黃芪甲苷調(diào)節(jié)PI3K/AKT/eNOS信號(hào)通路對(duì)糖尿病大鼠皮膚缺損的影響*

劉東波，李 衛(wèi)，何藻鵬，鄭 韜，陳遠(yuǎn)芬，霍啟燦，何欣橋

（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬順德醫(yī)院/佛山市順德區(qū)樂從醫(yī)院，廣東 佛山 528315）

糖尿病作為常見的代謝類疾病，近年來在我國發(fā)病率逐漸上升，引起人們廣泛關(guān)注。糖尿病可引發(fā)機(jī)體多種器官功能障礙，導(dǎo)致糖尿病患者出現(xiàn)多種并發(fā)癥[1-2]。糖尿病引起的傷口愈合緩慢作為典型的伴隨癥狀，危害患者的皮膚組織，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引發(fā)慢性皮膚潰瘍。據(jù)研究統(tǒng)計(jì)，糖尿病患者同時(shí)患有慢性皮膚潰瘍的概率較高，且難以根治。目前，針對(duì)相關(guān)疾病治療的藥物逐漸增多，但大多成本較高，用于預(yù)防和緩解糖尿病皮膚缺損的藥物還有待進(jìn)一步開發(fā)[3-4]。糖尿病的調(diào)控受多條通路影響，3-磷酸肌醇激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）/內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）通路在緩解糖尿病腦血管損傷過程中發(fā)揮重要作用，且被證實(shí)可通過調(diào)控血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）的表達(dá)參與促進(jìn)血管新生。而血管新生是皮膚缺損愈合過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對(duì)創(chuàng)面形成過程中炎癥反應(yīng)消除、組織細(xì)胞增殖具有重要影響[5-7]。

黃芪甲苷是黃芪的主要活性成分之一，具有增強(qiáng)免疫力、降血糖、促進(jìn)血管新生等多種功效，已被證實(shí)參與修復(fù)受損血管并參與血管再生，加速傷口愈合[8-9]。研究[10]還發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷可參與調(diào)節(jié)PI3K/AKT/eNOS通路，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，改善血管舒張。但黃芪甲苷是否通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT/eNOS通路介導(dǎo)修復(fù)糖尿病引起的皮膚損傷，有待實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。本研究通過構(gòu)建糖尿病大鼠皮膚損傷模型，探究黃芪甲苷對(duì)糖尿病大鼠皮膚缺損創(chuàng)面愈合的影響。

1 材料與方法

1.2 藥物與試劑黃芪甲苷（批號(hào)：RS00161020）購自上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；鏈脲佐菌素（批號(hào)：S110910）、PI3K抑制劑LY294002（批號(hào)：HY-10108）均購自aladdin公司；護(hù)理軟膏（備案號(hào)：浙杭械備20190111號(hào)）購自杭州金花醫(yī)藥生物科技有限公司；蘇木精-伊紅（Hematoxylin-Eosin，HE）染色試劑盒（批號(hào)：60524ES60）購自翌圣生物科技有限公司；Masson染色試劑盒（批號(hào)：BP-DL021）購自南京森貝伽生物科技有限公司；Microfil血管造影劑（批號(hào)：MV-122）購自蘇州螞蟻淘生物科技有限公司；GAPDH抗體（批號(hào)：ab9485）、PI3K抗體（批號(hào)：ab133595）、p-PI3K抗體（批號(hào)：ab207484）、AKT抗體（批號(hào)：ab38449）、p-AKT抗體（批號(hào)：ab133458）、eNOS抗體（批號(hào)：ab199956）、p-eNOS抗體（批號(hào)：ab230158）、VEGF抗體（批號(hào)：ab150375）、VEGFR2抗體（批號(hào)：ab233693）均購自abcam公司；羊抗兔二抗（批號(hào)：A9169）購自德國默克公司。

1.3 主要儀器KL-B2型包埋機(jī)（湖北康龍電子科技有限責(zé)任公司）；TD5B型離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）；7500定量PCR儀（ABI公司）；580/590微量血糖儀（江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司）；SCANCO 100型microCT掃描儀（杭州越波生物科技有限公司）；CA-268型凝膠成像系統(tǒng)（上海精密儀器儀表有限公司）。

1.4 造模與分組36只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為糖尿病組、皮膚損傷組、黃芪甲苷高劑量組、黃芪甲苷低劑量組、護(hù)理軟膏組、黃芪甲苷+PI3K抑制劑組，各組大鼠均持續(xù)喂食高糖高脂類食物，持續(xù)喂養(yǎng)2周后，麻醉大鼠，腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素50 mg/kg。依據(jù)參考文獻(xiàn)方法[11]判定糖尿病大鼠造模結(jié)果：注射后3～5 d之間，每天隨機(jī)選取2個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)鼠尾靜脈采血。微量血糖儀檢測(cè)血糖值，若檢測(cè)血糖值均＞16.7 mmol/L即為造模成功。結(jié)果實(shí)驗(yàn)用大鼠均造模成功。

1.5 實(shí)驗(yàn)給藥麻醉各組大鼠，背部采用脫毛膏脫毛后清水洗凈并消毒，皮膚損傷組、黃芪甲苷高劑量組、黃芪甲苷低劑量組、護(hù)理軟膏組、黃芪甲苷+PI3K抑制劑組大鼠沿背部中線切除1.5 cm×1.5 cm圓形皮膚組織，傷口消毒后立刻用無菌紗布包扎，每日表面消毒并更換紗布一次，記錄大鼠創(chuàng)面愈合情況，黃芪甲苷高劑量組、黃芪甲苷+PI3K抑制劑組大鼠表面消毒后，在更換紗布前于大鼠傷口處均勻涂抹黃芪甲苷溶液（100 mg/mL，使用生理鹽水稀釋）1 mL，黃芪甲苷+PI3K抑制劑組大鼠腹腔內(nèi)注射PI3K抑制劑，10 mg/kg；黃芪甲苷低劑量組于大鼠傷口均勻涂抹黃芪甲苷溶液（20 mg/mL，使用生理鹽水稀釋）1 mL；護(hù)理軟膏組于大鼠傷口均勻涂抹護(hù)理軟膏2 g；糖尿病組、皮膚損傷組不做處理。1次/d，持續(xù)用藥21 d。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 大鼠創(chuàng)面愈合率檢測(cè) 依據(jù)參考文獻(xiàn)方法[12]裁剪1.5 cm×1.5 cm圓形半透明紙張模仿受損傷皮膚，稱質(zhì)量記作半透明紙總質(zhì)量。分別于大鼠術(shù)后7、14、21 d的用藥間隙，在半透明紙上描繪各組大鼠背部傷口處創(chuàng)面形成圖形，剪下稱取描繪圖形質(zhì)量記作背部創(chuàng)面圖形質(zhì)量，依據(jù)公式計(jì)算創(chuàng)面愈合率。公式如下：

創(chuàng)面愈合率（%）=（半透明紙總質(zhì)量-背部創(chuàng)面圖形質(zhì)量）/半透明紙總質(zhì)量×100%。

1.6.2 大鼠創(chuàng)面組織新生血管檢測(cè) 持續(xù)用藥21 d后，各組大鼠按0.1 mL/10 g劑量注射4%水合氯醛麻醉處理，固定于操作臺(tái)上，沿胸腔剪開暴露心臟，左心室處插入靜脈留置針，切開右心耳，生理鹽水灌注直至流出液體清澈。按照Microfil血管造影劑說明書方法配置工作液后灌注。結(jié)扎上腔動(dòng)靜脈后4℃過夜，microCT掃描儀掃描顯影，構(gòu)建三維圖像，比較各組血管化面積比。

研究小組確定了利用課余時(shí)間開展英語演講興趣小組活動(dòng)的形式，制定了學(xué)期內(nèi)每?jī)芍芤淮?，每?學(xué)時(shí)的活動(dòng)計(jì)劃。參加活動(dòng)的學(xué)生被分為5個(gè)小組，分別由5名教師指導(dǎo)?；顒?dòng)初期，教師通過給學(xué)生播放大學(xué)生英語演講比賽光盤的方式，向?qū)W生介紹英語演講的程序和禮儀?；顒?dòng)中期，學(xué)生在教師的指導(dǎo)下完成命題演講、即興演講和問答三個(gè)板塊的訓(xùn)練，并在訓(xùn)練過程中總結(jié)英語演講的方法和技巧?；顒?dòng)后期，針對(duì)演講比賽的全過程進(jìn)行系統(tǒng)化練習(xí)，邀請(qǐng)?jiān)谟⒄Z演講比賽中成績(jī)優(yōu)秀的同學(xué)與小組成員進(jìn)行交流并傳授經(jīng)驗(yàn)，鼓勵(lì)小組成員積極參加各級(jí)各類英語演講比賽。截止2014年1月，研究小組完成了英語演講第二課堂活動(dòng)的指導(dǎo)工作。

1.6.3 大鼠創(chuàng)面組織病理學(xué)變化觀察 持續(xù)用藥21 d后，采用頸椎脫臼法處死各組大鼠，將各組大鼠創(chuàng)面組織完整切下，糖尿病組大鼠切下背部相同部位用于對(duì)照，內(nèi)面朝上拍攝血管新生圖像，用以判斷黃芪甲苷對(duì)糖尿病大鼠受損皮膚血管生成的影響。將創(chuàng)面組織剪成兩部分，部分液氮處理后研磨至粉，凍存?zhèn)溆?。部分放?%多聚甲醛中固定，常規(guī)脫水包埋后制作石蠟切片，分別進(jìn)行HE染色及Masson染色。

HE染色：脫蠟至水，酒精梯度脫水，二甲苯透明，蘇木精染色3 min，清水洗凈后鹽酸酒精分化。2%伊紅染色5 min，清水洗凈。酒精梯度脫水，二甲苯透明，樹膠封片后上鏡觀察。

Masson染色：脫蠟至水，按照Masson染色試劑盒說明書方法染色后上鏡觀察。

1.6.4 大鼠創(chuàng)面組織PI3K mRNA、AKT mRNA、eNOS mRNA、VEGF mRNA、VEGFR2 mRNA表達(dá)水平 取出凍存?zhèn)溆玫膭?chuàng)面組織粉末少許，Trizol法提取RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書方法反轉(zhuǎn)至cDNA，上機(jī)檢測(cè)PI3K mRNA、AKT mRNA、eNOS mRNA、VEGF mRNA、VEGFR2 mRNA的表達(dá)水平。mRNA引物序列由文獻(xiàn)中獲取，廣州吉賽生物公司參與合成。引物序列見表1。

表1 引物序列信息

1.6.5 大鼠創(chuàng)面組織PI3K、AKT、eNOS、p-PI3K、p-AKT、p-eNOS、VEGF、VEGFR2蛋白表達(dá)水平 取出凍存?zhèn)溆玫膭?chuàng)面組織粉末少許，加入0.5 mL細(xì)胞裂解液，充分裂解細(xì)胞，提取蛋白后與上樣緩沖液混合均勻，加熱8 min，倒入凝膠孔道，電泳跑膠后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗（GAPDH抗體、PI3K抗體、AKT抗體、eNOS抗體、p-PI3K抗體、p-AKT抗體、p-eNOS抗體、VEGF抗體、VEGFR2抗體，1∶1 500），4℃孵育過夜。TBST清洗3次，3 min/次。加入二抗（1∶1 000），常溫孵育45 min，TBST清洗3次，3 min/次。倒入發(fā)光液充分浸泡1 min，取出吸去多余水分，置于Syngene光密度掃描系統(tǒng)上，檢測(cè)條帶灰度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，創(chuàng)面愈合率的比較采用雙因素重復(fù)測(cè)量方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠皮膚缺損后不同時(shí)間創(chuàng)面愈合率比較術(shù)后不同時(shí)間（7、14、21 d）之間所有大鼠創(chuàng)面愈合率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），即存在時(shí)間效應(yīng)，5組均如此。皮膚損傷組、護(hù)理軟膏組、黃芪甲苷高劑量組、黃芪甲苷低劑量組、黃芪甲苷+PI3K抑制劑組大鼠創(chuàng)面愈合率逐漸升高，且術(shù)后21 d愈合率最高（P＜0.05）。5組大鼠創(chuàng)面愈合率總體比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），即存在分組效應(yīng)。與皮膚損傷組比較，護(hù)理軟膏組、黃芪甲苷高劑量組、黃芪甲苷低劑量組、黃芪甲苷+PI3K抑制劑組大鼠術(shù)后7、14、21 d創(chuàng)面愈合率均明顯升高（P＜0.05）；與黃芪甲苷高劑量組比較，黃芪甲苷低劑量組、黃芪甲苷+PI3K抑制劑組大鼠術(shù)后7、14、21 d創(chuàng)面愈合率均明顯降低（P＜0.05）；黃芪甲苷高劑量組大鼠術(shù)后7、14、21 d創(chuàng)面愈合率與護(hù)理軟膏組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。時(shí)間因素和分組因素存在交互效應(yīng)。（見表2、圖1）

表2 各組大鼠皮膚缺損后不同時(shí)間創(chuàng)面愈合率比較（±s，%）

表2 各組大鼠皮膚缺損后不同時(shí)間創(chuàng)面愈合率比較（±s，%）

注：F時(shí)間主效應(yīng)=1190.250，P時(shí)間主效應(yīng)=0.000；F分組主效應(yīng)=115.426，P分組主效應(yīng)=0.000；F交互效應(yīng)=7.046，P交互效應(yīng)=0.000；與皮膚損傷組比較，aP＜0.05；與黃芪甲苷高劑量組比較，bP＜0.05；與7 d比較，cP＜0.05；與14 d比較，dP＜0.05

給藥劑量護(hù)理軟膏（g）黃芪甲苷（mg/mL）PI3K抑制劑（mg/kg）皮膚損傷組 6 - - - 7.78±2.36 20.25±3.25 48.23±3.95 243.386 0.000護(hù)理軟膏組 6 2 - - 21.25±3.72a 46.21±4.84a c 77.62±4.51a c d 249.314 0.000黃芪甲苷高劑量組 6 - 100 - 20.52±3.83a 48.67±4.51a c 79.81±4.26a c d 297.842 0.000黃芪甲苷低劑量組 6 - 20 - 13.36±2.26a b 30.34±3.74a bc 57.72±3.72a bc d 273.805 0.000黃芪甲苷+PI3K抑制劑組 6 - 100 10 14.31±2.32a b 32.83±4.26a bc 60.51±4.15a bc d 238.779 0.000 F 20.841 48.085 64.539 P 0.000 0.000 0.000組別 動(dòng)物數(shù)（只） 7 d 14 d 21 d F P

圖1 各組大鼠皮膚缺損后不同時(shí)間創(chuàng)面愈合率交互效應(yīng)輪廓圖

2.2 各組大鼠創(chuàng)面組織新生血管情況糖尿病組大鼠創(chuàng)面組織內(nèi)清晰可見多條血管，血管與血管間脈絡(luò)清晰；皮膚損傷組大鼠創(chuàng)面組織無明顯血管，依稀可見少量脈絡(luò)，創(chuàng)面組織血管化面積比明顯低于糖尿病組（P＜0.05）；護(hù)理軟膏組、黃芪甲苷高劑量組、黃芪甲苷低劑量組、黃芪甲苷+PI3K抑制劑組大鼠創(chuàng)面組織出現(xiàn)多條血管，脈絡(luò)較為清晰，且護(hù)理軟膏組、黃芪甲苷高劑量組最為明顯，其創(chuàng)面組織血管化面積比均明顯高于皮膚損傷組（P＜0.05）；與黃芪甲苷高劑量組比較，黃芪甲苷低劑量組、黃芪甲苷+PI3K抑制劑組大鼠創(chuàng)面組織血管數(shù)量減少，無明顯分布，創(chuàng)面血管化面積比均明顯降低（P＜0.05）；黃芪甲苷高劑量組大鼠皮膚組織血管數(shù)量及創(chuàng)面血管化面積比與護(hù)理軟膏組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見圖2、表3）

表3 各組大鼠皮膚缺損后創(chuàng)面血管化面積比比較（±s）

表3 各組大鼠皮膚缺損后創(chuàng)面血管化面積比比較（±s）

注：與糖尿病組比較，aP＜0.05；與皮膚損傷組比較，bP＜0.05；與黃芪甲苷高劑量組比較，cP＜0.05

給藥劑量護(hù)理軟膏（g）黃芪甲苷（mg/mL）PI3K抑制劑（mg/kg）糖尿病組 6 - - - 49.25±2.36皮膚損傷組 6 - - - 7.46±4.25a護(hù)理軟膏組 6 2 - - 35.26±4.29a b黃芪甲苷高劑量組 6 - 100 - 33.85±4.37a b黃芪甲苷低劑量組 6 - 20 - 17.82±3.98a b c黃芪甲苷+PI3K抑制劑組6 - 100 10 19.27±4.72a b c F 82.814 P 0.000組別 動(dòng)物數(shù)（只） 創(chuàng)面血管化面積比（%）

圖2 各組大鼠創(chuàng)面組織血管直視圖及Micro-CT掃描血管圖（比例尺：1 mm，×10）

2.3 各組大鼠創(chuàng)面組織病理變化情況糖尿病組大鼠具有正常的皮膚組織，上皮細(xì)胞排列緊密，真皮內(nèi)纖維完好無損，無炎癥反應(yīng)，皮膚內(nèi)膠原數(shù)量多，且排列整齊無間隙；皮膚損傷組大鼠上皮組織破損嚴(yán)重，厚度增加，真皮內(nèi)纖維間充斥大量炎癥細(xì)胞，膠原松散，方向不一；護(hù)理軟膏組、黃芪甲苷高劑量組大鼠上皮細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，排列較為密集，真皮內(nèi)纖維間炎癥細(xì)胞大量減少，膠原數(shù)量增多，方向較為規(guī)律；黃芪甲苷低劑量組、黃芪甲苷+PI3K抑制劑組大鼠上皮組織恢復(fù)較慢，仍有少量炎癥細(xì)胞存在，膠原數(shù)量逐漸增多，但仍有少量間隙。（見圖3）

圖3 各組大鼠創(chuàng)面組織HE染色及Masson染色圖（×400）

2.4 各組大鼠創(chuàng)面組織PI3K mRNA、AKT mRNA、eNOS mRNA、VEGFmRNA、VEGFR2 mRNA表達(dá)水平比較皮膚損傷組大鼠創(chuàng)面組織PI3K mRNA、AKT mRNA、eNOS mRNA、VEGF mRNA、VEGFR2 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯高于糖尿病組（P＜0.05）；護(hù)理軟膏組、黃芪甲苷高劑量組、黃芪甲苷低劑量組、黃芪甲苷+PI3K抑制劑組大鼠創(chuàng)面組織PI3K mRNA、AKT mRNA、eNOS mRNA、VEGFmRNA、VEGFR2 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯高于皮膚損傷組（P＜0.05）；黃芪甲苷低劑量組大鼠創(chuàng)面組織PI3K mRNA、AKT mRNA、eNOS mRNA、VEGF mRNA、VEGFR2 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯低于黃芪甲苷高劑量組（P＜0.05）；黃芪甲苷高劑量組、黃芪甲苷+PI3K抑制劑組大鼠創(chuàng)面組織PI3K mRNA、AKT mRNA、eNOS mRNA、VEGF mRNA、VEGFR2 mRNA相對(duì)表達(dá)量與護(hù)理軟膏組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見表4）

表4 各組大鼠創(chuàng)面組織PI3K mRNA、AKT mRNA、eNOS mRNA、VEGFmRNA、VEGFR2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表4 各組大鼠創(chuàng)面組織PI3K mRNA、AKT mRNA、eNOS mRNA、VEGFmRNA、VEGFR2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與糖尿病組比較，aP＜0.05；與皮膚損傷組比較，bP＜0.05；與黃芪甲苷高劑量組比較，cP＜0.05

給藥劑量護(hù)理軟膏（g）黃芪甲苷（mg/mL）PI3K抑制劑（mg/kg）糖尿病組 6 - - - 1.08±0.12 1.11±0.14 1.06±0.07 1.03±0.07 1.12±0.08皮膚損傷組 6 - - - 1.48±0.25a 1.67±0.21a 1.84±0.31a 2.48±0.31a 1.62±0.21a護(hù)理軟膏組 6 2 - - 3.36±0.26ab 4.25±0.36ab 3.92±0.34ab 5.37±0.41ab 3.96±0.46ab黃芪甲苷高劑量組 6 - 100 - 3.27±0.32ab 3.97±0.42ab 4.07±0.32ab 5.52±0.38ab 4.12±0.44ab黃芪甲苷低劑量組 6 - 20 - 2.46±0.42abc 2.72±0.33abc 2.47±0.33abc 3.64±0.37abc 2.36±0.28abc黃芪甲苷+PI3K抑制劑組6 - 100 10 3.21±0.27ab 4.21±0.37ab 3.87±0.28ab 5.44±0.29ab 3.92±0.31ab F 70.980 109.797 115.584 198.318 99.806 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000組別 動(dòng)物數(shù)（只） PI3K mRNA AKT mRNA eNOS mRNA VEGF mRNA VEGFR2 mRNA

2.5 各組大鼠創(chuàng)面組織PI3K、AKT、eNOS、p-PI3K、p-AKT、p-eNOS、VEGF、VEGFR2蛋白表達(dá)比較 皮膚損傷組大鼠創(chuàng)面組織VEGF、VEGFR2蛋白相對(duì)表達(dá)量及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-eNOS/eNOS均明顯高于糖尿病組（P＜0.05）；護(hù)理軟膏組、黃芪甲苷高劑量組、黃芪甲苷低劑量組、黃芪甲苷+PI3K抑制劑組大鼠創(chuàng)面組織VEGF、VEGFR2蛋白相對(duì)表達(dá)量及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-eNOS/eNOS均明顯高于皮膚損傷組（P＜0.05）；黃芪甲苷低劑量組、黃芪甲苷+PI3K抑制劑組大鼠創(chuàng)面組織VEGF、VEGFR2蛋白相對(duì)表達(dá)量及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-eNOS/eNOS均明顯低于黃芪甲苷高劑量組（P＜0.05）；黃芪甲苷高劑量組大鼠創(chuàng)面組織VEGF、VEGFR2蛋 白 相 對(duì) 表 達(dá) 量 及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-eNOS/eNOS與護(hù)理軟膏組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見圖4、表5）

表5 各組大鼠創(chuàng)面組織VEGF、VEGFR2蛋白相對(duì)表達(dá)量及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-eNOS/eNOS比較（±s）

表5 各組大鼠創(chuàng)面組織VEGF、VEGFR2蛋白相對(duì)表達(dá)量及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-eNOS/eNOS比較（±s）

注：與糖尿病組比較，aP＜0.05；與皮膚損傷組比較，bP＜0.05；與黃芪甲苷高劑量組比較，cP＜0.05

給藥劑量護(hù)理軟膏（g）黃芪甲苷（mg/mL）PI3K抑制劑（mg/kg）糖尿病組 6 - - - 0.43±0.11 0.56±0.21 0.52±0.12 0.42±0.07 0.34±0.13皮膚損傷組 6 - - - 1.12±0.14a 0.95±0.17a 0.86±0.11a 0.77±0.15a 0.63±0.15a護(hù)理軟膏組 6 2 - - 2.56±0.21a b 2.45±0.26a b 1.56±0.14a b 1.54±0.16a b 1.46±0.11a b黃芪甲苷高劑量組 6 - 100 - 2.47±0.34a b 2.42±0.31a b 1.61±0.14a b 1.49±0.15a b 1.43±0.12a b黃芪甲苷低劑量組 6 - 20 - 1.62±0.23a b c 1.57±0.34a b c 1.22±0.13a b c 1.09±0.14a b c 0.92±0.13a b c黃芪甲苷+PI3K抑制劑組 6 - 100 10 1.74±0.27a b c 1.53±0.27a b c 1.17±0.12a b c 1.14±0.19a b c 1.01±0.11a b c F 74.418 49.147 64.261 50.211 73.453 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000組別 動(dòng)物數(shù)（只） VEGF/GAPDH VEGFR2/GAPDH p-PI3K/PI3K p-AKT/AKT p-eNOS/eNOS

圖4 各組大鼠創(chuàng)面組織PI3K、AKT、eNOS、p-PI3K、p-AKT、

p-eNOS、VEGF、VEGFR2蛋白表達(dá)Western blotting圖

3 討 論

糖尿病可引起身體機(jī)能喪失，引發(fā)多個(gè)器官功能衰竭，阻礙血管新生，導(dǎo)致糖尿病患者的傷口愈合能力減弱，引發(fā)嚴(yán)重潰瘍。研究估測(cè)15%～25%的糖尿病患者因此殘疾或死亡，故開發(fā)促進(jìn)糖尿病患者受損皮膚創(chuàng)面愈合的藥物成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[13-14]。有文獻(xiàn)[15]指出，中醫(yī)藥在治療皮膚損傷的研究中被證實(shí)有良好的效果。黃芪甲苷可以有效促進(jìn)血管再生，且對(duì)于糖尿病引起的腎臟、胰臟等器官的損傷具有良好的治療效果，推測(cè)其對(duì)于糖尿病皮膚缺損具有一定的功效。本研究通過手術(shù)造成糖尿病大鼠皮膚損傷，依據(jù)參考文獻(xiàn)[16]，記錄不同時(shí)間段大鼠創(chuàng)面愈合率的變化情況判斷大鼠傷口愈合能力，通過Microfil灌注聯(lián)用microCT掃描判斷大鼠血管新生能力，選用治療皮膚損傷的常規(guī)藥物護(hù)理軟膏作為陽性對(duì)照[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，皮膚損傷后涂抹護(hù)理軟膏和不同劑量的黃芪甲苷均可以明顯提高各時(shí)間段的創(chuàng)面愈合率和創(chuàng)面血管化面積比，且護(hù)理軟膏與高劑量的黃芪甲苷效果最為明顯，說明黃芪甲苷可有效加速糖尿病大鼠的傷口愈合，促進(jìn)血管新生，高劑量的黃芪甲苷具有與常規(guī)藥物等同的治療效果。

為進(jìn)一步觀察受損皮膚內(nèi)在的組織病理學(xué)變化，本研究依據(jù)文獻(xiàn)常用方法，對(duì)創(chuàng)面組織進(jìn)行HE染色及Masson染色[18]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)涂抹護(hù)理軟膏和不同劑量的黃芪甲苷后創(chuàng)面組織內(nèi)上皮細(xì)胞及膠原數(shù)量逐漸增多，炎癥細(xì)胞減少，且護(hù)理軟膏與高劑量的黃芪甲苷效果最為明顯，進(jìn)一步驗(yàn)證了黃芪甲苷可參與緩解皮膚炎癥，加速皮膚愈合，對(duì)于傷口的治療有良好的效果，但具體的作用機(jī)理仍有待進(jìn)一步探索。

有研究[19-20]指出，PI3K/AKT/eNOS信號(hào)通路參與調(diào)控VEGF、VEGFR表達(dá)及血管再生，且對(duì)于糖尿病大鼠腦血管損傷具有良好的治療效果，推測(cè)PI3K/AKT/eNOS信號(hào)通路在創(chuàng)面愈合中同樣發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，皮膚損傷后PI3K/AKT/eNOS通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)、蛋白磷酸化水平及VEGF、VEGFR2蛋白表達(dá)明顯升高，而涂抹護(hù)理軟膏和不同劑量的黃芪甲苷后，PI3K/AKT/eNOS通路相關(guān)基因mRNA、蛋白磷酸化水平及VEGF、VEGFR2蛋白表達(dá)進(jìn)一步明顯升高，表明黃芪甲苷可能通過增強(qiáng)PI3K/AKT/eNOS通路的基因轉(zhuǎn)錄及蛋白磷酸化水平，提高血管生成因子表達(dá)，進(jìn)而加速創(chuàng)面組織的愈合及血管生成。為進(jìn)一步驗(yàn)證，本實(shí)驗(yàn)在涂抹高劑量黃芪甲苷的同時(shí)抑制PI3K的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT/eNOS通路相關(guān)蛋白磷酸化水平明顯降低，且VEGF、VEGFR2蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低，同時(shí)各時(shí)間段的創(chuàng)面愈合率和創(chuàng)面血管化面積比均明顯降低，皮膚組織內(nèi)上皮細(xì)胞及膠原數(shù)量減少，表明黃芪甲苷可通過調(diào)控PI3K/AKT/eNOS信號(hào)通路，增強(qiáng)相關(guān)蛋白磷酸化，從而加速創(chuàng)面愈合及血管生成。

綜上所述，黃芪甲苷可通過調(diào)控PI3K/AKT/eNOS信號(hào)通路，增強(qiáng)PI3K/AKT/eNOS通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)及蛋白磷酸化水平，提高VEGF、VEGFR2蛋白的表達(dá)，促進(jìn)上皮細(xì)胞及膠原生成，加速創(chuàng)面組織愈合及血管生成。但黃芪甲苷是否還有其他作用途徑間接參與調(diào)控皮膚創(chuàng)面愈合，還需更多實(shí)驗(yàn)加以說明。