復方鉤藤降壓解郁方對高血壓并發(fā)抑郁癥大鼠的藥效作用及物質(zhì)基礎(chǔ)*

陳春茗，劉葉倩，陳 蕾，趙紅霞，李 弘，任衛(wèi)瓊

（1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；3.安徽省第二人民醫(yī)院，安徽 合肥 230041）

復方鉤藤降壓解郁方是以經(jīng)典方“天麻鉤藤飲”為基礎(chǔ)方化裁而成，由鉤藤、天麻、川芎、地龍、杜仲、桑寄生、丹參、白芍、貫葉連翹、葛根10味中藥組成，具有養(yǎng)陰平肝、化瘀解郁的作用，可用于高血壓并發(fā)抑郁癥的治療，但其藥效和活性成分缺乏系統(tǒng)研究。超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS）技術(shù)具有快速、準確、全面的特點，近年來廣泛用于中藥復方化學成分的分析。本研究從藥理學和藥物分析學兩個角度研究復方鉤藤降壓解郁方，綜合分析了此方的主要化學成分并揭示了其藥效作用，以期為后續(xù)復方鉤藤降壓解郁方的二次開發(fā)和臨床應用奠定基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 實驗動物8周齡SPF級雄性SHR大鼠20只，體質(zhì)量180～220 g，收縮壓180～200 mmHg（1 mm Hg=0.133 kPa），購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，質(zhì)量合格證編號：1100112 11113502636，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2021-0006。8周齡SPF級雄性SD大鼠10只，體質(zhì)量180～220 g，購自湖南安生美藥物研究院有限公司，質(zhì)量合格證編號：430727211102773234，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0004。以上大鼠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院實驗動物中心SPF級實驗動物房中，飼養(yǎng)條件：溫度20～25℃，濕度40%～70%，12 h明暗交替，適應性飼養(yǎng)7 d。動物使用許可證號：SYXK（湘）2020-0010。倫理委員會審批號：2YFY20210316-01。

1.2 藥物與試劑復方鉤藤降壓解郁方購于湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，由鉤藤、天麻、川芎、地龍、杜仲、桑寄生、丹參、白芍、貫葉連翹、葛根10味中藥組成，藥材經(jīng)該院張裕民主任中藥師鑒定均符合2020年版《中華人民共和國藥典》的質(zhì)量要求。異鉤藤堿對照品（批號：111927-201804，純度＞98%）、鉤藤堿對照品（批號：112028-201601，純度＞98%）均購于中國食品藥品檢定研究院；芍藥內(nèi)酯苷對照品（批號：20200419，純度＞98%）、芍藥苷對照品（批號：107D021，純度＞98%）均購于北京索萊寶科技有限公司；葛根素對照品（批號：21090805，純度＞98%）、隱丹參酮對照品（批號：21091603，純度＞98%）、洋川芎內(nèi)酯A對照品（批號：21080506，純度＞98%）均購于成都普菲德生物技術(shù)有限公司；色譜甲醇、質(zhì)譜乙腈均購于德國Merck Millipore公司；蒸餾水購于深圳屈臣氏蒸餾水有限公司；甲酸銨（質(zhì)譜級）購于美國Fisher公司。

1.3 主要儀器YLS-9A型生理、藥理電子刺激儀（濟南益延科技發(fā)展有限公司）；BP-98A型智能無創(chuàng)血壓計（北京軟隆生物技術(shù)有限公司）；MK3型酶標儀（美國Thermo-fisher公司）；Agilent 1290UPLC-6540 Q-TOF色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司）；超聲儀（上?？茖С晝x器有限公司）；S-23型高速臺式離心機（湖南湘儀儀器有限公司）；AUW120D電子分析天平（日本SHIMADZU公司）。

2 方 法

2.1 動物實驗

2.1.1 藥液的制備 將復方鉤藤降壓解郁方16劑（94 g/劑）藥物（除鉤藤外）置于煎藥器中，浸泡30 min，加水煎煮1 h，鉤藤后下，第2次加水煎煮40 min，合并藥液后過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成復方鉤藤降壓解郁方干膏289.6 g。將復方鉤藤降壓解郁方干膏用蒸餾水溶解并稀釋成質(zhì)量濃度為0.846 g/mL藥液，冷藏備用。

2.1.2 造模與分組 造模方法按照前期研究建立的方法[1]，將20只SHR大鼠，按隨機數(shù)字表法分為模型組、復方鉤藤降壓解郁方組，每組10只。10只SD大鼠為正常對照組。除正常對照組外，其余兩組大鼠每天進行不可預知慢性應激刺激：（1）噪聲4 h；（2）禁水24 h；（3）禁食24 h；（4）晝夜顛倒24 h；（5）潮濕墊料24 h；（6）4℃冰水浴4 min；（7）傾籠45° 24 h；（8）夾尾1 min。每種刺激方法每天隨機抽取進行干預，方法（6）、（8）每周1次，且1周內(nèi)的干預方法不重復。

2.1.3 實驗給藥 根據(jù)《中藥藥理研究方法學》[2]，按體表面積折算大鼠的等效給藥劑量，大鼠每日用藥量為8.46 g/kg，正常對照組和模型組大鼠給予等體積蒸餾水，1次/d，連續(xù)給藥28 d。

2.1.4 觀察指標

2.1.4.1 各組大鼠血壓變化情況 用BP-98A智能無創(chuàng)血壓計在給藥前和給藥后第1、2、3、4周分別測量各組大鼠血壓值（給藥后1 h尾動脈收縮壓的平均值即為該只大鼠所在周的血壓值）。

2.1.4.2 行為學檢測 通過Open-field實驗、新奇攝食實驗和糖水偏好實驗觀察各組大鼠抑郁行為、認知功能等的變化。

Open-field實驗是在弱光和低噪聲環(huán)境下，將大鼠單獨置于黑色正方形曠場中央，曠場裝置是100 cm×100 cm×40 cm的木制箱，內(nèi)側(cè)面及底部均為黑色，底部漆成橫豎各3條白線。曠場實驗時間為5 min，將小鼠放入中心方格內(nèi)，攝像記錄大鼠5 min內(nèi)穿越格數(shù)（水平運動）和前肢離地成攀壁的直立次數(shù)（垂直運動），直立計數(shù)要求雙腳抬起。水平運動1格計1分，直立1次計1分。每只大鼠接受1次測試，測試完畢后撿拾糞便，用75%的醫(yī)用酒精噴灑曠場底部及內(nèi)側(cè)壁，用干毛巾擦拭，待其揮發(fā)后進行下一只的操作，以避免上只實驗大鼠留有氣味而干擾實驗結(jié)果。

新奇攝食實驗是使用頂部開放的白色不透明樹脂測試箱，底部鋪滿約2 cm厚的墊料，在中央擺放6粒飼料顆粒。禁食24 h后，將大鼠從同一個角落放入箱中并開始計時，以開始咀嚼食物為標準記錄所用時間，定義為攝食潛伏期。測試共計5 min，5 min內(nèi)未進食者攝食潛伏期記錄為5 min。

糖水偏好實驗是在大鼠適應性訓練后，禁食禁水24 h，各籠備蔗糖水與蒸餾水各一瓶，每瓶200 mL，供大鼠自由飲用，1 h后調(diào)換二者位置，2 h后撤除水瓶，記錄2 h內(nèi)蔗糖水瓶糖水消耗量。計算糖水偏愛率（%）=（糖水消耗/液體總計消耗）×100%。

2.1.4.3 炎癥因子指標檢測 實驗結(jié)束后，各組大鼠禁食不禁水處理12 h，10%水合氯醛麻醉后取腦，于冷凍操作臺上分離海馬組織，經(jīng)液氮急速冷凍后，保存于-80℃冰箱。采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測大鼠海馬組織中IL-1β、IL-6的含量。

2.1.5 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 21.0軟件處理，計量資料用（±s）表示，多組間比較服從正態(tài)分布且方差齊，采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。用GraphPad Prism 7制作柱狀圖。

2.2 UPLC-Q-TOF-MS分析

2.2.1 對照品和供試品溶液的制備

2.2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取葛根素、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、異鉤藤堿、鉤藤堿、洋川芎內(nèi)酯A和隱丹參酮對照品各2 mg，置于10 mL的容量瓶中，用70%甲醇溶解，稀釋至刻度，并用0.22 μm微孔濾膜過濾，各吸取0.1 mL于進樣瓶中，即得對照品溶液。

2.2.1.2 供試品溶液的制備 取2 g干膏，置于50 mL錐形瓶中，加70%甲醇50 mL，超聲處理30 min，冷卻，補加70%甲醇后離心，并用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.2.2 色譜及質(zhì)譜條件 色譜條件：色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（3.0 mm×100 mm，1.8 μm），流動相由有機相乙腈（A）和水相（B）組成，其中水相B中含0.05 mmol/L甲酸銨（質(zhì)譜級），設(shè)置梯度洗脫程序：0～5 min，5%～15%A；5～10 min，15%～35%A；10～20min，35%～65%A；20～25min，65%～95%A；流速：0.4 mL/min，進樣量：1 μL。

質(zhì)譜檢測條件：采用正負離子分析模式，離子化方式為電噴霧離子化（ESI），進樣分析前采用Agilent標準調(diào)諧液ESI-L Low Concentration Tuning Mix（G1969-85000）來進行準確質(zhì)量數(shù)的校正。一級質(zhì)譜掃描檢測檢測范圍（m/z）：100～1 700，采用氮氣為除溶劑干燥氣體，溫度為325℃，流速為6.8 L/min；鞘氣溫度為350℃；毛細管電壓為4.0 kV，F(xiàn)ragment電壓為150V。

3 結(jié) 果

3.1 動物實驗

3.1.1 各組大鼠血壓變化比較 與正常對照組比較，模型組大鼠血壓在給藥前和給藥后第1、2、3、4周均明顯升高（P＜0.01），提示模型制備成功。與模型組比較，復方鉤藤降壓解郁方組大鼠血壓在給藥后第1、2、3、4周均明顯降低（P＜0.01），說明復方鉤藤降壓解郁方可以很好地抑制高血壓并發(fā)抑郁癥模型大鼠的血壓。（見圖1）

圖1 各組大鼠血壓變化比較（±s，n=10）

3.1.2 行為學檢測結(jié)果 與正常對照組比較，模型組大鼠自主活動（水平運動、垂直運動）明顯減少，攝食潛伏期明顯延長，糖水偏好程度明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01），說明模型大鼠在行為學上明顯出現(xiàn)了抑郁樣改變，提示造模成功。與模型組比較，復方鉤藤降壓解郁方組大鼠自主活動能力（水平運動、垂直運動）明顯增多，攝食潛伏期明顯縮短，糖水偏好程度明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。（見圖2～4）

圖2 各組大鼠自由活動次數(shù)比較（±s，n=10）

圖3 各組大鼠攝食潛伏期比較（±s，n=10）

圖4 各組大鼠糖水偏好程度比較（±s，n=10）

3.1.3 各組大鼠海馬炎癥因子IL-1β、IL-6的含量比較 與正常對照組比較，模型組大鼠海馬炎癥因子IL-1β、IL-6的水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，復方鉤藤降壓解郁方組大鼠海馬炎癥因子IL-1β、IL-6的水平均明顯降低（P＜0.05）。（見圖5）

圖5 各組大鼠海馬炎癥因子IL-1β、IL-6水平比較（±s，n=10）

3.2 UPLC-Q-TOF-MS分析

3.2.1 主要色譜峰的鑒定以及化合物的藥材來源 通過中國科學院化學數(shù)據(jù)庫（www.organchem.csdb.cn）以及文獻分析，初步構(gòu)建復方鉤藤降壓解郁方10味中藥化學成分數(shù)據(jù)庫，共檢索到1 768個化學成分，其中鉤藤106個、天麻170個、川芎113個、地龍83個、杜仲206個、桑寄生166個、丹參225個、白芍85個、貫葉連翹311個、葛根303個。

利用UPLC-Q-TOF-MS分析方法，從復方鉤藤降壓解郁方中快速鑒定出化合物51個，包括黃酮類9個、糖苷類7個、苯丙素類1個、二萜類5個、生物堿類11個、酚酸及其酯類2個、氨基酸類2個、其他類14個，并對每個化合物的來源進行了歸屬。復方鉤藤降壓解郁方UPLC-Q-TOF-MS正、負離子流圖及對照品圖譜見圖6～7，復方鉤藤降壓解郁方化學成分的保留時間、質(zhì)荷比、誤差、分子式、化合物名稱、碎片離子信息、藥材來源等信息數(shù)據(jù)見表1。

表1 復方鉤藤降壓解郁方化學成分質(zhì)譜信息

圖6 復方鉤藤降壓解郁方UPLC-Q-TOF-MS總離子流圖

3.2.2 各種化合物的結(jié)構(gòu)和裂解

3.2.2.1 生物堿類化合物 化合物26：復方鉤藤降壓解郁方中的生物堿類化合物主要來自鉤藤。正離子模式下，ESI－MS準分子離子峰為（m/z）385.209 8[M+H]+，tR為17.458 min，分子式為C22H28N2O4，碎片離子峰為160.074 7，187.082 1，241.132 5，269.163 2，353.185 5。分別對應[M+H-C12H19NO3]+，[M+HC11H18O3]+，[M+H-C7H10O3]+，[M+H-C5H8O3]+，[M+H-CH2O]+。通過對照品比對，鑒定化合物26為異鉤藤堿。（見圖8～9）

圖7 對照品UPLC圖譜

圖8 異鉤藤堿碎片離子圖

圖9 異鉤藤堿可能的裂解過程

3.2.2.2 黃酮類化合物 化合物18、21：復方鉤藤降壓解郁方中的黃酮類化合物主要來自葛根。峰21和18的準分子離子峰均為（m/z）417[M+H]+，峰18質(zhì)譜圖的碎片離子為（m/z）255[M+H-Glu]+，推測可能是大豆苷。峰21質(zhì)譜圖的碎片離子為（m/z）381[M+H-2H2O]+，297[M+H-H2O-C4H6O3]+，根據(jù)對照品對照，鑒定為葛根素。（見圖10～13）

圖10 大豆苷碎片離子圖

圖11 大豆苷可能的裂解途徑

圖13 葛根素可能的裂解途徑

3.2.2.3 二萜類化合物 化合物50：復方鉤藤降壓解郁方中的二萜類化合物主要來自丹參。如圖14所示，化合物50，保留時間為38.922 min，分子式為C19H18O3，在正離子模式下得到（m/z）295[M+H]+，280[M+H-CH3]+，277[M+H-H2O]+，266[M+H-CHO]+，262[M+H-H2O-CH3]+，249[M+H-H2O-CO]+的碎片離子，推測該化合物為丹參酮ⅡA，其裂解途徑見圖15。

圖12 葛根素碎片離子圖

圖14 丹參酮ⅡA碎片離子圖

圖15 丹參酮ⅡA可能的裂解途徑

4 討 論

高血壓并發(fā)抑郁癥是臨床上高血壓患者常見的并發(fā)癥之一，該病的發(fā)病率為26.8%，在中國人群中更為典型[31]，并且其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。由于目前高血壓并發(fā)抑郁癥的具體發(fā)病機制尚不明確，大多數(shù)的治療方案都是從抗抑郁和降血壓以及改善臨床癥狀入手，并沒有從兩者共性發(fā)病機制的關(guān)聯(lián)入手，存在一定的局限性。西藥治療存在副作用大、易復發(fā)等缺點，中醫(yī)藥重視辨證論治和整體觀，通過多靶點、多途徑調(diào)節(jié)患者的臨床癥狀。因此，將化學成分、藥理作用、作用機制研究與臨床需求相結(jié)合，開展中藥復方更高層次的研究，對高血壓并發(fā)抑郁癥的防治具有重要的科學價值。

利用UPLC-Q-TOF-MS快速鑒定中藥或復方中活性成分是當前的研究熱點與趨勢[32-35]。中藥復方活性成分難于識別，常規(guī)方法提取活性成分費時費力，并且分離過程可能導致低含量活性成分丟失。中藥復方化學成分的分析是中藥發(fā)揮藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，有助于進一步闡明中藥復方的配伍規(guī)則和藥理作用。

復方鉤藤降壓解郁方以復方鉤藤降壓片與天麻鉤藤飲為基礎(chǔ)方化裁而成；方中鉤藤、天麻為君藥，滋陰潛陽，平肝息風；地龍息風通絡(luò)，為臣藥，助君藥化瘀息風之力；佐以杜仲、桑寄生滋補肝腎，葛根解肌退熱、生津止渴。以上藥物作為基本方，再加入養(yǎng)陰柔肝、疏肝解郁的白芍、貫葉連翹等10味中藥組成本方。

有文獻表明[36]，天麻鉤藤飲和其單味藥材中主要包括黃酮類和生物堿類成分，但對于復方鉤藤降壓解郁方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚未見相關(guān)報道。研究表明，天麻的主要有效成分是酚類及多糖類化合物，具有鎮(zhèn)靜催眠、抗焦慮、抗抑郁、神經(jīng)保護、抗眩暈、調(diào)節(jié)循環(huán)系統(tǒng)、抗炎、鎮(zhèn)痛、改善記憶等藥理作用[37]。鉤藤中的生物堿類主要化學成分具有抗氧化、抗炎和調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的作用，被廣泛應用于治療驚厥癲癇、高血壓、抑郁癥等疾病[38]。地龍中的活性蛋白具有防治高血壓和動脈粥樣硬化等藥理作用[4]。白芍中的芍藥苷、白芍苷等有效成分具有降低動脈硬化早期生物標志物的作用[39]。丹參主要包括黃酮類、萜類和酚酸類化合物，具有抗氧化、抗炎、降血糖和鎮(zhèn)靜等作用[40]。

本實驗利用UPLC-Q-TOF-MS新技術(shù)從復方鉤藤降壓解郁方中快速鑒定化合物51個。鑒定出的化合物中來源于葛根18個、鉤藤12個、丹參6個、川芎4個、白芍3個、地龍3個、天麻3個、杜仲1個、桑寄生1個、貫葉連翹1個。其中苯甲醛在天麻和貫葉連翹中均有存在。鑒定出的化合物中來源于葛根所含成分最多。葛根是臨床常用中藥材之一，為豆科植物野葛的干燥根，具有解肌退熱、升陽止瀉的功效。葛根具有很好的降血壓作用[41]，其主要有效成分是黃酮類化合物[42]，且主要的降血壓活性成分是葛根素[43-45]?？傠x子流圖顯示葛根素在復方鉤藤降壓解郁方中含量最高。葛根素能擴張冠狀動脈和腦血管，具有降低血壓、改善神經(jīng)纖維傳導速度的功效[46-47]。GAO S等[48]研究表明葛根素可顯著降低IL-1β、IL-6、IL-10等炎癥細胞因子的表達，下調(diào)NF-κB的活性，從而抑制炎癥反應，改善高血壓并發(fā)抑郁癥的癥狀。有文獻報道，葛根素對重癥高血壓具有很好的心血管保護作用[49]。

本研究發(fā)現(xiàn)，高血壓并發(fā)抑郁癥模型組大鼠血壓上升，且精神萎靡，食欲差；同時其自主活動減少，攝食潛伏期延長，即其對未知環(huán)境的探索能力和興趣明顯下降；糖水偏好程度降低，說明其快感缺失，無法從糖水獎勵中體驗到快樂；海馬組織中IL-1β、IL-6的含量升高，進一步驗證了實驗造模成功。復方鉤藤降壓解郁方組大鼠血壓下降，自主活動增加，攝食潛伏期縮短，糖水偏好程度上升，海馬炎癥因子IL-1β、IL-6的含量明顯降低，說明復方鉤藤降壓解郁方對高血壓并發(fā)抑郁癥大鼠有效，同時化學成分分析結(jié)果初步證明是其中含量最高的葛根素發(fā)揮了調(diào)節(jié)血壓和緩解抑郁程度的作用，而且表明本方法可以在中藥復方復雜體系中實現(xiàn)對活性成分的簡單快捷高通量篩選。

本研究為復方鉤藤降壓解郁方的藥效和物質(zhì)基礎(chǔ)提供了實驗依據(jù)，也為后續(xù)學者開展高血壓并發(fā)抑郁癥相關(guān)研究提供了一些參考，但其單味藥之間的協(xié)同作用及作用靶點尚需進一步研究。