• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    鈦合金磨粒流加工表面細胞黏附研究①

    2022-11-06 06:06:30張利應(yīng)榮敏陳國達黃一單曉杭
    高技術(shù)通訊 2022年8期
    關(guān)鍵詞:薄片磨粒鈦合金

    張利 應(yīng)榮敏 陳國達 黃一 單曉杭

    (浙江工業(yè)大學(xué)機械工程學(xué)院 杭州310032)

    0 引言

    隨著年齡增長,骨組織極易損傷且力學(xué)性能退化[1]。對于55 歲以上的人群,骨關(guān)節(jié)病發(fā)病率達到了80%,嚴重會導(dǎo)致關(guān)節(jié)活動能力喪失,生活不能自理。目前,使用醫(yī)用材料進行損傷關(guān)節(jié)替換的人工關(guān)節(jié)置換術(shù)是治愈關(guān)節(jié)疾患終末期的最有效手段。鈦合金具有良好的力學(xué)性能與生物相容性,是現(xiàn)有醫(yī)用內(nèi)植入產(chǎn)品的首選材料[2-3],但鈦合金表面硬度較高、工藝性較差,使其復(fù)雜曲面的表面加工困難,存在加工均勻性差、效率低的問題。

    關(guān)節(jié)置換術(shù)實施后,醫(yī)用材料與活體組織是直接接觸的,因此材料的生物相容性、毒性、耐用性尤為重要,即需確保人工關(guān)節(jié)使用中對人體是安全的[4]。細胞黏附即細胞附著于植入體的過程,是植入體進入人體后所有生物學(xué)行為的第一步,有了良好的黏附基礎(chǔ),細胞隨后的增殖、分化、遷移和凋亡才能正常進行[5]。細胞與底物之間的黏附過程為底物吸附細胞外介質(zhì)中的離子和水,繼而吸附其中的黏附類蛋白,形成蛋白聚集層后,細胞通過離子鍵、范德華力等弱作用力附著在材料表面。植入體的化學(xué)組成,決定了材料的親疏水性,植入體表面形貌的變化又會使其具有不同表面力場、表面電荷及表面能[5-6]。過于粗糙的植入體表面會引起血凝,磨損會產(chǎn)生微小顆粒[7],而過于光滑的表面,與組織接觸易形成炎癥。目前生物材料粗糙度研究范圍為10 nm~10 μm,該尺寸對細胞與生物材料表面的相互作用影響較大。

    本文基于仿型流道磨粒流技術(shù)加工4 組Ti6Al4V 鈦合金薄片表面,并進行體外細胞黏附對比實驗,觀察磨粒流加工后薄片表面的微觀形貌特征,探索適宜MC3T3-E1 細胞黏附的表面粗糙度,對于鈦合金人工關(guān)節(jié)表面處理及其生物相容性的相關(guān)研究具有重要意義。

    1 材料與方法

    1.1 鈦合金薄片處理及檢驗

    1.1.1 加工方法

    仿型流道磨粒流表面加工技術(shù)原理圖如圖1所示[8],利用仿型約束構(gòu)件與鈦合金工件表面共同組成一條厚度均勻的加工約束流道,在泥漿泵的作用下磨粒(SiC)體積分數(shù)在0.1~0.3 之間的軟性磨粒流從流道入射口流入[9-10],根據(jù)流動特性流體進入約束流道后發(fā)展為湍流狀態(tài)并填充滿整個流道[11]。其中磨粒在液相載體作用下做無規(guī)則隨機運動并且不斷沖擊被加工件表面,實現(xiàn)微量微力的微切削作用,從而實現(xiàn)對關(guān)節(jié)復(fù)雜表面的精密加工。

    圖1 覆蓋式磨粒流加工原理圖

    選用Ti6Al4V 的鈦合金圓薄片作為實驗品,厚度為1 mm,直徑為10 mm。將鈦合金分為4 組,每組20 片,表面粗加工使用砂紙拋光至粗糙度Ra約為0.23 μm,精加工分別采用磨粒粒徑為8 μm、10 μm、13 μm 和18 μm,體積分數(shù)為0.1 的軟性磨粒流進行加工,加工時長5 h。

    1.1.2 表面形貌觀察及粗糙度測量

    采用KEYENCE VW-60 動態(tài)分析三維顯示系統(tǒng),對鈦合金拋光前及不同粒徑磨粒流拋光后的表面形貌進行觀察。

    采用Mitutoyo 粗糙度儀測量鈦合金片的表面粗糙度Ra。測量方法是在各個鈦合金片上取5 個點進行測量,結(jié)果取其平均值。

    1.2 細胞黏附實驗與檢測

    1.2.1 材料

    主要儀器:二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo,美國)、倒置顯微鏡(Olympus,日本)、酶標儀(華東電子,中國)、低速臺式離心機(Anke,中國)。

    主要試劑:0.25%胰蛋白酶溶液、DMEM(Dulbecco’s modified eagle’s medium)培養(yǎng)液、胎牛血清,二甲基亞砜(DMSO),磷酸鹽緩沖液(PBS),5 mg/ml噻唑藍(MTT)溶液。

    細胞:MC3T3-E1 小鼠成骨細胞,由國家實驗細胞共享服務(wù)平臺提供。

    1.2.2 細胞復(fù)蘇與傳代

    無菌條件下將MC3T3-E1 細胞從-80 ℃低溫環(huán)境取出,置于37 ℃的水浴中復(fù)溫,不斷搖動,完全融化后,取1 ml 凍存懸液至離心管,1000 r/min 離心5 min,吸除上清液,完成復(fù)蘇。

    復(fù)蘇后加入培養(yǎng)基(DMEM +10%胎牛血清),移至25T 培養(yǎng)瓶中,放入37 ℃、5%的二氧化碳培養(yǎng)箱進行培養(yǎng),于細胞鋪滿培養(yǎng)瓶90%~100%進行傳代。加入PBS 緩沖液,洗去未黏著細胞,重復(fù)2~3 次,吸除PBS 溶液,加入0.25%的胰蛋白酶溶液進行消化,使用倒置顯微鏡對消化情況進行觀察,細胞回縮變圓后,加入適量的培養(yǎng)基停止消化,制成細胞懸液。按1:2 進行傳代培養(yǎng)。中間每2 d 更換一次培養(yǎng)基,每次傳代重復(fù)以上操作,直至第4 代,如圖2 所示,細胞密度增加且伸展?fàn)顩r良好,用于后續(xù)實驗。

    圖2 第四代細胞培養(yǎng)情況

    1.2.3 實驗分組

    對照組1 中未放置鈦合金片,直接在24 孔板內(nèi)接種細胞;對照組2 中既未放置鈦合金也未接種細胞。實驗組將鈦合金薄片使用75%酒精進行清洗,高壓蒸汽消毒晾干后,按精加工磨粒流磨粒粒徑值的不同各取10 片,設(shè)置為實驗組1(8 μm)、實驗組2(10 μm)、實驗組3(13 μm)和實驗組4(18 μm),每片1 個孔。

    1.2.4 細胞黏附

    將細胞懸液加入培養(yǎng)液稀釋至5 ml,血球計數(shù)板測得懸液密度8.4×105個/ml,取100 μl 懸液接種于24 孔板中的樣品表面上(圖3),細胞懸液能夠借助液體自身的張力完全覆蓋于鈦合金片表面之上,置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h 后,吸掉孔板中培養(yǎng)液,用PBS 洗去未黏附細胞,加入DMEM溶液與MTT 溶液,再培養(yǎng)4 h 后取出,吸除培養(yǎng)液,加入DMSO 溶液,于振蕩器振蕩至結(jié)晶完全溶解。每組各取部分溶液移至96 孔板,放入酶標儀中測量光吸收值(OD),并取平均。

    圖3 鈦合金接種細胞懸浮液

    MTT 比色法原理:對于外源性的MTT 溶液,活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能將其還原為一種藍紫色的甲瓚晶體。該晶體不溶于水,并且在細胞中沉積,而已經(jīng)死亡的細胞無法完成該功能,故測定在490 nm 波長的條件下各組的光吸收值,吸光度越大,證明該組活細胞數(shù)目越多,反之亦然。

    1.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析

    使用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 13.0 對細胞黏附實驗得到的各組吸光度進行分析,由于從成骨細胞黏附實驗獲得的是重復(fù)測量數(shù)據(jù),因此使用完全隨機設(shè)計的單向方差分析方法。檢驗水準α=0.05,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    1.2.6 黏附百分比

    為了進一步表現(xiàn)各實驗組以及對照組之間成骨細胞黏附效果的差異,使用細胞黏附百分比進行對比分析,如下式[12]所示。

    式中,Pad為細胞黏附百分比,ODi為第i組實驗的平均吸光度,OD對照1為對照組1 的MTT 實驗吸光度平均值,OD對照2為對照組2 的MTT 實驗吸光度平均值。

    2 結(jié)果

    2.1 鈦合金表面粗糙度

    使用8 μm 粒徑磨粒流加工后薄片粗糙度Ra平均值與方差結(jié)果如表1 所示,由表可知,表面粗糙度Ra平均值范圍為0.05~0.08 μm。同理,測量計算后得到10 μm 粒徑的磨粒流加工得到鈦合金片表面粗糙度Ra平均值范圍為0.08~0.10 μm,13 μm粒徑的磨粒流加工得到鈦合金片表面粗糙度Ra平均值范圍為0.10~0.12 μm,18 μm 粒徑的磨粒流加工得到鈦合金片表面粗糙度Ra平均值范圍為0.12~0.15 μm。結(jié)果如表2 所示。

    表1 8 μm 粒徑磨粒流加工后薄片表面粗糙度Ra

    表2 不同粒徑加工結(jié)果

    2.2 鈦合金表面形貌

    不同磨粒粒徑磨粒流加工鈦合金表面形貌觀察結(jié)果如圖4 所示。圖4(a)為鈦合金片經(jīng)砂紙粗加工后的表面,密集分布有條紋狀溝槽及凹坑,且溝槽的寬度與深度大小不一,整體表面精度低。圖4(b)~(e)為進一步經(jīng)過磨粒流精加工的鈦合金薄片表面圖,由圖可見表面的溝槽結(jié)構(gòu)已沖蝕消失,僅剩部分凹坑與擠出唇離散分布,且磨粒粒徑越小,凹坑與擠出唇尺寸越小、數(shù)量越少。

    圖4 不同磨粒粒徑磨粒流加工鈦合金表面形貌

    2.3 吸光度檢測結(jié)果

    用酶標儀檢測各組黏附結(jié)果,并取平均值,實驗組1~4 吸光度分別為0.098、0.127、0.122、0.118,對照組1 吸光度為0.144,對照組2 吸光度為0.006。由圖5 可知,吸光度隨表面粗糙度的增加呈現(xiàn)先增加再減小的趨勢。

    圖5 各實驗組吸光度與粗糙度對比圖

    統(tǒng)計學(xué)分析:實驗組2、實驗組3 和實驗組4 三組吸光度兩兩之間無顯著差異(P>0.05),而對比實驗組1,吸光度明顯更高(P<0.05)。另外,相較于各個實驗組,對照組1 吸光度更高(P<0.05)。

    2.4 黏附比分析

    圖6為各實驗組的細胞黏附百分比柱狀圖,從中得出黏附百分比最低的是實驗組1,只有71.01%;實驗組3 的細胞黏附百分比為88.41%,實驗組4 為85.51%,兩者實驗結(jié)果相近;實驗組2的細胞黏附百分比達到了92.02%,黏附率最高。

    圖6 鈦合金細胞率柱形圖

    3 討論

    鈦合金具備韌性好、強度高、密度低[13-14]等優(yōu)良性質(zhì),其表面自然生成的TiO2氧化涂層能控制基體離子溶出,增強其抗腐蝕性與生物相容性。傳統(tǒng)的拋光方式如車削、磨削,耗時長[15],并在材料表面形成一定規(guī)則的溝槽分布,且難以保證表面粗糙度的整體均勻性。本研究采用軟性磨粒流約束流道的方法,利用磨粒在約束流道內(nèi)的湍流壁面效應(yīng)實現(xiàn)拋光加工,所用磨粒粒徑范圍為8~18 μm,加工得到的鈦合金薄片表面粗糙度Ra整體范圍在0.05~0.15 μm 之間,使用磨粒粒徑越小,加工所得表面粗糙度Ra值越小。從圖4 中觀察可得,加工后的鈦合金表面形貌未呈現(xiàn)出規(guī)律性,這是軟性磨粒流加工無序性特征的結(jié)果,可能會對細胞在其表面的黏附、鋪展起到較好的接觸引導(dǎo)效果,同時表面的微坑與擠出唇增大了材料的表面積,可為細胞提供更多的黏附區(qū)域。

    醫(yī)用材料表面性質(zhì)的變化對生物相容性的影響是人工關(guān)節(jié)領(lǐng)域的研究熱點,表面性質(zhì)中產(chǎn)生影響作用最大的就是微觀幾何和表面粗糙度[7]。已有研究表明,細胞中存在細胞黏附分子——整聯(lián)蛋白,細胞外環(huán)境可通過其調(diào)控細胞內(nèi)活性,蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域與其特異性的配體相互作用,可產(chǎn)生多種信號,對細胞黏附、生長、遷移等行為產(chǎn)生影響[16]。本研究采用體外實驗的方法,觀察在磨粒流處理后不同粗糙度Ra的鈦合金薄片表面上MC3T3-E1 細胞的黏附差異。研究發(fā)現(xiàn)Ra于0.05~0.08 μm 內(nèi)的薄片表面細胞黏附效果最差,說明過于光滑的表面,附著點少,不利于細胞黏附。對照組1 中,成骨細胞直接黏附于24 孔板的內(nèi)壁上,吸光值明顯高于鈦合金實驗組,說明鈦合金薄片對成骨細胞的黏附存在抑制作用。此外,實驗組2 薄片黏附率最高,為92%,因此認為磨粒流加工后得到Ra為0.08~0.10 μm的表面最有利于細胞黏附,而較粗糙和較光滑的表面均會在一定程度上影響成骨細胞的黏附效果。

    目前,眾多學(xué)者就表面粗糙度對細胞黏附的影響進行了研究。Deligianni 等人[17]利用3 種規(guī)格粗碳化硅砂紙?zhí)幚礅伜辖鸨砻?發(fā)現(xiàn)Ra為0.3 μm 表面細胞黏附量最少,粗糙度越高對細胞黏附行為越有利,與本研究結(jié)果差別較大。Huang 等人[18]利用拋光粉及砂紙?zhí)幚沓龃植诙萊a在50 nm~1.2 μm的5 種鈦金屬表面,結(jié)果顯示金屬表面的溝槽對細胞黏附有接觸引導(dǎo)現(xiàn)象,且相對于較粗糙或較光滑的樣品,Ra為150 nm 的表面表現(xiàn)出了最佳的細胞黏附性能,與本研究結(jié)果較為一致。

    細胞黏附的影響因素眾多,即使表面粗糙度Ra相同,材料不同或加工方法不同都會導(dǎo)致細胞反應(yīng)的差異[19],因此,為探索不同加工方法的細胞黏附差異性,需就各自處理得到的最佳黏附表面的黏附效果進行對比分析。趙昕[20]對Ra為0.3 μm~1.8 μm的砂紙拋光后鈦合金表面對MC3T3-E1 細胞黏附的影響機制進行了分析,發(fā)現(xiàn)粗糙度Ra介于0.9~1.0 μm 之間的表面得到了80%的最佳黏附率,相較之下,磨粒流加工后的最佳黏附率達到了92%,說明磨粒流技術(shù)加工出的表面形貌比砂紙拋光更適宜于MC3T3-E1 細胞黏附。

    4 結(jié)論

    本研究探索了磨粒流加工得到的Ti6Al4V 鈦合金表面的微觀形貌及表面粗糙度Ra對MC3T3-E1細胞黏附的影響,得到如下結(jié)論。

    (1)通過觀察磨粒流加工后的鈦合金薄片表面形貌,發(fā)現(xiàn)其表面離散分布有微坑與擠出唇,均勻性較好,證實了磨粒流加工的優(yōu)異性。

    (2)通過對比對照組1 與鈦合金實驗組,發(fā)現(xiàn)實驗組吸光值低,說明放置了鈦合金后,反而對細胞的黏附起到了抑制作用。

    (3)通過各個實驗組之間的吸光值對比分析可得,粗糙度Ra為0.05~0.08 μm 實驗組1 吸光值顯著低于其他組,說明過于光滑的表面并不利于細胞黏附。

    (4)從黏附率的計算結(jié)果來看,實驗組2 黏附率最高,達到了92%,說明磨粒流處理后的鈦合金表面最適宜細胞黏附的粗糙度Ra閾值為0.08~0.10 μm,這一結(jié)果為磨粒流加工技術(shù)及鈦合金表面生物相容性的進一步研究提供了參考。

    猜你喜歡
    薄片磨粒鈦合金
    基于凸多面體碰撞檢測的虛擬砂輪建模研究
    來自森林的植物薄片
    超精密表面研拋磨粒的研究進展
    硅酸鹽通報(2021年3期)2021-04-18 11:01:42
    單個鐵氧體磨粒尺寸檢測電磁仿真
    “神的金屬”鈦合金SHINE YOUR LIFE
    中國自行車(2018年8期)2018-09-26 06:53:32
    你真好
    你真好
    鈦合金板鍛造的工藝實踐
    四川冶金(2017年6期)2017-09-21 00:52:30
    微晶剛玉磨粒磨削20CrMnTi鋼的數(shù)值模擬研究
    醫(yī)用鈦合金的研究與應(yīng)用
    乱码一卡2卡4卡精品| 日本免费一区二区三区高清不卡| 无人区码免费观看不卡| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲精品国产成人久久av| www.色视频.com| 无遮挡黄片免费观看| 悠悠久久av| av女优亚洲男人天堂| 欧美精品国产亚洲| 国产精品综合久久久久久久免费| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 欧美成人一区二区免费高清观看| 欧美激情国产日韩精品一区| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 免费av观看视频| 欧美激情国产日韩精品一区| 99精品在免费线老司机午夜| 日本与韩国留学比较| 日韩中文字幕欧美一区二区| 88av欧美| 三级国产精品欧美在线观看| 嫩草影视91久久| 国产一区二区在线观看日韩| 精品乱码久久久久久99久播| 欧美一区二区国产精品久久精品| 久久久久久久久久黄片| 国产男人的电影天堂91| 极品教师在线免费播放| 91久久精品国产一区二区成人| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 亚洲av免费在线观看| 他把我摸到了高潮在线观看| 国产 一区精品| 22中文网久久字幕| 性插视频无遮挡在线免费观看| 欧美黑人欧美精品刺激| 成人av在线播放网站| 乱人视频在线观看| 亚洲性夜色夜夜综合| 91麻豆精品激情在线观看国产| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 成人二区视频| 成人av在线播放网站| 亚洲人与动物交配视频| 国产视频内射| 欧美丝袜亚洲另类 | 久久久久久久亚洲中文字幕| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 中文资源天堂在线| 真实男女啪啪啪动态图| 国产 一区 欧美 日韩| 乱码一卡2卡4卡精品| 成人欧美大片| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 日韩欧美 国产精品| 免费高清视频大片| www.www免费av| 亚洲图色成人| 欧美三级亚洲精品| 天堂√8在线中文| 国内精品宾馆在线| 中文字幕av在线有码专区| av福利片在线观看| 身体一侧抽搐| 深夜a级毛片| 99久久精品热视频| 日韩强制内射视频| 成人无遮挡网站| 午夜精品在线福利| 女人被狂操c到高潮| 日本三级黄在线观看| 日韩欧美在线二视频| 欧美国产日韩亚洲一区| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产熟女欧美一区二区| 深夜a级毛片| www.色视频.com| 亚洲av成人av| 亚洲黑人精品在线| 99热6这里只有精品| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 国产精品野战在线观看| 欧美日韩综合久久久久久 | 欧美日韩乱码在线| 精品久久久久久成人av| 网址你懂的国产日韩在线| 国产精品av视频在线免费观看| 午夜福利在线观看吧| 少妇高潮的动态图| 麻豆久久精品国产亚洲av| 美女黄网站色视频| 在线免费观看不下载黄p国产 | 欧美在线一区亚洲| 男女那种视频在线观看| 最好的美女福利视频网| 亚洲国产精品成人综合色| 别揉我奶头 嗯啊视频| 又紧又爽又黄一区二区| 国产一区二区在线av高清观看| 日韩亚洲欧美综合| 亚洲性久久影院| 国产真实伦视频高清在线观看 | 国内精品美女久久久久久| 九色成人免费人妻av| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 在线国产一区二区在线| 亚洲精品成人久久久久久| 亚洲国产精品成人综合色| 人妻久久中文字幕网| 看十八女毛片水多多多| 精品午夜福利在线看| 午夜爱爱视频在线播放| 国产精品99久久久久久久久| 一进一出好大好爽视频| 精品人妻熟女av久视频| 少妇熟女aⅴ在线视频| 国产伦精品一区二区三区视频9| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲国产精品合色在线| 一进一出好大好爽视频| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产伦一二天堂av在线观看| 国产精品久久久久久精品电影| 亚洲最大成人手机在线| 午夜日韩欧美国产| avwww免费| a在线观看视频网站| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 日韩一本色道免费dvd| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 国产亚洲欧美98| 成人国产综合亚洲| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 免费在线观看成人毛片| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 亚洲黑人精品在线| 美女被艹到高潮喷水动态| 国产乱人视频| 91久久精品国产一区二区成人| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产精品福利在线免费观看| 最后的刺客免费高清国语| 成人美女网站在线观看视频| 亚洲乱码一区二区免费版| 亚洲av熟女| 中文在线观看免费www的网站| 两个人的视频大全免费| а√天堂www在线а√下载| 亚洲第一电影网av| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 亚洲国产高清在线一区二区三| 日本 av在线| 五月玫瑰六月丁香| 日韩人妻高清精品专区| 欧美日本亚洲视频在线播放| 精品午夜福利在线看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 99久久成人亚洲精品观看| 免费av不卡在线播放| 亚洲av.av天堂| a在线观看视频网站| 99久久成人亚洲精品观看| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 亚洲国产精品sss在线观看| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 欧美xxxx性猛交bbbb| 免费大片18禁| 91精品国产九色| 亚洲国产精品合色在线| 久久久成人免费电影| 最后的刺客免费高清国语| 精品久久久久久久久久久久久| 免费av不卡在线播放| 国产精品一及| 午夜精品在线福利| 国产在线男女| 99国产极品粉嫩在线观看| 偷拍熟女少妇极品色| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 草草在线视频免费看| 成人午夜高清在线视频| xxxwww97欧美| 国产在线男女| 久久精品人妻少妇| 波多野结衣高清作品| 国产精品女同一区二区软件 | 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 国产精品国产高清国产av| 少妇人妻一区二区三区视频| 欧美黑人欧美精品刺激| 极品教师在线免费播放| 日韩 亚洲 欧美在线| 黄色欧美视频在线观看| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 十八禁国产超污无遮挡网站| 99久久九九国产精品国产免费| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 国产私拍福利视频在线观看| 99国产精品一区二区蜜桃av| 女人被狂操c到高潮| 免费av观看视频| 无遮挡黄片免费观看| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产精品电影一区二区三区| 91麻豆精品激情在线观看国产| aaaaa片日本免费| 九九在线视频观看精品| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 在线播放无遮挡| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 国产美女午夜福利| av天堂中文字幕网| 制服丝袜大香蕉在线| 亚洲国产精品久久男人天堂| 欧美日本亚洲视频在线播放| 简卡轻食公司| 国产精品亚洲一级av第二区| 亚洲av第一区精品v没综合| 成人美女网站在线观看视频| 国产免费av片在线观看野外av| 51国产日韩欧美| 又紧又爽又黄一区二区| 国产高清有码在线观看视频| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 午夜福利欧美成人| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲国产高清在线一区二区三| 男女之事视频高清在线观看| 国产欧美日韩精品一区二区| 久久中文看片网| 成人鲁丝片一二三区免费| 亚洲第一区二区三区不卡| 日本a在线网址| 免费观看精品视频网站| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 国产成人av教育| 在线观看66精品国产| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 国产精品久久久久久精品电影| 麻豆av噜噜一区二区三区| 亚洲中文字幕日韩| 天天躁日日操中文字幕| 日本熟妇午夜| 极品教师在线免费播放| 成人精品一区二区免费| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 欧美中文日本在线观看视频| 日韩精品青青久久久久久| 亚洲欧美清纯卡通| 小说图片视频综合网站| 亚洲国产精品成人综合色| 亚洲经典国产精华液单| av在线天堂中文字幕| 级片在线观看| 久久这里只有精品中国| 中出人妻视频一区二区| 午夜福利在线在线| 乱系列少妇在线播放| 在线a可以看的网站| 一个人免费在线观看电影| av专区在线播放| 99久久精品热视频| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 97碰自拍视频| 99在线视频只有这里精品首页| 网址你懂的国产日韩在线| 18禁在线播放成人免费| netflix在线观看网站| 亚洲精品色激情综合| 校园春色视频在线观看| 美女免费视频网站| 美女高潮的动态| 成人av一区二区三区在线看| 久久午夜亚洲精品久久| 99视频精品全部免费 在线| 岛国在线免费视频观看| 人人妻人人看人人澡| 97超视频在线观看视频| 精品久久久久久久久久久久久| 91av网一区二区| 99热6这里只有精品| av在线蜜桃| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 搡老熟女国产l中国老女人| 变态另类丝袜制服| 国产色婷婷99| 日本精品一区二区三区蜜桃| 中文在线观看免费www的网站| 色噜噜av男人的天堂激情| 两人在一起打扑克的视频| 麻豆久久精品国产亚洲av| 最后的刺客免费高清国语| 成人国产综合亚洲| 欧美zozozo另类| 中国美白少妇内射xxxbb| 变态另类丝袜制服| 窝窝影院91人妻| 88av欧美| 欧美一级a爱片免费观看看| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 久久草成人影院| av在线观看视频网站免费| av女优亚洲男人天堂| 亚洲电影在线观看av| 一个人观看的视频www高清免费观看| 欧美人与善性xxx| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 免费观看精品视频网站| 国产av不卡久久| 日韩欧美在线二视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 久久久久久久精品吃奶| 亚洲精品456在线播放app | АⅤ资源中文在线天堂| 男人的好看免费观看在线视频| 午夜久久久久精精品| 日韩欧美 国产精品| 露出奶头的视频| 国产精品久久久久久久久免| 午夜日韩欧美国产| 久久精品国产鲁丝片午夜精品 | 五月伊人婷婷丁香| 久久国内精品自在自线图片| 真人做人爱边吃奶动态| 午夜福利在线在线| 色播亚洲综合网| 国产探花在线观看一区二区| 男女啪啪激烈高潮av片| av视频在线观看入口| 又爽又黄无遮挡网站| 欧美高清成人免费视频www| av在线观看视频网站免费| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 波多野结衣巨乳人妻| 亚洲自拍偷在线| 欧美性猛交黑人性爽| 欧美zozozo另类| 国产69精品久久久久777片| 尾随美女入室| 草草在线视频免费看| 国模一区二区三区四区视频| 最近最新中文字幕大全电影3| 亚洲 国产 在线| av在线天堂中文字幕| 高清在线国产一区| 日韩一本色道免费dvd| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 悠悠久久av| 久久久久久久精品吃奶| 少妇的逼水好多| 国产精品一及| 一级av片app| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 久久6这里有精品| 真人做人爱边吃奶动态| 99久久中文字幕三级久久日本| 91精品国产九色| 日本免费一区二区三区高清不卡| 久久久久久久精品吃奶| 久久久久久久亚洲中文字幕| 欧美一区二区精品小视频在线| 中文字幕熟女人妻在线| 国产一区二区激情短视频| 中文在线观看免费www的网站| 欧美bdsm另类| 久久久久性生活片| 日本-黄色视频高清免费观看| 亚洲精华国产精华精| 亚洲欧美日韩东京热| 九九热线精品视视频播放| 99热这里只有是精品50| 婷婷六月久久综合丁香| 亚洲av不卡在线观看| 村上凉子中文字幕在线| 亚洲成人久久爱视频| 国产精品久久久久久久电影| 久久6这里有精品| 欧美日本视频| АⅤ资源中文在线天堂| 亚洲天堂国产精品一区在线| 色噜噜av男人的天堂激情| 久久久久性生活片| 久久香蕉精品热| 综合色av麻豆| 内地一区二区视频在线| 成人国产一区最新在线观看| 欧美一区二区亚洲| 又爽又黄a免费视频| 一区二区三区激情视频| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 国产单亲对白刺激| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 18禁在线播放成人免费| 99热这里只有精品一区| 国产精品99久久久久久久久| 国产伦精品一区二区三区视频9| 免费人成视频x8x8入口观看| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 又紧又爽又黄一区二区| 欧美日韩乱码在线| 欧美日韩国产亚洲二区| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 中文字幕免费在线视频6| 国产高清激情床上av| 精品久久久久久久久久久久久| 97超视频在线观看视频| 99久久成人亚洲精品观看| 久久精品国产清高在天天线| 日韩大尺度精品在线看网址| 亚洲无线在线观看| 国产精品99久久久久久久久| 天天躁日日操中文字幕| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 久久午夜亚洲精品久久| 久久久午夜欧美精品| 日本黄色片子视频| 久久亚洲精品不卡| 天堂网av新在线| 色哟哟·www| 亚洲午夜理论影院| 岛国在线免费视频观看| 中文亚洲av片在线观看爽| 男人和女人高潮做爰伦理| 久久精品人妻少妇| 特大巨黑吊av在线直播| 国产精品,欧美在线| 国产精品电影一区二区三区| 免费大片18禁| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 午夜免费激情av| 人妻夜夜爽99麻豆av| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 色在线成人网| 国产久久久一区二区三区| 97超视频在线观看视频| 色综合婷婷激情| 在线观看美女被高潮喷水网站| 白带黄色成豆腐渣| 国产精华一区二区三区| 久久精品人妻少妇| 色av中文字幕| 精品午夜福利在线看| 人人妻人人看人人澡| 超碰av人人做人人爽久久| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 毛片女人毛片| 国产男靠女视频免费网站| 成人亚洲精品av一区二区| 日日撸夜夜添| 中文字幕av在线有码专区| 69人妻影院| 国产高清不卡午夜福利| 可以在线观看的亚洲视频| 免费看a级黄色片| 免费黄网站久久成人精品| а√天堂www在线а√下载| 国产毛片a区久久久久| 午夜免费激情av| 久久精品人妻少妇| 校园春色视频在线观看| 免费高清视频大片| 特级一级黄色大片| 亚洲精品久久国产高清桃花| 欧美一区二区精品小视频在线| 美女高潮的动态| 黄色女人牲交| 窝窝影院91人妻| 观看美女的网站| 亚洲专区国产一区二区| 一进一出抽搐动态| 日韩中字成人| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 男女边吃奶边做爰视频| 日韩国内少妇激情av| 国产成人影院久久av| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产精品伦人一区二区| 亚州av有码| 国产亚洲精品av在线| 丝袜美腿在线中文| 一区二区三区高清视频在线| 一级av片app| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 亚洲av第一区精品v没综合| 国产精品久久久久久久电影| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 色噜噜av男人的天堂激情| 天堂网av新在线| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 日本熟妇午夜| 日韩av在线大香蕉| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 97人妻精品一区二区三区麻豆| 99热6这里只有精品| 波多野结衣高清无吗| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 在线观看66精品国产| 日韩av在线大香蕉| 看免费成人av毛片| 嫩草影院精品99| a级一级毛片免费在线观看| 变态另类丝袜制服| 免费在线观看日本一区| 国产成年人精品一区二区| 国产 一区 欧美 日韩| 高清日韩中文字幕在线| 国产在视频线在精品| 国产精品久久久久久精品电影| 内地一区二区视频在线| 国产主播在线观看一区二区| 如何舔出高潮| 日本色播在线视频| 麻豆av噜噜一区二区三区| 深夜a级毛片| 91精品国产九色| 精品久久久久久久久亚洲 | 欧美黑人欧美精品刺激| 伦精品一区二区三区| 国产精华一区二区三区| 亚洲国产精品sss在线观看| 国产精品一区二区免费欧美| 观看美女的网站| 欧美日韩黄片免| 成人鲁丝片一二三区免费| 99热只有精品国产| 国产精品亚洲美女久久久| 日本一二三区视频观看| 午夜影院日韩av| 国产综合懂色| 制服丝袜大香蕉在线| 国产一区二区三区视频了| 女人被狂操c到高潮| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产精品乱码一区二三区的特点| 精品一区二区三区视频在线| 黄片wwwwww| 国产av麻豆久久久久久久| 一个人观看的视频www高清免费观看| 久久久久久九九精品二区国产| 免费黄网站久久成人精品| 欧美一区二区国产精品久久精品| 欧美最新免费一区二区三区| xxxwww97欧美| 久久久久久久久久黄片| 国产精品乱码一区二三区的特点| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 制服丝袜大香蕉在线| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 亚洲精华国产精华精| 一区二区三区激情视频| 国产真实乱freesex| 日韩精品青青久久久久久| 国产视频内射| 亚洲精品成人久久久久久| 欧美极品一区二区三区四区| 亚洲美女视频黄频| 国产精品久久电影中文字幕| 免费av毛片视频| 男女那种视频在线观看| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 亚洲性久久影院| 毛片一级片免费看久久久久 | 国产精品一区二区三区四区久久| 国产探花在线观看一区二区| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产免费男女视频| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲专区国产一区二区| 一本一本综合久久| 欧美又色又爽又黄视频| 中出人妻视频一区二区| 久久久久久伊人网av| 亚洲天堂国产精品一区在线| 少妇的逼好多水| 国产成人一区二区在线| 亚洲国产精品成人综合色| av.在线天堂| 久久精品国产亚洲网站| 最新中文字幕久久久久| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 色视频www国产| 色噜噜av男人的天堂激情| 久久久久精品国产欧美久久久| 深夜精品福利| a级一级毛片免费在线观看| 制服丝袜大香蕉在线| 又紧又爽又黄一区二区| 18禁黄网站禁片午夜丰满| www日本黄色视频网| 九色国产91popny在线| 有码 亚洲区| 国内精品一区二区在线观看| 成人无遮挡网站| 久久欧美精品欧美久久欧美| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 日韩欧美在线二视频| 欧美精品国产亚洲| 欧美人与善性xxx| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 人妻夜夜爽99麻豆av| 久久99热6这里只有精品| 草草在线视频免费看| 免费黄网站久久成人精品| 久久精品国产清高在天天线|