云南白族民間藥小葉石梓的抗腫瘤活性研究*

倪 亮，吳 瓊，王文淵，劉繼平，曠 翔，姚 毅，張先林

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院/國家級(jí)中藥炮制技術(shù)傳承基地，江蘇 南京 210029；2.貴州同德藥業(yè)有限公司/銅仁市中藥飲片炮制工程技術(shù)研究中心，貴州 銅仁 554300；3.貴州信邦中藥材發(fā)展有限公司，貴州 銅仁 554300）

小葉石梓（Gmelina delavayana P.Dop）為馬鞭草科（Verbenaceae）石梓屬（Gmelina）植物，主要分布于云南漾濞及金沙江支流河谷（鄧川、鶴慶、賓川、永勝等），海拔1 500～1 700 m的石灰?guī)r叢林下或灌叢中，或干燥荒坡上。（見圖1）該屬植物全球約有35種，我國分布有7種[1]。

圖1 小葉石梓形態(tài)特征

馬鞭草科石梓屬植物如云南石梓、小葉石梓、石梓，其根、葉、花、果實(shí)、干皮等作為哈尼族、傣族、黎族、彝族等多個(gè)少數(shù)民族的民間用藥，被廣泛用于多種疾病的治療[2-4]。該屬植物云南石梓（Gmelina arborea Roxb.）是一種珍貴的藥用喬本樹種，在印度傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)體系中有驅(qū)蟲、抗菌、抗糖尿病、利尿、肝保護(hù)、抗癲癇等功效[5]?，F(xiàn)代研究[6-8]發(fā)現(xiàn)該屬植物還具有抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)、抗炎等生物活性。《西昌中草藥》記載小葉石梓的根具有健胃消食、理氣鎮(zhèn)痛、化痞截瘧的作用[9]。石梓屬植物中主要含有環(huán)烯醚萜苷、木脂素、芳基?；氖罄钐擒?、黃酮、生物堿等化學(xué)成分[10]。目前石梓屬的化學(xué)與藥理研究主要集中于喬木云南石梓的開發(fā)利用[5]，而對(duì)于云南特有的小灌木小葉石梓的化學(xué)成分與藥理活性研究尚未有報(bào)道。本研究將小葉石梓根的乙醇提取液利用不同極性的溶劑進(jìn)行萃取，通過MTT法檢測這些極性部位對(duì)人乳腺癌細(xì)胞（MCF7）、人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞（NCI-H446）及人宮頸癌細(xì)胞（Hela229）增殖的影響，以期為小葉石梓的綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材 料

1.1 藥材小葉石梓根于2019年5月采挖于云南省大理市洱源縣，經(jīng)江蘇省中醫(yī)院姚毅主任中藥師鑒定為馬鞭草科（Verbenaceae）石梓屬（Gmelina）植物小葉石梓（Gmelina delavayana P.Dop）的干燥根。標(biāo)本經(jīng)烘干、粉碎、過60目篩后，存放于貴州同德藥業(yè)有限公司銅仁市中藥飲片炮制工程技術(shù)研究中心，置于4℃冰箱保存。

1.2 試劑特級(jí)胎牛血清（批號(hào)：Sa211109）、DMEM高糖（含雙抗）（批號(hào)：202006）、RPMI-1640（含雙抗）（批號(hào)：202006）、MCF7細(xì)胞專用培養(yǎng)基（批號(hào)：202007）均購自普諾賽公司；CCK-8法細(xì)胞增殖檢測試劑盒（批號(hào)：YFXCA01）購自翼飛雪公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）（批號(hào)：112520210402）購自Solarbio公司；乙腈為色譜純，購自德國默克公司；其他化學(xué)試劑均為分析純，購自上海國藥化學(xué)試劑公司。

1.3 細(xì)胞人宮頸癌細(xì)胞（Hela229）、人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞（NCI-H446）、人乳腺癌細(xì)胞（MCF7）均購自普諾賽公司。

1.4 主要儀器BT125型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；Milli-Q Advantage超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；Waters ACQUITY UPLC系統(tǒng)（包括四元泵溶劑系統(tǒng)、在線脫氣機(jī)和自動(dòng)進(jìn)樣器）（美國Waters公司）；AB Sciex TripleTOF 5600三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀、Waters MsaaLynx V 4.1工作站、EnSpire型多功能酶標(biāo)儀（美國帕金埃爾默PerkinElmer公司）；微孔板恒溫振蕩器（杭州米歐儀器有限公司）；1300 series A2超凈工作臺(tái)（美國Thermo公司）；Forma seriesⅡwater jacket型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）。

2 方 法

2.1 小葉石梓浸膏及各極性部位的制備取小葉石梓的根粉碎并在105℃條件下烘干，用60%的乙醇按1∶10的比例加熱回流提取2 h，連續(xù)提取3次，合并提取液。減壓回流濃縮成浸膏，干燥，稱質(zhì)量。將浸膏用水分散后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正定醇萃取，獲得小葉石梓的不同極性部位。取小葉石梓的不同極性部位冷凍干燥成粉末，精密稱量，分別加入二甲亞砜制成質(zhì)量濃度為100、50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL的小葉石梓醇提物不同極性部位溶液，4℃冰箱保藏待用。

2.2 MTT法測定各部位抗腫瘤活性

2.2.1 腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng) 采用10% FBS（含DMEM、特級(jí)胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素）培養(yǎng)基、MCF7細(xì)胞專用培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2、相對(duì)濕度為90%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)Hela229、NCI-H446、MCF7。每隔1 d更換1次培養(yǎng)基，每3 d傳代1次。

2.2.2 小葉石梓提取物不同極性部位對(duì)3種腫瘤細(xì)胞活力的影響 取對(duì)數(shù)生長期的3種腫瘤細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至2×103個(gè)細(xì)胞/孔，均勻接種于96孔板中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；棄去培養(yǎng)基，分別加入200 μL質(zhì)量濃度為100、50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL的小葉石梓醇提物不同極性部位，平行3個(gè)復(fù)孔，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞24 h；棄去培養(yǎng)基，加入90 μL 1% FBS培養(yǎng)基和10 μL MTT（5 mg/mL）溶液，共同孵育細(xì)胞3 h；再次棄去培養(yǎng)基，96孔板各孔中加入150 μL二甲基亞砜，37℃恒溫振蕩器振蕩30 min。酶標(biāo)儀570 nm下測量各孔的吸光度，并計(jì)算細(xì)胞IC50。

2.3 小葉石梓乙酸乙酯部位化學(xué)成分分析UPLC色譜條件：采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），以0.1%甲酸溶液（A）和乙腈（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫：0～12 min，5% B～50% B；12～13 min，50% B～100% B；13～14min，100% B～5% B；14～15min，5%B～5% B。流速為0.4mL/min；柱溫為30℃；檢測波長為535 nm；進(jìn)樣體積為2 μL。

質(zhì)譜條件：AB Sciex TripleTOF 5600三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，電噴霧離子源（ESI）對(duì)樣品進(jìn)行離子化（ESI+/ESI-），質(zhì)量掃描范圍（m/z）：100～1 000，毛細(xì)管電壓為3.0 kV，錐孔電壓為45 V；離子源溫度為120℃，脫溶劑氣溫度為350℃；錐孔氣流量為50 L/h，脫溶劑流量為600 L/h。在碰撞能量為4 eV情況下，掃描時(shí)間為0.5 s，間隔掃描時(shí)間為0.02 s。采用亮氨酸·腦啡肽溶液作為標(biāo)定溶液（1eucine-enkephalin，ESI+（m/z）：556.277 1，ESI-（m/z）：555.261 5，質(zhì)量濃度為200 pg/mL，流速為100 μL/min；采用Waters MsaaLynx V 4.1工作臺(tái)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。

3 結(jié)果與分析

3.1 小葉石梓不同極性部位及得率按“2.1”項(xiàng)下方法測定小葉石梓不同極性部位萃取得率，浸膏得率為9.58%；石油醚部位得率為0.16%；乙酸乙酯部位得率為1.92%；正丁醇部位得率為2.81%；萃余水部位得率為3.84%。（見圖2）

圖2 小葉石梓各極性部位及得率

3.2 小葉石梓各萃取部位抗腫瘤活性按“2.2”項(xiàng)下方法測定小葉石梓各極性部位抗腫瘤活性，結(jié)果乙酸乙酯極性部位對(duì)MCF-7、NCIH446、Hela229增殖具有良好的抑制作用，IC50分別為（39.79±0.87）、（43.29±0.62）、（41.82±0.37）μg/mL。（見表1）

表1 小葉石梓各部位抗腫瘤活性IC50值（±s，μg/mL）

表1 小葉石梓各部位抗腫瘤活性IC50值（±s，μg/mL）

部位 MCF-7 NCI-H446 Hela229總提取物 85.52±0.92 126.18±0.36 141.78±0.52石油醚部位 127.81±0.76 157.73±0.29 132.60±0.57乙酸乙酯部位 39.79±0.87 43.29±0.62 41.82±0.37正丁醇部位 69.49±0.43 72.12±0.22 69.49±0.21萃余水部位 210.83±1.62 263.99±0.51 191.56±0.97

3.3 小葉石梓乙酸乙酯部位化學(xué)成分鑒定按“2.3”項(xiàng)下方法對(duì)小葉石梓乙酸乙酯部位化學(xué)成分進(jìn)行鑒定，通過Q-TOFMS-MS鑒定出該部位的11個(gè)主要化合物。（見圖3）

圖3 小葉石梓乙酸乙酯萃取部位色譜圖

根據(jù)質(zhì)譜總離子流圖中的碎片離子峰得到碎片離子信息，結(jié)合文獻(xiàn)[3]鑒定其為芳基?；氖罄钐擒疹惢衔铮淇赡艿幕瘜W(xué)結(jié)構(gòu)式見表2、圖4。

圖4 1～11號(hào)峰的化學(xué)結(jié)構(gòu)

表2 LC-MS/MS鑒定化合物1～11

4 討 論

石梓屬植物作為民族藥在國內(nèi)外受到廣泛的關(guān)注研究，前期文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)云南石梓具有良好的抗腫瘤活性。云南石梓的地上部分氯仿提取物對(duì)于MCF7具有明顯的細(xì)胞毒性[11]。SRINIVASA C等[12]利用云南石梓果實(shí)提取物在水介質(zhì)中合成氧化錳納米粒子，其在400 μg/mL濃度下對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞的抑癌率高達(dá)96%。ANGAMUTHU T等[13]發(fā)現(xiàn)云南石梓乙醇提取物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株（COLO 201）、胃癌細(xì)胞株（HT 29）、人食管癌細(xì)胞株（TE-2）具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性。云南石梓的根部水提物對(duì)于阿霉素化療引起的腎毒性有劑量依賴性保護(hù)作用，這可能與其多酚和黃酮類化合物的抗氧化能力有關(guān)[14]。另外，有研究者[15-16]利用云南石梓木部殘?jiān)苽溷y納米粒子，通過自由基清除實(shí)驗(yàn)，確定其具有增強(qiáng)的抗菌、抗菌膜、抗氧化和傷口愈合特性。另外，石梓屬的植物還有抗腹瀉、促進(jìn)創(chuàng)面愈合、抗糖尿病、抗炎和治療失憶等功效[17-20]。本研究發(fā)現(xiàn)其同科同屬植物小葉石梓根乙酸乙酯部位對(duì)于人乳腺癌細(xì)胞（MCF7）、人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞（NCI-H446）及人宮頸癌細(xì)胞（Hela229）具有一定的細(xì)胞毒性。乙酸乙酯部位主要成分鑒定為芳基?；氖罄钐擒疹惢衔铮_定小葉石梓根中的芳基?；氖罄钐擒疹惢衔餅槠淇鼓[瘤的有效成分。結(jié)合二級(jí)質(zhì)譜離子碎片及相關(guān)參考文獻(xiàn)可推測出乙酸乙酯部位1～11號(hào)峰的可能結(jié)構(gòu)，由于無法通過質(zhì)譜準(zhǔn)確鑒定同分異構(gòu)體的取代情況，故只能推測其可能結(jié)構(gòu)為芳基?；氖罄钐擒疹惢衔铮笃诳衫^續(xù)對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行深入的分離鑒定，通過核磁等技術(shù)進(jìn)一步確定其準(zhǔn)確結(jié)構(gòu)。小葉石梓為云南省大理市白族使用的民間藥物，其白族語名稱為“席刮呆”。小葉石梓根在當(dāng)?shù)乇挥糜谥委煁D科腫瘤，并且已經(jīng)流傳多年，具有較好的抗腫瘤療效。小葉石梓作為中國特有的石梓屬小灌木，目前其藥理作用與化學(xué)成分研究較少。我們也將繼續(xù)在這個(gè)方面開展研究工作，以期為民族藥小葉石梓的綜合開發(fā)利用提供理論和實(shí)踐依據(jù)。