆谩?/p>

試驗所用的SSR引物參考歐李近緣種屬李屬的櫻桃、桃及杏上發(fā)表的引物[24-29]，分別進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，從21對引物中篩選出條帶清晰、多態(tài)性高的13對SSR引物(表2)，由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司合成，用FAM(藍色)熒光修飾上游引物5’端，對19份材料進行分析。

表1 供試19份種質(zhì)及分子身份證編碼

表2 試驗選用的SSR引物基本信息

1.2 DNA擴增和毛細管電泳

25 μL的SSR標記的PCR反應(yīng)體系包括2×Taq PCR mix 12.5 μL，10 μmol·L-1上游引物0.5 μL，10 μmol·L-1下游引物0.5 μL，30 mg·L-1DNA模板1.0 μL，ddH2O 10.5 μL。

PCR擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，65～55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進行35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min后4 ℃保存。

將甲酰胺與分子質(zhì)量內(nèi)標ROX500按100∶1的體積混合后，取9 μL加入96孔上樣板中，再加入1 μL稀釋10倍的PCR產(chǎn)物，使用ABI 3730 XL sequencer進行毛細管電泳。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用軟件GeneMapper 4.0分析原始數(shù)據(jù)并獲得每對引物在不同樣品上的擴增片段長度，利用Conert 1.31軟件轉(zhuǎn)化成POPGENE分析所要求的格式，然后使用POPGENE 1.32軟件進行統(tǒng)計分析，基于NTsyspc2.10軟件利用UPGMA法進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選

歐李葉片基因組DNA提取后通過瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性(圖1)。從薔薇屬植物已公布的SSR引物中挑選多態(tài)性較好的21對引物(表2)，隨機抽取6個歐李無性系DNA混合形成2個混合DNA模板，然后利用21對SSR引物進行PCR擴增驗證，共獲得能夠穩(wěn)定擴增且條帶清晰的引物13對，即BPPCT040(引物1和13)、PceGA59(引物3)、Pchcms4(引物4)、Pchgms4(引物5)、UDP96-008(引物7)、UDP97-403(引物8和19)、UCD-CH31(引物10)、PTCR22(引物11)、BPPCT008(引物12)、EPPCU9168(引物16)、MA007a(引物17)、UDAP-429(引物18)、UCD-CH17(引物21)。使用13對具有較好多態(tài)性的引物對歐李優(yōu)良無性系和近緣種共19份資源進行分析。

2.2 SSR引物擴增多態(tài)性

13對引物在19份材料中共檢測到基因片段98個，每對引物檢測到的基因片段為3～12個，平均基因片段7.5個，最少的Pchcms4引物只擴增出3個基因片段，最多的BPPCT040擴增出來12個基因片段，其中檢測到的基因片段數(shù)超過平均值的有7個，分別為BPPCT040、Pchgms4、EPPCU9168、MA007a、PTCR22、UDAP-429與PceGA59(表3)。

表3 歐李種質(zhì)資源及其近緣種的遺傳多樣性參數(shù)

13對引物在19份材料中共檢測得到等位基因88個，每對引物檢測到的等位基因數(shù)在2～12個，平均每對引物擴增出6.7個等位基因，有效等位基因數(shù)為3.822 4。13對SSR引物間存在較大差異，其中觀測等位基因數(shù)最多的引物是BPPCT040，為12個，其有效等位基因數(shù)為6.504 5；其次為Pchgms4、EPPCU9168，觀測等位基因數(shù)分別為11、10個，對應(yīng)的有效等位基因數(shù)分別為7.520 8和4.349 4；觀測等位基因數(shù)最少的是引物Pchcms4，只有2個，有效等位基因數(shù)為1.566 2。13對SSR引物中，擴增的等位基因數(shù)超過平均值的有5對，分別為BPPCT040、Pchgms4、EPPCU9168、PTCR22、PceGA59。等位基因數(shù)和等位基因片段數(shù)越多，該引物的多態(tài)性越高，在不同種質(zhì)中的鑒定能力越強，13對SSR引物可區(qū)分歐李種質(zhì)資源數(shù)量從3～11份不等，平均每對SSR引物可區(qū)分6份種質(zhì)，區(qū)分率為16.67%～91.67%，其中區(qū)分率最高的是引物BPPCT040，其對應(yīng)的等位基因片段數(shù)和等位基因數(shù)最大，可區(qū)分11份種質(zhì)；最低的是引物Pchcms4，其對應(yīng)的等位基因片段數(shù)和等位基因數(shù)最小，僅能區(qū)分2份種質(zhì)(表4)。部分種質(zhì)在位點BPPCT040的指紋圖譜見圖3。

表4 單一引物在歐李種質(zhì)中的區(qū)分率

13對SSR引物的多態(tài)信息含量范圍為0.296 1(Pchcms4)～0.853 3(Pchgms4)，平均值為0.629 7，表明這些引物在歐李種質(zhì)擴增中具有多態(tài)性。期望雜合度(He)和觀測雜合度(Ho)的變化范圍分別為0.371 3(Pchcms4)～0.890 5(Pchgms4)、0.052 6(PceGA59與Pchcms4)～1.000 0(BPPCT040)，平均分別為0.683 3、0.429 1。Shannon信息多樣性指數(shù)的變化范圍為0.547 4(Pchcms4)～2.179 9(Pchgms4)，平均為1.435 2，說明本研究所選歐李種質(zhì)具有較為豐富的遺傳多樣性。

2.3 親緣關(guān)系分析

本研究采用NTSYS-PC計算歐李種質(zhì)及其近緣種屬植物的遺傳相似性系數(shù)和遺傳距離(表5)。不同歐李種質(zhì)間的遺傳相似度在0～1，其中Cerhu-7與Cerhu-8兩者之間，Cerhu-13、Cerhu-14與Cerhu-15三者之間的遺傳相似系數(shù)最高(1.000 0)，推測Cerhu-7與Cerhu-8為收集的同一種質(zhì)，Cerhu-13、Cerhu-14與Cerhu-15為同一種質(zhì)，可能在保存過程中混淆所致。其余種質(zhì)間遺傳相似系數(shù)在0.359 1～0.733 7。不同種質(zhì)歐李與近緣種屬杏李及3份李種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)均在0.13以內(nèi)，杏李與3份李種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)在0.524 4～0.524 8，不同李種質(zhì)間的相似系數(shù)在0.863 6～0.954 5。根據(jù)13對SSR引物對19份種質(zhì)的擴增結(jié)果，采用UPGMA法對所有供試種質(zhì)進行聚類分析(圖4)，結(jié)果表明，在遺傳相似性系數(shù)為0時，將供試材料分為兩大類，其中15份歐李種質(zhì)聚為一類，杏李及3份李種質(zhì)聚為一類，進一步說明歐李與杏李、李間親緣關(guān)系較遠，而杏李與李親緣關(guān)系較近，供試李種質(zhì)批次間親緣關(guān)系最近。在15份歐李種質(zhì)中，親緣近的聚為一類，如來自天津地區(qū)的Cerhu-1、Cerhu-11、Cerhu-2、Cerhu-7與Cerhu-8聚為一類，來自河北地區(qū)的Cerhu-3、Cerhu-4、Cerhu-9、Cerhu-12、Cerhu-13、Cerhu-14、Cerhu-15聚為一類，來自山西地區(qū)的Cerhu-5、Cerhu-6、Cerhu-10聚為一類。聚類結(jié)果進一步表明Cerhu-7與Cerhu-8為同一種質(zhì)，Cerhu-13、Cerhu-14和Cerhu-15為同一種質(zhì)。

表5 歐李不同品種間遺傳距離和遺傳相似性系數(shù)的無偏估計值(Nei)

續(xù)(表5)

2.4 分子身份證構(gòu)建

根據(jù)13對SSR引物擴增獲得的基因片段大小按從多到少排序，將各對引物獲得的基因片段按照從小到大的順序排列，并從阿拉伯數(shù)字1開始賦值，若基因片段超過9個，多出部分從英文小寫字母a開始賦值，因本研究中檢測到最多的基因片段為12，對應(yīng)賦值范圍為1-9+a-c(表6)。若有2對以上的引物檢測到同等數(shù)量的基因片段，則按照各對引物中基因片段的大小對引物位置進行排序。如本研究中引物BPPCT040檢測到的基因片段最多(12個)，排在第1位，而在該引物檢測到的最小基因片段中，最小值119 bp,賦值1，最大值為141 bp，賦值c；引物Pchgms4和EPPCU9168檢測到的基因片段均為11個，但引物Pchgms4檢測到的最小基因片段為146 bp，而EPPCU9168檢測到的最小基因片段中最小值為173 bp，則引物Pchcms4排在第2位，EPPCU9168排在第3位；引物Pchcms4檢測到的基因片段數(shù)最少(3個)，排在最后一位，以此類推。根據(jù)15份歐李種質(zhì)的親緣關(guān)系分析結(jié)果，推測Cerhu-7與Cerhu-8為同一種質(zhì)，Cerhu-13、Cerhu-14和Cerhu-15為同一種質(zhì)；本研究根據(jù)表6中對基因片段的賦值標準和13對SSR引物對不同歐李種質(zhì)的擴增結(jié)果，對剩余12份親緣關(guān)系不同的歐李種質(zhì)及1份杏李、3份李種質(zhì)進行分子身份證編碼，結(jié)果顯示(表1)，選取的13對引物可以將16份材料進行有效區(qū)分和編碼，其中以基因片段數(shù)大于平均值為主的7對引物的兩兩組合中，區(qū)分率出現(xiàn)83.33%和100.00%，其中有13組引物組合可將12份歐李種質(zhì)完全區(qū)分，8組引物組合可區(qū)分11份歐李種質(zhì)(表7)，而近緣屬種的3份李種質(zhì)則需要13對引物才能完全區(qū)分。

本研究將每份歐李種質(zhì)在13個位點獲得的等位基因片段按照賦值數(shù)字(含字母)編碼獲得每份種質(zhì)獨有的分子身份編碼(表1)，其中，推測為同一種質(zhì)的Cerhu-7與Cerhu-8具有相同的分子身份編碼，Cerhu-13、Cerhu-14和Cerhu-15具有相同的分子身份編碼，其余種質(zhì)具有獨屬于自己的分子身份編碼。

表6 SSR引物擴增基因片段大小 bp

表7 基因片段數(shù)大于平均值的7對引物組合的區(qū)分效率

3 討論

優(yōu)良種質(zhì)資源的精準鑒定是植物新品種保護的基石，為每一個物種找到一個快速、準確的鑒定方法，對植物新品種保護與利用至關(guān)重要，分子指紋圖譜、分子身份證是植物基因資源鑒別、種質(zhì)鑒定和植物新品種保護的重要遺傳學工具，利用分子標記技術(shù)構(gòu)建歐李不同種質(zhì)分子身份證，對于歐李種質(zhì)創(chuàng)新與品種保護具有重要意義。目前，用于分子身份證構(gòu)建的分子標記技術(shù)主要有RAPD、ISSR、SRAP、SSR、AFLP及InDel、CDDP等，其中SSR標記具備多態(tài)性高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用與果樹與林木的分子身份證或指紋圖譜構(gòu)建，如基于SSR標記技術(shù)構(gòu)建了葡萄、蘋果、刺槐、楊樹等種質(zhì)資源的分子身份證。本研究利用篩選出來的13對SSR引物對15份歐李種質(zhì)資源、1份杏李資源和3份李資源進行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，平均每對引物檢測到的等位基因數(shù)為6.7個，平均每對引物檢測到的等位基因片段數(shù)為7.5個；多態(tài)信息含量變幅在0.296 1～0.853 3，平均0.629 7；Shannon信息指數(shù)變幅在0.547 4～2.179 9，平均為1.435 2。本研究結(jié)果與尹躍等[20]利用24對SSR引物對16個枸杞品種進行擴增的結(jié)果類似，較毛秀紅等[30]的研究結(jié)果高，分析認為一方面可能與供試材料間遺傳背景差異大有關(guān)，19份供試種質(zhì)來源于4個不同地區(qū)且歐李材料均為野生種質(zhì)；另一方面也說明所選引物具有較高的多態(tài)性，也反映了多態(tài)信息含量、Shannon信息指數(shù)以及等位基因數(shù)的大小與SSR引物的數(shù)量多少關(guān)系不大，但與引物自身多態(tài)性密切相關(guān)。

DNA指紋圖譜的獲得是構(gòu)建分子身份證的基礎(chǔ)。高源等[31]基于SSR標記技術(shù)獲得了供試蘋果種質(zhì)的指紋圖譜數(shù)據(jù)和引物多態(tài)性，并通過對比分析獲得可將所有材料完全區(qū)分的核心引物，然后將核心引物獲得的等位基因按照從大到小的順序排列，并用阿拉伯數(shù)字從1開始賦值，從而獲得每份材料獨有的字符串，再利用條碼技術(shù)將每份材料按相同位點順序排序的編碼字符串轉(zhuǎn)化成每份材料獨特的條碼標識；王慧玲等[22]則是在獲得指紋圖譜的基礎(chǔ)上，采用最小等位基因編碼法，即根據(jù)每對引物對不同材料擴增片段對應(yīng)的分子質(zhì)量大小，按從小到大依次編碼，當引物擴增的某一品種等位基因有2個時，按等位基因堿基數(shù)較小的條帶編碼賦值，從而獲得供試材料的分子身份證。本研究先通過親緣關(guān)系分析和聚類分析，將同物異名種質(zhì)進行區(qū)分，然后采用與葡萄[22]、桃[32]類似的編碼方法構(gòu)建供試歐李種質(zhì)及其近緣種的分子身份證，唯一不同的在于本研究所選部分引物的擴增條帶數(shù)超過9條，因此除了賦值1～9外，超過9條的部分從英文小寫字母“a”開始賦值，用阿拉伯數(shù)字與英文字母結(jié)合的方式編碼賦值，構(gòu)建了15份歐李種質(zhì)、1份杏李和3份李種質(zhì)的分子身份證，為后續(xù)歐李新品種保護和種質(zhì)引進與利用提供科學依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究基于瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳從歐李近緣種屬已公布的SSR引物中篩選出多態(tài)性豐富、擴增穩(wěn)定性好的引物13對，對15份歐李、1份杏李、3份李共計19份種質(zhì)進行遺傳多樣性分析和親緣關(guān)系鑒定，共檢測到等位基因88個，每對引物檢測到的等位基因數(shù)在2～12個，平均6.7個；獲得等位基因片段98個，每對引物獲得的等位基因片段數(shù)在3～12個，平均7.5個。多態(tài)信息含量變幅在0.296 1～0.853 3，平均為0.629 7；Shannon信息指數(shù)變幅在0.547 4～2.179 9，平均為1.435 2。親緣關(guān)系分析將歐李種質(zhì)分為3類，并與歐李資源收集地域相吻合；確定了歐李種質(zhì)Cerhu-7與Cerhu-8為同一種質(zhì)，Cerhu-13、Cerhu-14和Cerhu-15為同一種質(zhì)，剩余12份材料為親緣關(guān)系不同的種質(zhì)；相較于歐李，杏李與李親緣關(guān)系較近，且供試3份李種質(zhì)親緣關(guān)系最近。13對SSR引物可區(qū)分歐李種質(zhì)資源數(shù)量從3～11份不等，平均每對SSR引物可區(qū)分6份種質(zhì)，區(qū)分率為16.67%～91.67%，以基因型大于平均值為主的7對引物的兩兩組合中，有13個引物對組合可完全區(qū)分親緣關(guān)系不同的歐李種質(zhì)。本研究在獲得DNA指紋圖譜原始數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，采用最小等位基因編碼法構(gòu)建了不同親緣關(guān)系的歐李種質(zhì)及其近緣種的分子身份證，結(jié)果說明SSR標記技術(shù)是植物分子指紋圖譜構(gòu)建的有效手段，同時本研究結(jié)果也證實SSR引物在種屬間具有通用性。