多西他賽聯(lián)合四君子湯對(duì)RM-1前列腺癌荷瘤小鼠的腫瘤抑制作用及免疫功能的影響*

胡佳貞，何春峰，吳曉慧，張青川

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院，上海 200062）

前列腺癌（prostate carcinoma）在發(fā)達(dá)國(guó)家的發(fā)病率位列第一、而死亡率位列第二[1-2]。在我國(guó)新增確診的前列腺癌患者中中期、晚期患者的比例明顯高于美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家[3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)將多西他賽（Docetaxel，DXT）作為治療前列腺癌的一線化療藥物，在2004年美國(guó)FDA審核準(zhǔn)予其正式成為臨床上治療難治性前列腺癌的藥物[4-5]，是臨床上常用的標(biāo)靶藥物[6]。多西他賽治療效果明確，但其副作用隨著臨床應(yīng)用日益凸顯，急需探索能夠同時(shí)減輕患者的化療副作用、協(xié)同抑瘤，進(jìn)而提高機(jī)體免疫力的綜合治療方法。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為前列腺癌臟腑病變主要在于腎與膀胱，病機(jī)主要為正虛邪實(shí)，以虛為主。由于前列腺癌臨床表現(xiàn)不同且復(fù)雜，不同中醫(yī)醫(yī)家對(duì)其診治分型各有不同[7]。前列腺癌以虛證為主，而四君子湯是益氣補(bǔ)氣的經(jīng)典方。四君子湯源自《太平惠民和劑局方》。全方由4味中藥組成：人參（君藥）性甘，有補(bǔ)氣益氣之功效；白術(shù)（臣藥）性溫，具有健脾、益氣及輔助運(yùn)化之功效；茯苓（佐藥）性平，有滲濕、潤(rùn)燥、益氣之功效；甘草（使藥）性甘，有輔助調(diào)和諸藥、健脾益氣的功效。全方共奏扶正固本、益氣補(bǔ)氣、補(bǔ)脾利濕之功[8]。腫瘤進(jìn)展與體內(nèi)免疫狀態(tài)密切相關(guān)，機(jī)體抗腫瘤占主導(dǎo)作用的是細(xì)胞免疫[9]。有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)以人參為君藥的參芪扶正液具有提高免疫力的功能[10]。本研究在前期實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，擬探討四君子湯聯(lián)合多西他賽對(duì)RM-1前列腺癌荷瘤小鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)情況及對(duì)機(jī)體細(xì)胞免疫功能的影響。

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6周齡SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠共30只，體質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證編號(hào)：20170005012229，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)環(huán)境：恒溫26℃，濕度50%～70%，壓差25 Pa，噪聲≤60 dB，照度150 Lux。本實(shí)驗(yàn)由上海同濟(jì)大學(xué)滬北動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，并開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)完畢后脫頸椎處死小鼠。

1.2 細(xì)胞株小鼠前列腺癌RM-1細(xì)胞株，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海分院。

1.3 藥物與試劑多西他賽（Medchem ExPress公司，批號(hào)：114977-28-5）；中藥材人參粉（上海信德中藥飲片廠，批號(hào)：20160149）、白術(shù)顆粒劑（批號(hào)：9025022）、茯苓顆粒劑（批號(hào)：9050432）、炙甘草顆粒劑（批號(hào)：9045682）均購(gòu)自廣東一方制藥有限公司；胎牛血清（北美BI，批號(hào)：04-001-1AUS）；胰酶（Gibco公司，批號(hào)：25200056）；細(xì)胞培養(yǎng)基（RPMI-1640）（Hyclone公司，批號(hào)：SH30809.01）；Fc block（BD Pharminge公司，批號(hào)：8086608）；Staining Buffer（BD Pharminge公司，批號(hào)：554656）；Collagenase IV（Biofroxx公司，批號(hào)：EZ4567D111）；DNase酶（Biofroxx公司，批號(hào)：EZ3416D319）；紅細(xì)胞裂解液（北京索萊寶科技公司，批號(hào)：R1010）；PE-anti mouse CD3抗體（上海Biolegend，批號(hào)：100206）；FITC-anti mouse CD4抗體（美國(guó)BD Bioscience，批號(hào)：11-0041-81）；APC-anti mouse CD8抗體（美國(guó)BD Bioscience，批號(hào)：561093）；Cy5.5-anti mouse CD11c抗體（美國(guó)BD Bioscience，批號(hào)：117328）；PE-anti mouse CD80抗體（上海Biolegend，批號(hào)：104713）；FITC-anti mouse CD86抗體（美國(guó)eBioscience，批號(hào)：11-0862-81）；Cy5.5-anti mouse CD8抗體（美國(guó)BD Bioscience，批號(hào)：551162）；FITC-anti mouse CD44抗體（美國(guó)eBioscience，批號(hào)：11-0441-82）；APCanti mouse CD62L抗體（美國(guó)BD Bioscience，批號(hào)：553152）；Mouse T-Cell surface Glycoprotein CD4 Elisa試劑盒（CUSBIO公司，批號(hào)：CSB-E13393m)；Mouse Cluster of differentiation 8a Elisa試劑盒（DLDEVELOP公司，批號(hào)：DL-CD8a-Mu）。

1.4 主要儀器DNP9082型恒溫孵育箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；5427R型低溫高速離心機(jī)（EPPendorf公司）；MM-1型微量震蕩器（金壇市醫(yī)療器械廠）；CKX41型倒置顯微鏡（OlymPus公司）；Bit1000型電熱恒溫水浴鍋（精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；BSA124S型電子天平（Sartorius公司）；CytoFLEX LX型流式細(xì)胞儀（BECKMAN COULTER公司）；Synergy LX型多功能熒光酶標(biāo)儀（美國(guó)BIOTEK公司）。

2 方 法

2.1 分組與造模30只C57BL/6雄性小鼠飼養(yǎng)于無特定病原體的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，均存活。按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、荷瘤模型組、多西他賽組、四君子湯組、多西他賽聯(lián)合四君子湯組，每組6只。無菌條件下配置RM-1細(xì)胞懸液（細(xì)胞密度為5×107個(gè)/L），放于冰上低溫暫存。除空白對(duì)照組外，其余各組建立小鼠荷瘤模型，外科精細(xì)剪刀剪去移植部位黑色毛發(fā)，小鼠前列腺癌RM-1細(xì)胞懸液以0.2 mL/只接種于小鼠的右側(cè)腋窩皮下，接種7 d后測(cè)量腫瘤直徑達(dá)到約0.5 cm即為造模成功，最終24只小鼠均造模成功。

2.2 藥物制備四君子湯顆粒劑，方藥組成：人參9 g，白術(shù)顆粒2.7 g（相當(dāng)于飲片9 g），茯苓顆粒0.45 g（相當(dāng)于飲片9 g），炙甘草顆粒1.2 g（相當(dāng)于飲片6 g）。按照人與小鼠體表面積換算成用藥組小鼠所需藥量：四君子湯顆粒劑給藥量2 g/kg（前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果）。1劑四君子湯顆粒劑加66 mL的三蒸水配置成含藥量0.2 g/mL所需藥液，4℃保存。多西他賽加0.9%氯化鈉溶液配制成2.5 mg/kg所需溶度。

2.3 實(shí)驗(yàn)給藥多西他賽組小鼠腹腔注射給予多西他賽溶液，0.2 mL/只；四君子湯組小鼠灌胃給予四君子湯藥液，2 g/kg；多西他賽聯(lián)合四君子湯組小鼠腹腔注射多西他賽溶液（0.2 mL/只）的同時(shí)灌胃給予四君子湯藥液（2 g/kg）；空白對(duì)照組和荷瘤模型組小鼠給予等量的生理鹽水灌胃、等量的生理鹽水腹腔注射，1次/d。各組小鼠連續(xù)干預(yù)10 d。

2.4 觀察指標(biāo)

2.4.1 抑瘤率 每2天測(cè)量小鼠腫瘤體積變化并記錄數(shù)據(jù)，用游標(biāo)卡尺測(cè)量瘤體最大橫徑線a、垂直短徑b，體積=b×b×a/2。末次給藥后禁食不禁水24 h后頸椎脫臼法處死，剝除瘤體，測(cè)量瘤體體積、瘤質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率（TIR）=（荷瘤模型組瘤體積-給藥組瘤體積）/荷瘤模型組瘤體積×100%。

2.4.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠淋巴結(jié)樹突狀細(xì)胞（CD11c、CD80、CD86）、腫瘤瘤體T淋巴細(xì)胞（CD3、CD4、CD8）、脾臟記憶T淋巴細(xì)胞（CD3、CD8、CD44、CD62L）分別摘取右側(cè)腋窩淋巴結(jié)，完整剝除瘤體、脾臟。取淋巴結(jié)消化制成密度為1×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，F(xiàn)c block（1 μL/100 μL）冰上孵育5 min，加入表面分子抗體Cy5.5-anti mouse CD11c抗體、PE-anti mouse CD80抗體、FITC-anti mouse CD86進(jìn)行染色。取瘤體消化制成密度為1×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，加入表面分子抗體PE-anti mouse CD3抗體、FITC-anti mouse CD4抗體、APC-anti mouse CD8抗體進(jìn)行染色。取脾臟消化制成密度為1×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，加入表面分子抗體PE-anti mouse CD3抗體、Cy5.5-anti mouse CD8抗 體、FITC-anti mouse CD44抗 體、APC-anti mouse CD62L抗體。均在室溫避光孵育15 min，2 000 r/min低溫離心10 min，棄去上清，取200 μL Stain buffer重懸細(xì)胞，上細(xì)胞流式儀檢測(cè)細(xì)胞比例。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2.4.3 ELISA法檢測(cè)小鼠血清CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞 末次給藥后禁食不禁水24 h后，頸椎脫臼處死前，雙側(cè)眼眶取血，EDTA抗凝，室溫靜置1 h后，2 000 r/min離心10 min，取上清液。采用ELISA雙抗體夾心法免疫試劑盒檢測(cè)，計(jì)算CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞表達(dá)。血清樣品1∶5稀釋，100 μL混勻后分別加入各待測(cè)孔中，加蓋，置于37℃孵育2 h。甩干棄液后每孔加入Biotin-antibody（1×）100 μL、封板37℃下孵育1 h后洗板3次。每孔加入HRP-avidin（1×）100 μL后，封板37℃下孵育1 h后洗板5次。每孔加入90 μL TMB顯色劑，封板37℃下孵育15 min避光。每孔加入50 μL的ELISA終止液終止反應(yīng)，在5 min內(nèi)用熒光酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)條件下檢測(cè)吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示。重復(fù)測(cè)量計(jì)量資料比較采用重復(fù)測(cè)量方差進(jìn)行分析。計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較使用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖表應(yīng)用Graph pad prism 5作圖圖像分析處理軟件。

3 結(jié) 果

3.1 各組小鼠瘤體體積比較所有小鼠瘤體體積隨時(shí)間延長(zhǎng)均明顯增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），即存在時(shí)間效應(yīng)，4組均如此。4組小鼠瘤體體積總體比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），即存在分組效應(yīng)；第3、5、7、10天，多西他賽組、四君子湯組及多西他賽聯(lián)合四君子湯組小鼠瘤體體積均低于荷瘤模型組（P＜0.01）；多西他賽聯(lián)合四君子湯組小鼠瘤體體積均低于多西他賽組、四君子湯組（P＜0.01）；四君子湯組小鼠瘤體體積明顯高于多西他賽組（P＜0.01）。時(shí)間因素與分組因素間存在交互效應(yīng)（P＜0.05）。（見表1、圖1）

表1 各組小鼠瘤體體積比較（±s，mm3）

表1 各組小鼠瘤體體積比較（±s，mm3）

注：F交互效應(yīng)=11.617，P交互效應(yīng)=0.000；F時(shí)間主效應(yīng)=20.876，P時(shí)間主效應(yīng)=0.000；F組別主效應(yīng)=29.312，P組別主效應(yīng)=0.000；與荷瘤模型組比較，aP＜0.01；與多西他賽組比較，bP＜0.01；與四君子湯組比較，cP＜0.01，與第1天比較，dP＜0.01；與第3天比較，eP＜0.01；與第5天比較，fP＜0.01；與第7天比較，gP＜0.01

組別 動(dòng)物數(shù)（只） 第1天 第3天 第5天 第7天 第10天 F P荷瘤模型組 6 15.77±4.46 51.70±2.20d 76.49±6.56d e 175.91±4.19d e f 488.45±3.47d e f g 351.580 0.000多西他賽組 6 13.18±4.20 28.10±1.14a d 42.40±5.74a d e 103.47±4.13a d e f 157.82±2.40a d e f g 241.671 0.000四君子湯組 6 11.62±2.53 38.18±3.48a b d 57.85±2.35a b d e 113.20±1.68a b d e f 165.85±2.48a b d e f g 215.613 0.000多西他賽聯(lián)合四君子湯組6 14.01±3.56 16.14±6.03a b c 28.72±2.75a b c d e 49.22±4.30a b c d e f 65.19±4.87a b c d e f g 47.819 0.000 F 1.239 36.478 66.030 327.635 565.767 P 0.670 0.000 0.000 0.000 0.000

圖1 各組小鼠瘤體體積交互效應(yīng)輪廓圖

3.2 各組小鼠第10天瘤體質(zhì)量及抑瘤率比較多西他賽組、四君子湯組及多西他賽聯(lián)合四君子湯組小鼠第10天瘤體質(zhì)量均低于荷瘤模型組（P＜0.01）；多西他賽聯(lián)合四君子湯組小鼠第10天瘤體質(zhì)量均低于多西他賽組、四君子湯組（P＜0.01）；四君子湯組小鼠第10天瘤體質(zhì)量與多西他賽組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。多西他賽組、四君子湯、多西他賽聯(lián)合四君子湯的抑瘤率分別為67.68%、67.06%、86.65%。（見表2）

表2 各組小鼠第10天瘤體質(zhì)量比較（±s，g）

表2 各組小鼠第10天瘤體質(zhì)量比較（±s，g）

注：與荷瘤模型組比較，aP＜0.01；與多西他賽組比較，bP＜0.01；與四君子湯組比較，cP＜0.01

組別 動(dòng)物數(shù)（只）瘤體質(zhì)量（images/BZ_6_979_1892_998_1929.png±s，g） 抑瘤率（%）荷瘤模型組 6 5.90±0.46 -多西他賽組 6 2.53±0.21a 67.68±1.52四君子湯組 6 2.84±0.11a 67.06±2.35多西他賽聯(lián)合四君子湯組6 1.85±1.11abc 86.65±5.31bc F 276.300 61.950 P 0.000 0.000

3.3 各組小鼠淋巴結(jié)樹突狀細(xì)胞DCs比較荷瘤模型組、多西他賽組、四君子湯組及多西他賽聯(lián)合四君子湯組小鼠淋巴結(jié)CD11c+CD80+細(xì)胞比例、CD11c+CD86+細(xì)胞比例、CD11c+CD80+CD86+細(xì)胞比例均明顯高于空白對(duì)照組（P＜0.01）；多西他賽聯(lián)合四君子湯組小鼠淋巴結(jié)CD11c+CD80+細(xì)胞比例、CD11c+CD86+細(xì)胞比例、CD11c+CD80+CD86+細(xì)胞比例均明顯高于荷瘤模型組（P＜0.01）；四君子湯組小鼠淋巴結(jié)CD11c+CD86+細(xì)胞比例、CD11c+CD80+CD86+細(xì)胞比例均明顯高于荷瘤模型組（P＜0.01）；多西他賽聯(lián)合四君子湯組CD11c+CD80+細(xì)胞比例、CD11c+CD86+細(xì)胞比例、CD11c+CD80+CD86+細(xì)胞比例均明顯高于多西他賽組、四君子湯組（P＜0.01）。（見表3、圖2）

圖2 各組小鼠淋巴結(jié)樹突狀細(xì)胞CD11c+CD80+、CD11c+CD86+、CD11c+CD80+CD86+比較

表3 各組小鼠淋巴結(jié)CD11c+CD80+、CD11c+CD86+、D11c+CD80+CD86+細(xì)胞比例比較（±s，%）

表3 各組小鼠淋巴結(jié)CD11c+CD80+、CD11c+CD86+、D11c+CD80+CD86+細(xì)胞比例比較（±s，%）

注：與空白對(duì)照組比較，aP＜0.01；與荷瘤模型組比較，bP＜0.01；與多西他賽組比較，cP＜0.01；與四君子湯組比較，dP＜0.01

組別 動(dòng)物數(shù)（只）CD11c+CD80+CD11c+CD86+CD11c+CD80+CD86+空白對(duì)照組 6 17.38±2.13 22.52±1.44 10.09±1.73荷瘤模型組 6 46.56±4.95a 31.71±6.06a 17.12±2.78a多西他賽組 6 45.68±8.15a 34.61±7.20a 19.07±2.70ab四君子湯組 6 46.15±3.20a 39.91±1.59ab 27.57±3.16abc多西他賽聯(lián)合四君子湯組6 79.36±1.15abcd 46.72±1.25abcd 40.58±2.42abcd F 135.100 15.810 80.210 P 0.000 0.000 0.000

3.4 各組小鼠瘤體T淋巴細(xì)胞比較多西他賽組、四君子湯組、多西他賽聯(lián)合四君子湯組小鼠瘤體CD3+CD8+T細(xì)胞比例均明顯高于荷瘤模型組（P＜0.05），CD3+CD4+T細(xì)胞比例均明顯低于荷瘤模型組（P＜0.05）；多西他賽聯(lián)合四君子湯組小鼠瘤體CD3+CD8+T細(xì)胞比例均明顯高于多西他賽組、四君子湯組（P＜0.05），CD3+CD4+T細(xì)胞比例均明顯低于多西他賽組、四君子湯組（P＜0.05）；四君子湯組小鼠瘤體CD3+CD8+T細(xì)胞比例、CD3+CD4+T細(xì)胞比例與多西他賽組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見表4、圖3）

圖3 各組小鼠瘤體CD3+CD8+、CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞比較

表4 各組小鼠瘤體CD3+CD8+T細(xì)胞比例、CD3+CD4+T細(xì)胞比例比較 （±s，%）

表4 各組小鼠瘤體CD3+CD8+T細(xì)胞比例、CD3+CD4+T細(xì)胞比例比較 （±s，%）

注：與荷瘤模型組比較，aP＜0.05；與多西他賽組比較，bP＜0.05；與四君子湯組比較，cP＜0.05

組別 動(dòng)物數(shù)（只）CD3+CD8+ CD3+CD4+荷瘤模型組 6 31.94±6.03 10.45±2.35多西他賽組 6 41.33±4.36a 8.27±2.35a四君子湯組 6 40.95±5.37a 8.67±1.29a多西他賽聯(lián)合四君子湯組6 52.84±9.57abc 5.71±2.58abc F 5.044 3.249 P 0.009 0.043

3.5 各組小鼠脾臟CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞比較荷瘤模型組小鼠脾臟CD3+CD8+CD44+CD62L-T細(xì)胞比例明顯高于空白對(duì)照組（P＜0.01），CD3+CD8+CD44-CD62L+T細(xì)胞比例明顯低于空白對(duì)照組（P＜0.01）；多西他賽組、多西他賽聯(lián)合四君子湯組小鼠脾臟CD3+CD8+CD44+CD62L-T細(xì)胞比例均明顯低于荷瘤模型組（P＜0.01），多西他賽組、四君子湯組、多西他賽聯(lián)合四君子湯組小鼠脾臟CD3+CD8+CD44-CD62L+T細(xì)胞比例均明顯高于荷瘤模型組（P＜0.01）；多西他賽聯(lián)合四君子湯組小鼠脾臟CD3+CD8+CD44+CD62L-T細(xì)胞比例均明顯低于多西他賽組、四君子湯組（P＜0.05或P＜0.01），CD3+CD8+CD44-CD62L+T細(xì)胞比例均明顯高于多西他賽組、四君子湯組（P＜0.05或P＜0.01）。（見表5、圖4～5）

圖4 各組小鼠脾臟CD3+CD8+CD44、CD62L流式細(xì)胞儀門控選擇

表5 各組小鼠脾臟CD3+CD8+CD44+CD62L-、CD3+CD8+CD44-CD62L+T細(xì)胞比例比較（±s，%）

表5 各組小鼠脾臟CD3+CD8+CD44+CD62L-、CD3+CD8+CD44-CD62L+T細(xì)胞比例比較（±s，%）

注：與空白對(duì)照組比較，aP＜0.01；與荷瘤模型組比較，bP＜0.01；與多西他賽組比較，cP＜0.05；與四君子湯組比較，dP＜0.01

組別 動(dòng)物數(shù)（只）CD3+CD8+CD44+CD62L-CD3+CD8+CD44-CD62L+空白對(duì)照組 6 17.39±2.97 52.14±2.44荷瘤模型組 6 38.29±4.38a 24.28±1.89a多西他賽組 6 29.01±3.43ab 33.49±5.01ab四君子湯組 6 31.41±6.95a 38.22±3.11ab多西他賽聯(lián)合四君子湯組6 26.02±2.51abcd 44.29±2.85abcd F 6.342 16.74 P 0.000 0.000

圖5 各組小鼠脾臟CD3+CD8+CD44+CD62L-、CD3+CD8+CD44-CD62L+T細(xì)胞比較

3.6 各組小鼠血清T淋巴細(xì)胞比較荷瘤模型組、多西他賽組、四君子湯組、多西他賽聯(lián)合四君子湯組小鼠血清CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞比例均明顯高于空白對(duì)照組（P＜0.05）；四君子湯組、多西他賽聯(lián)合四君子湯組小鼠血清CD4+T細(xì)胞比例均明顯高于荷瘤模型組（P＜0.05），多西他賽聯(lián)合四君子湯組小鼠血清CD8+T細(xì)胞比例明顯低于荷瘤模型組（P＜0.05）；多西他賽組小鼠血清CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞比例均明顯低于荷瘤模型組（P＜0.05）；多西他賽聯(lián)合四君子湯組小鼠血清CD4+T細(xì)胞比例明顯高于多西他賽組、四君子湯組（P＜0.05），CD8+T細(xì)胞比例明顯低于多西他賽組、四君子湯組（P＜0.05）。（見表6）

表6 各組小鼠血清CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞比較（±s，pg/mL）

表6 各組小鼠血清CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞比較（±s，pg/mL）

注：與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05；與荷瘤模型組比較；bP＜0.05；與多西他賽組比較，cP＜0.05；與四君子湯組比較，dP＜0.05

組別 動(dòng)物數(shù)（只） CD4+ CD8+空白對(duì)照組 6 737.10±10.31 10 537.10±14.11荷瘤模型組 6 4 053.29±13.30a 13 204.56±37.44a多西他賽組 6 3 834.25±53.24abd 11 996.09±11.18abd四君子湯組 6 5 913.87±25.73abc 13 337.87±18.07ac多西他賽聯(lián)合四君子湯組6 8 813.38±18.85abcd 10 684.52±60.02abcd F 63 956 9 444 P 0.000 0.004

4 討 論

中醫(yī)藥可以輔助惡性腫瘤的治療，體現(xiàn)在調(diào)動(dòng)免疫系統(tǒng)，緩解化療藥物的副作用等方面。故化療藥物聯(lián)合中藥，可以幫助患者度過免疫系統(tǒng)被抑制的化療期，提高患者的耐受性[11-12]。中醫(yī)常用“扶正-活血-解毒”治療方法，即是中醫(yī)藥治療腫瘤的精髓[13]。本研究表明多西他賽聯(lián)合四君子湯具有協(xié)同抑瘤作用，這與蔣志明等[14]的研究結(jié)果相符。蔣志明等[14]應(yīng)用加味四君子湯聯(lián)合奧沙利鉑及5-氟尿嘧啶治療晚期結(jié)直腸癌患者，與單純化療組患者相比，聯(lián)合組患者的KPS體力評(píng)分量表分?jǐn)?shù)明顯升高，瘤體縮小更明顯。

淋巴結(jié)樹突狀細(xì)胞DCs具有強(qiáng)大的抗原提呈功能，如何調(diào)動(dòng)激活機(jī)體DCs，是最近研究免疫抗腫瘤的重點(diǎn)和熱點(diǎn)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)小鼠淋巴結(jié)內(nèi)樹突狀細(xì)胞在CD11c+總數(shù)量沒有明顯變化的前提下，多西他賽聯(lián)合四君子湯組小鼠淋巴結(jié)內(nèi)CD11c+CD80+、CD11c+CD86+、CD11c+CD80+CD86+細(xì)胞表達(dá)明顯高于多西他賽組。說明四君子湯與多西他賽聯(lián)合應(yīng)用，更能有效刺激淋巴結(jié)CD11c+CD80+、CD11c+CD86+、CD11c+CD80+CD86+細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)了其抗原遞呈功能，表明DCs更多的轉(zhuǎn)化為成熟DC，抗原遞呈功能被明顯激活。這與田晉生等[16]的研究相一致，該研究表明當(dāng)處于IL-4的炎癥因子刺激下，小鼠骨髓DCs中CD11c+CD80+、CD11c+CD86+明顯升高。徐雪蓮等[17]綜述發(fā)現(xiàn)近年來DCs疫苗已經(jīng)應(yīng)用到消化道惡性腫瘤的臨床治療中，DCs疫苗聯(lián)合化療，可明顯改善結(jié)直腸癌患者的預(yù)后。

T淋巴細(xì)胞的數(shù)量變化、T淋巴細(xì)胞的功能變化，常與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展高度相關(guān)。其中T淋巴細(xì)胞亞群又是體內(nèi)細(xì)胞免疫最重要的組成部分，腫瘤內(nèi)CD8+T細(xì)胞的比例越高，其機(jī)體抗腫瘤的免疫功能越強(qiáng)。本研究通過對(duì)小鼠瘤體T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)發(fā)現(xiàn)多西他賽聯(lián)合四君子湯組小鼠瘤體CD8+T細(xì)胞表達(dá)明顯升高，CD4+T細(xì)胞表達(dá)明顯降低，優(yōu)于多西他賽組。說明多西他賽聯(lián)合四君子湯具有協(xié)同作用，緩解了小鼠機(jī)體的免疫抑制，提高了小鼠的免疫功能，具有調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群的作用。這與王婷等[18]的研究結(jié)果相一致。王婷等[18]通過分組觀察益氣復(fù)生方聯(lián)合化療對(duì)胃癌荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤淋巴細(xì)胞CD4+、CD8+的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合組明顯優(yōu)于單用化療組。胡喜珍等[19]研究發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞在漿液性卵巢癌中，CD8+T浸潤(rùn)程度與腫瘤的預(yù)后成正相關(guān)。初始T細(xì)胞（Native T cell，Tn）表達(dá)CD3+CD8+CD44-CD62L+，抗凋亡能力最強(qiáng)，但殺傷能力最弱，Tn接受抗原刺激后形成效應(yīng)記憶性T細(xì)胞（Effective Memory T cell，Tem）。Tem位于分化終止期，殺傷能力最強(qiáng)，Tem表面表達(dá)CD3+CD8+CD44+CD62L-。本研究結(jié)果表明，多西他賽聯(lián)合四君子湯組下調(diào)脾臟CD3+CD8+CD44+CD62LT細(xì)胞作用最顯著；與多西他賽組比較，多西他賽聯(lián)合四君子湯組小鼠脾臟CD3+CD8+CD44-CD62L+T細(xì)胞下調(diào)至更接近正常水平。多西他賽聯(lián)合四君子湯使化療荷瘤小鼠記憶性T細(xì)胞保持在更為原始的狀態(tài)，從而降低了效應(yīng)性殺傷性CD8+T細(xì)胞的增殖分化。

正常情況下，機(jī)體血清CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞表達(dá)的動(dòng)態(tài)平衡維持正常的免疫功能，一旦比例失調(diào)，提示機(jī)體的免疫功能減弱[20]。本研究檢測(cè)了小鼠的血清T淋巴細(xì)胞亞群，多西他賽聯(lián)合四君子湯能明顯提高機(jī)體輔助性CD4+T細(xì)胞、回調(diào)CD8+T細(xì)胞表達(dá)水平，聯(lián)合應(yīng)用能夠有效提高化療小鼠機(jī)體的免疫功能。有相關(guān)研究也提出化療聯(lián)合中藥化療效果更好，如陸蓉等[21]研究顯示參芪扶正注射液聯(lián)合多西他賽能上調(diào)乳腺癌患者CD3+CD4+T細(xì)胞比例，下調(diào)CD3+CD8+T細(xì)胞比例，聯(lián)合應(yīng)用抑制腫瘤更有效，同時(shí)有改善化療后機(jī)體的免疫抑制狀態(tài)。計(jì)小清等[22]研究發(fā)現(xiàn)四君子湯合當(dāng)歸補(bǔ)血湯能提高化療小鼠機(jī)體自身免疫功能。

綜上所述，多西他賽與四君子湯聯(lián)合應(yīng)用，能提高RM-1前列腺癌荷瘤小鼠的免疫功能，同時(shí)緩解了單用多西他賽的化療副作用。其機(jī)制與調(diào)動(dòng)化療荷瘤小鼠免疫抑制狀態(tài)、激活機(jī)體免疫功能有關(guān)。