基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)探討玉屏風(fēng)散治療慢性蕁麻疹的作用機制

申倩 ，李俊辰 ，熊萬濤 ，郭晨琪 ，張宇

（1.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100053；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；3.天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，天津 300120）

蕁麻疹是由于皮膚、黏膜小血管擴張及滲透性增加出現(xiàn)的一種局限性水腫反應(yīng)，臨床上表現(xiàn)為大小不等的風(fēng)團并伴有瘙癢[1]。中醫(yī)稱蕁麻疹為“風(fēng)疹”、“癮疹”和“白疹”[2]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為蕁麻疹的病機多是由于先天稟賦不足，表虛不固，外邪侵襲，客于肌表，致使?fàn)I衛(wèi)失調(diào)而發(fā)[3]。慢性蕁麻疹（CU）是指風(fēng)團每天發(fā)生或者間歇發(fā)作，持續(xù)時間超過6周[4]。目前，西醫(yī)治療CU主要通過聯(lián)合用藥的方式，但長期大量用藥給患者帶來了很多的不良反應(yīng)，中醫(yī)藥雖然在治療CU有較好的臨床效果，但由于具體的作用機制不明確，使其臨床應(yīng)用受限[5]。

玉屏風(fēng)散源自《究原方》，錄自《醫(yī)方類聚》，方名玉屏風(fēng)，謂其功用似御風(fēng)之屏障，有貴重如玉之意[6]。方由防風(fēng)、黃芪、白術(shù)三藥組成，其中黃芪甘溫，內(nèi)補脾肺之氣，外可固表止汗；白術(shù)益氣健脾，協(xié)黃芪以益氣固表實衛(wèi)；黃芪得防風(fēng)固表而不留邪，三藥共奏益氣固表之功?，F(xiàn)代研究表明，玉屏風(fēng)散能夠通過增強機體免疫力、抗氧化、調(diào)節(jié)激素水平來治療皮膚病[7]。同時也有系統(tǒng)評價表明，玉屏風(fēng)散對CU有很好的治療效果[8]。

在2007年Hopkins等[9]首次提出了“網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)”這一概念，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門運用網(wǎng)絡(luò)方法分析藥物與疾病和靶點之間“多成分、多靶點、多途徑”協(xié)同作用關(guān)系的學(xué)科。中藥有成分多、作用靶點多和作用途徑復(fù)雜等特點，導(dǎo)致中藥相關(guān)研究受限。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以揭示中藥與疾病靶點間的相互關(guān)系，從而闡釋中藥治療疾病的作用機制，為作用機制的研究指明方向[10]。

1 資料與方法

1.1 篩選玉屏風(fēng)散的化合物和靶點 在TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php）數(shù)據(jù)庫中分別檢索白術(shù)、防風(fēng)、黃芪，得到每味中藥的化學(xué)成分。根據(jù)口服利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18的屬性值對檢索到的所有化學(xué)成分進行篩選，收集到玉屏風(fēng)散的化合物。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫查化合物的作用靶點，根據(jù)已發(fā)表的文獻對藥物靶點進行補充。在Uniprot數(shù)據(jù)庫中，將已知藥物靶點蛋白轉(zhuǎn)化為靶基因。

1.2 篩選疾病的疾病靶點 在GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索關(guān)鍵詞“Chronic urticaria”，獲取疾病靶點。在 Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM）、PharmGkb 以及 Therapeutic Target Database（TTD）數(shù)據(jù)庫中檢索上述關(guān)鍵詞，把獲取的疾病靶點補充到在GeneCards數(shù)據(jù)庫中得到的靶點中，在Excel表中進行去重，得到最終的疾病靶點庫。使用Uniprot數(shù)據(jù)庫將最終得到的基因靶點轉(zhuǎn)化為靶基因。

1.3 疾病-化合物共同靶點的篩選 利用VennPainter軟件，將玉屏風(fēng)散化合物的作用靶點與疾病靶點取交集，篩選出二者共同的作用靶點。

1.4 藥物-共同靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將玉屏風(fēng)散中化合物、疾病以及二者的共同靶點蛋白上傳至Cytoscape軟件（http：//www.cytoscape.org/）生成體現(xiàn)藥物-共同靶點-疾病相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）的構(gòu)建 利用String（https：//string-db.org/）蛋白互作數(shù)據(jù)庫和Cytoscape軟件分析共同靶點蛋白之間的相互作用，選擇高相關(guān)性，并用R語言進行計數(shù)分析。

1.6 GO功能富集分析 利用Cytoscape軟件對共同靶點蛋白進行GO功能富集分析，以了解共同靶點蛋白在基因功能中的作用，通過Omicshare軟件（http：//www.omicshare.com/tools/index，php/）對結(jié)果進行可視化處理。

1.7 KEGG通路富集分析 利用 David（https：//david.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫和Cytoscape軟件將共同靶點進行KEGG通路富集分析，對共同靶點蛋白在信號通路中的作用做注釋分析，得到玉屏風(fēng)散治療CU的信號通路，通過Omicshare軟件對結(jié)果進行可視化處理。

1.8 分子對接 選取“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)中度值排名前5的靶點，并反向?qū)ふ疫@些靶點對應(yīng)的化合物，在 PDB 數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）下載網(wǎng)絡(luò)圖中的核心靶點的結(jié)構(gòu)，在PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/） 和 TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php）數(shù)據(jù)庫下載主要化合物結(jié)構(gòu)，使用AutoDock軟件將主要化合物與主要靶點進行分子對接，并用PyMol軟件將結(jié)果可視化。

2 結(jié)果

2.1 玉屏風(fēng)散化合物及作用靶點的篩選 利用TCMSP分別查找玉屏風(fēng)散中3味中藥的化合物及作用靶點，以“OB≥30%，DL≥0.18”為條件經(jīng)過整理發(fā)現(xiàn)，玉屏風(fēng)散活性化合物共有44種，其中白術(shù)7種、防風(fēng)18種、黃芪20種（其中黃芪與白術(shù)有共有化合物），見表1。查找玉屏風(fēng)散中化合物的靶點，經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫基因注釋后，篩選得到102個靶點。

表1 玉屏風(fēng)散中化合物的基本信息

2.2 疾病靶點及藥物-疾病共同靶點的確定 利用OMIM、GeneCard、PharmGkb以及TTD疾病數(shù)據(jù)庫經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫基因注釋后，去除重復(fù)靶點，共篩選出960個疾病靶點。與102個化合物的靶點映射，利用VennPainter軟件，分析得出玉屏風(fēng)散與銀屑病的共同靶點有35個，見圖1。

圖1 藥物疾病共同靶點Venn圖

2.3 “藥物-共同靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)”的構(gòu)建與分析利用Cytoscape繪制的玉屏風(fēng)散治療CU的“藥物-共同靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。該網(wǎng)絡(luò)圖中共包括63個節(jié)點，其中疾病節(jié)點1個（紅色），方劑節(jié)點1個（橙色），中藥節(jié)點3個（黃色），靶點基因節(jié)點35個（藍(lán)色），活性成分節(jié)點23個（綠色），其中包括白術(shù)1個，防風(fēng)11個，黃芪11個。通過分析發(fā)現(xiàn)玉屏風(fēng)散中最主要的前3種活性成分為槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇。分析靶點節(jié)點度值較高的前3個靶基因為前列腺素內(nèi)過氧化物合酶1（PTGS1）、毒蕈堿型膽堿受體M1（CHRM1）、乙酰膽堿酯酶（ACHE），提示這些基因可能是玉屏風(fēng)散治療CU的核心靶點。

圖2 藥物-共同靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)

2.4 PPI的構(gòu)建與分析 利用String蛋白互作數(shù)據(jù)庫和R語言分析共同靶點蛋白之間的相互關(guān)系，見圖3。對PPI中每個蛋白之間的相互關(guān)系進行計數(shù)，見圖4，相互關(guān)系最多的蛋白前3位分別為白細(xì)胞介素-6（IL-6）、血管內(nèi)皮生長因子 A（VEGF-A）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（Caspase-3）。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 PPI核心蛋白柱狀圖（前30）

2.5 GO功能富集分析 對玉屏風(fēng)散與CU的共同靶點進行GO功能富集分析，以錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)，確認(rèn)了395條結(jié)果，利用Omicshare軟件對結(jié)果進行可視化處理，展示前20個共同的基因功能，見圖5，分別是對抗生素的反應(yīng)、細(xì)胞對異物的反應(yīng)、對金屬離子的反應(yīng)、G蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體信號通路、對糖皮質(zhì)激素的反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)、對細(xì)菌源分子的反應(yīng)。對皮質(zhì)類固醇的反應(yīng)、對缺氧的反應(yīng)、對氧水平降低的反應(yīng)、乙酰膽堿受體信號通路、對氧水平的反應(yīng)、對乙酰膽堿的反應(yīng)、細(xì)胞對乙酰膽堿的反應(yīng)、對異型生物質(zhì)的反應(yīng)、對鐵離子的反應(yīng)、細(xì)胞對藥物的反應(yīng)、G蛋白偶聯(lián)血清素受體信號通路、外源性凋亡信號通路、突觸后信號傳導(dǎo)。

圖5 GO富集分析

2.6 KEGG通路富集分析 對玉屏風(fēng)散和CU的共同靶點利用DAVID數(shù)據(jù)庫進行KEGG通路富集分析，以 P＜0.01，F(xiàn)DR＜0.05進行篩選，并將結(jié)果利用Omicshare軟件可視化。共涉及95條信號通路，展示前20個信號通路，見圖6，主要包括前列腺腫瘤、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、在糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終產(chǎn)物及其受體（AGE-RAGE）信號通路、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）信號通路、抗藥性、p53信號通路、在腫瘤中的蛋白多糖、人巨細(xì)胞病毒感染、在腫瘤中的MicroRNA、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、突觸膽堿能、胰腺癌、膀胱癌、表皮生長因子受體（EGFR）酪氨酸激酶抑制劑耐藥、細(xì)胞凋亡、結(jié)腸癌、EB病毒感染、麻疹病毒、流體剪切損傷和動脈粥樣硬化通路、丙型肝炎。

圖6 KEGG通路富集分析

2.7 分子對接分析 在“藥物-共同靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點數(shù)前 3位的靶點為 PTGS1、CHRM1、ACHE，反向找出調(diào)控其的活性成分，計算各個靶點與其對應(yīng)化合物的結(jié)合能，見表2。從表中可以看出結(jié)合能均小于0，說明靶點與化合物都能結(jié)合，并且結(jié)合能越小，對接效果越好。根據(jù)對接結(jié)果做出熱圖，其中藍(lán)色越淺，表明結(jié)合效果越好，見圖7。取每個靶點結(jié)合最好的化合物進行分子對接，并將對接部位與氫鍵直接相連的氨基酸進行標(biāo)記，見圖8。

圖7 對接結(jié)果熱圖分析

圖8 對接結(jié)果模式圖

表2 關(guān)鍵靶點與其對應(yīng)化合物的對接情況

3 討論

CU是一種肥大細(xì)胞介導(dǎo)的疾病，其特征是蕁麻疹或血管性水腫的復(fù)發(fā)，臨床上將其分為慢性自發(fā)性蕁麻疹和慢性誘導(dǎo)性蕁麻疹兩類[11]。目前，CU的發(fā)病機制尚不明確，普遍認(rèn)為是皮膚肥大細(xì)胞激活后釋放組胺和其他促炎介質(zhì)，這也是造成CU皮損血管擴張的原因，自身抗體如抗IgE抗體、抗高親和力IgE Fc受體抗體也是蕁麻疹重要的發(fā)病機制，但是該機制并不適用于所有蕁麻疹患者[12-13]。

目前，關(guān)于玉屏風(fēng)散治療CU已有大量的臨床療效觀察研究。符娟等[14]發(fā)現(xiàn)左西替利嗪聯(lián)合玉屏風(fēng)散加味治療CU，臨床療效顯著，能夠有效減少不良反應(yīng)且降低短期復(fù)發(fā)率。將玉屏風(fēng)散合桂枝湯加味配合腹針能有效改善CU患者的免疫功能，從而提高治療效果，并降低復(fù)發(fā)率及改善生活質(zhì)量[15]。但是目前對于玉屏風(fēng)散治療CU的作用機制的研究較少，導(dǎo)致相關(guān)機制尚不明確。

根據(jù)“藥物-共同靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)”網(wǎng)絡(luò)圖顯示，槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇是玉屏風(fēng)散治療CU的關(guān)鍵化合物。槲皮素有清除自由基和抗過敏的作用，其特征在于刺激免疫系統(tǒng)，抗病毒活性，抑制組胺釋放，促炎性細(xì)胞因子減少，白三烯生成并抑制IL-4產(chǎn)生，其可以改善輔助性T細(xì)胞1（Th1）/Th2平衡，并抑制抗原特異性IgE抗體的形成[17-18]。因此，槲皮素可以通過增強機體免疫力和改善過敏反應(yīng)達到治療CU的目的。目前，山奈酚治療CU的機制尚不明確，有研究表明山奈酚作為角菊葉乙醇提取物的成分之一，能顯著抑制IL-6、IL-1和前列腺素（PG）E2的生成，而角菊葉乙醇提取物整體能夠通過抑制細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶磷酸化而發(fā)揮抗炎作用[19]。山奈酚能夠降低CD3+T細(xì)胞浸潤和主要促炎細(xì)胞因子包括IL-6、IL-17A和TNF-α的表達，同時也承擔(dān)監(jiān)管皮膚上的促炎核轉(zhuǎn)錄因子信號[20]，但具體的機制還需要進一步明確。β-谷甾醇能夠使皮膚產(chǎn)生抗炎作用，減少TNF、IL-1β和IL-6的釋放，但治療CU的機制不明確[21-22]。

分析靶點節(jié)點度值較高的前3個靶基因為PTGS1、CHRM1、ACHE。PTGS也稱環(huán)氧化酶（COX），其分為 PTGS1和 PTGS2，即 COX-1和 COX-2，能夠催化花生四烯酸的PG生物合成[23]。PTGS1屬于結(jié)構(gòu)酶，主要在正常的組織和細(xì)胞中表達[24]。PTGS1催化產(chǎn)生的PGE2能夠通過前列腺素E受體3（EP3）受體激活肥大細(xì)胞誘導(dǎo)急性炎性反應(yīng)，同時也能通過Th1分化、Th17增殖和Th22通過EP2和EP4受體產(chǎn)生IL-22來誘導(dǎo)慢性炎性反應(yīng)和各種自身免疫性疾病[25]。與CHRM1相關(guān)的疾病主要包括腫瘤、阿爾茨海默病和精神分裂癥，CHRM1對于皮膚病的作用研究還比較少[26-28]。研究發(fā)現(xiàn)，ACHE可能參與皮膚創(chuàng)傷后炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)和纖維化修復(fù)[29]。

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)研究玉屏風(fēng)散治療CU的作用機制，從生物信息學(xué)分析的角度明確了玉屏風(fēng)散通過多成分、多靶點，調(diào)節(jié)免疫功能、緩解炎性反應(yīng)治療CU。同時根據(jù)分析所得數(shù)據(jù)，也為進一步明確CU的發(fā)病機制提供了今后研究的新方向。