基于HPLC法考察5種賦形劑對雙柏散制成糊劑有效成分的影響*

藍鮮艷，張洪平，盧鮮云，鄭厚平，梁學政

（柳州市中醫(yī)醫(yī)院，廣西 柳州 545001）

雙柏散是廣東省已故名老中醫(yī)黃耀燊的經驗方，由大黃、側柏葉、黃柏、澤蘭、薄荷5味藥材組成。方中諸藥合用，共奏活血化瘀、清熱解毒、消腫止痛之功，切中急性軟組織損傷、瘡瘍、急腹癥的病機，對局部損傷的紅腫熱痛、創(chuàng)面感染等諸癥有良效[1]。目前本方多用于治療靜脈炎[2]、痛風性關節(jié)炎[3]、盆腔炎[4]、癌癥疼痛[5]等多種疾病。現(xiàn)代藥理研究[6-8]證實本方具有良好的抗炎、止痛作用。蒽醌類、生物堿、黃酮類、揮發(fā)油、鞣質等成分均是雙柏散抗炎、消腫、止痛、抑菌作用的化學物質基礎[9]?！吨嗅t(yī)藥單用/聯(lián)合抗生素治療盆腔炎性疾病臨床實踐指南》、相關文獻、臨床調查等顯示雙柏散外敷的具體用法、用量尚未明確，使用賦形劑不同，可能影響其臨床療效[10]。因藥物療效與所含有效成分含量有關[11]。在中藥復方制劑質量標準研究中，中藥指紋圖譜因基于光譜及色譜法可加強分離性及檢測能力，逐漸成為較為主流的檢測模式。高效液相色譜法（HPLC法）精密度及重現(xiàn)性等相對較高，在當前中藥復方制劑質量控制中常被使用[12]。如雷秀星等[13]采用HPLC法同時測定中藥復方中多種化學成分的含量。前期調查發(fā)現(xiàn)，不同的臨床科室根據用藥習慣選擇使用蜂蜜水、姜汁、白糖水、醋、水等不同輔料調制雙柏散成黏度適中糊劑外敷患處或穴位。為確保所配制糊劑藥品質量，多數(shù)科室采用現(xiàn)配現(xiàn)用，最長置冰箱冷藏不超過24 h。由于不同輔料可影響藥品質量[14]，本課題組為考察不同輔料對雙柏散藥品質量的影響，使用HPLC法測定臨床常用賦形劑（蜂蜜水、姜汁、白糖水、醋、水）調制雙柏散制成糊劑后小檗堿、大黃素的含量，現(xiàn)將結果匯報如下。

1 材 料

1.1 儀器Agilent Technologies 1260 Infinity高效液相色譜儀、Waters2998型紫外檢測器、EmPower色譜工作站（美國沃特世公司）；CF225D型電子天平（德國賽多利斯集團）；JY2002電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；HK250型科導臺式超聲波清洗器（上海漢克科學儀器有限公司）；800Y型高速多功能粉碎機（武義海納電器有限公司）。

1.2 藥物與試劑雙柏散（批號：20200601）由柳州市中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供；小檗堿對照品（批號：MUST-19072501，含量：98.38%）、大黃素對照品（批號：MUST-19100810，含量：98.73%）均購自中國科學院成都生物研究所；乙腈為色譜純（湖北弗頓科學技術有限公司）；其他試劑均為分析純；實驗用水為超純水；蜂蜜（批號：20200412）購自廣西蜜博士蜂業(yè)有限責任公司；白糖（批號：20210407）購自柳州市柳冰食品廠；醋（批號：20200828）購自柳江縣耀元調味食品廠；生姜汁（自制）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件色譜柱：Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×150 mm，4 μm）；流動相：溶劑A為乙腈，B為0.4%磷酸水（0～5 min，12%A；5～10 min，12%A～20%A；10～18 min，20%A～27%A；18～25 min，27%A～31%A；25～30 min，31%A～65%A；30～40 min，65%A），梯度洗脫，流速為1 mL/min，檢測波長為275 nm，柱溫為26℃，進樣量為10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 樣品的制備 取雙柏散50.00 g，加入110 mL蜂蜜水（V蜂蜜∶V水=1∶10），攪拌均勻，即得蜂蜜調制糊劑樣品（以下簡稱蜂蜜組）。同法分別加入110 mL糖水（V白糖∶V水=1∶10）、姜汁（V姜汁∶V水=1∶10）、醋、水，制備蜂蜜調制糊劑樣品（以下簡稱蜂蜜組）、糖水調制糊劑樣品（以下簡稱糖水組）、姜汁調制糊劑樣品（以下簡稱姜汁組）、醋調制糊劑樣品（以下簡稱醋調組）、純水調制糊劑樣品（以下簡稱水調組）。

2.2.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取小檗堿1.32 mg、大黃素0.33 mg，混合置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，即得小檗堿、大黃素質量濃度分別為0.026 4、0.006 4 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取蜂蜜組樣品5.00 g，置具塞三角瓶中，加入50 mL甲醇，稱定質量，超聲提取30 min，提取2次，取出放涼并稱定質量，用甲醇補足減輕的質量，搖勻、濾過，取續(xù)濾液即得蜂蜜組供試品溶液。同法制備糖水組、姜汁組、醋調組、水調組供試品溶液。

2.2.4 陰性對照品溶液制備 按雙柏散處方比例和制備工藝，制備缺大黃、黃柏的陰性對照品，按照“2.2.1”“2.2.3”項下制備，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性試驗 分別吸取混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各10 μL，注于高效液相色譜儀，按“2.1”項色譜條件測定。結果供試品溶液色譜圖中的積分峰與混合對照品溶液中的積分峰一一對應，陰性對照品溶液色譜圖中沒有出現(xiàn)相應保留時間的峰，表明該方法的專屬性良好。（見圖1）

圖1 HPLC圖

2.3.2 線性關系考察 精密稱取小檗堿0.88 mg、大黃素0.22 mg，混合置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，得小檗堿、大黃素質量濃度分別為0.017 6、0.004 3 mg/mL的對照品溶液。依次配制至0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75倍，制得小檗堿質量濃度為0.0088、0.013 2、0.017 6、0.022 0、0.026 4、0.035 2 mg/mL，大黃素 質 量 濃 度 為0.002 2、0.003 2、0.004 3、0.005 4、0.006 4、0.008 6 mg/mL的系列混合對照品溶液。按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算含量。以質量濃度（x，mg/mL）為橫坐標，以峰面積（y）為縱坐標，進行線性回歸，求得小檗堿、大黃素回歸方程分別為：y=21 614x-14.509（r=0.999 7），y=32 223x-4.054 7（r=0.999 4）。結果表明小檗堿在0.008 8～0.035 2 mg/mL、大黃素在0.002 2～0.008 6 mg/mL范圍內，線性關系良好。

2.3.3 精密度試驗 精密吸取“2.2.3”項下蜂蜜組供試品溶液10 μL，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結果小檗堿、大黃素對照品峰面積的RSD分別為0.11%、0.23%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取“蜂蜜組”雙柏散樣品適量，按“2.2.3”項方法制備供試品溶液，在室溫下放置0、2、4、6、8、16、24 h后，按“2.1”項色譜條件進行測定，記錄小檗堿、大黃素峰面積。結果小檗堿、大黃素峰面積的RSD值分別為0.65%、0.18%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復性試驗 取“蜂蜜組”雙柏散樣品適量，按“2.2.3”項方法制備雙柏散供試品溶液6份，按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄小檗堿、大黃素峰面積。結果小檗堿、大黃素峰面積的RSD值分別為1.41%、0.49%，表明該方法重復性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 取同批“蜂蜜組”雙柏散樣品12份，每份約2.50g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別加入0.6788mg/mL、0.142 5 mg/mL的小檗堿、大黃素對照品1 mL，按“2.2.3”項方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件進行測定，計算小檗堿、大黃素加樣回收率。（見表1）

表1 加樣回收率實驗結果（n=6）

2.4 不同輔料組供試品溶液中小檗堿和大黃素測定結果采用軟件SPSS22.0進行統(tǒng)計分析，計量資料以“均數(shù)±標準差”（±s）表示，若數(shù)據符合正態(tài)性檢驗，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。與水調組比較，蜂蜜組、醋調組、姜汁組、糖水組雙柏散提取物中小檗堿含量均明顯降低（P＜0.05）；與蜂蜜組比較，姜汁組雙柏散提取物中小檗堿含量明顯降低（P＜0.05），糖水組雙柏散提取物中小檗堿含量明顯升高（P＜0.05）；醋調組雙柏散提取物中小檗堿含量與蜂蜜組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。各組小檗堿含量高低排序：水調組＞糖水組＞蜂蜜組=醋調組＞姜汁組。

與水調組比較，蜂蜜組雙柏散提取物中大黃素含量明顯升高（P＜0.05），醋調組、姜汁組、糖水組雙柏散提取物中大黃素含量均明顯降低（P＜0.05）；與醋調組比較，姜汁組、糖水組雙柏散提取物中大黃素含量均明顯升高（P＜0.05）；與姜汁組比較，糖水組雙柏散提取物中大黃素含量明顯降低（P＜0.05）。各組大黃素含量高低排序：蜂蜜組＞水調組＞姜汁組＞糖水組＞醋調組。

表2 各組雙柏散提取物中小檗堿和大黃素含量比較（±s，n=5，mg/g）

表2 各組雙柏散提取物中小檗堿和大黃素含量比較（±s，n=5，mg/g）

注：與水調組比較，aP＜0.05；與蜂蜜組比較，bP＜0.05；與醋調組比較，cP＜0.05；與姜汁組比較，dP＜0.05

組別 小檗堿 大黃素水調組 0.309 3±0.007 1 0.045 5±0.000 5蜂蜜組 0.271 5±0.000 5a 0.057 0±0.000 1a醋調組 0.270 2±0.009 0a 0.032 8±0.001 1a姜汁組 0.256 9±0.003 1a b 0.042 1±0.000 5a c糖水組 0.295 1±0.010 2a b 0.040 3±0.000 5a c d

3 討 論

3.1 供試品溶液制備方法的考察本實驗在制備供試品溶液時考察了純凈水、乙醇、甲醇溶液的提取效果，結果顯示，甲醇提取的供試品溶液色譜峰響應值較大。結合文獻[15-16]報道雙柏散方中的大黃素、小檗堿在甲醇中溶解度較好，綜合考慮，選擇甲醇作為本試驗提取溶劑。目前雙柏散制成糊劑的黏稠度、使用液體輔料的比例尚無準確參考數(shù)值，在制備過程中，憑個人感官判斷來決定使用液體輔料的劑量。但不同操作者，對黏稠度的感官可能存在差異，最終影響雙柏散糊劑的有效成分含量。

3.2 測定指標的選擇選擇合理的中藥質量控制指標用于評價及優(yōu)化管理方案十分重要[17]。雙柏散由大黃、黃柏、薄荷、澤蘭、側柏葉組成，具有抗炎作用[18]，可用于治療各種炎癥疾病[19]。大黃素、小檗堿具有抗炎、抑菌的作用[20]，因此，本研究通過采用HPLC法測定不同輔料（蜂蜜、糖水、醋、姜汁、水）對雙柏散甲醇提取液中大黃素、小檗堿的含量，探討不同輔料對雙柏散的抗炎效果的影響。中藥復方含有多種成分，可以多靶點、多途徑、多方面改善臨床癥狀[21]，后續(xù)可繼續(xù)完善這些方面的研究。

3.3 檢測有效成分含量方法的選擇中藥指紋圖譜目前廣泛用于評價中藥及其成方質量，對于提高其質量標準有重要意義[22]。目前用于中藥質量評價的指紋圖譜有氣相色譜、高效液相色譜、薄層色譜法、超臨界液體色譜、高速逆流色譜等，這些方法應用較廣，發(fā)展前景好[23]。肖春霞等[24]使用HPLC法測定三黃片中的大黃素、小檗堿等成分，分離度良好。本研究利用HPLC法建立了同時測定雙柏散中小檗堿和大黃素兩種成分的方法，方法學的驗證結果表明，該方法簡便、準確，重現(xiàn)性好，為雙柏散的進一步開發(fā)提供理論基礎。本次測定小檗堿含量時，蜂蜜組、醋組測得結果沒有顯著性差異，后續(xù)可以通過使用前述其他方法進行檢測對比。

3.4 臨床應用價值使用蜂蜜、糖水、姜汁、醋、水不同賦形劑調制的雙柏散糊劑甲醇提取溶液中主要成分大黃素、小檗堿含量存在差異。水調組和糖水組小檗堿含量相對較高，蜂蜜組和水調組大黃素含量相對較高。結合實際操作和賦形劑方便獲取，綜合判斷，用水作賦形劑調制雙柏散成糊劑，有效成分含量較高，經濟實惠，適合臨床使用。雙柏散是復方成分，大黃素、小檗堿含量高的組，臨床療效不一定最好。外敷貼劑給藥，除了關注復方中的有效成分含量，還須考慮有效成分透過皮膚被吸收的程度，只有有效成分得到很好吸收了，才能更好發(fā)揮治療作用，所以下一步應進一步考察不同輔料對雙柏散抗炎作用的影響。