一種松材線蟲醛脫氫酶的基因克隆及其生化性質(zhì)

李文碩 王林松 杜桂彩 郭群群 張廷婷 楊宏 李榮貴

（青島大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，青島 266071）

由松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）引起的松萎蔫病已經(jīng)在世界各地造成嚴重的生態(tài)環(huán)境破壞和巨大的經(jīng)濟損失，是松樹的一種毀滅性災(zāi)害［1］。中國于1982年在江蘇省南京市首次發(fā)現(xiàn)了松萎蔫病，隨后該病迅速擴散至其他省份［2］。該病的發(fā)生和傳播涉及多種因素，如松樹的抗性、昆蟲傳播媒介及線蟲攜帶的細菌等［3］。松萎蔫病的致病機制尚不清楚，目前尚未開發(fā)出針對該病有效且廉價的藥物［3］。

當(dāng)松材線蟲感染松樹的木質(zhì)部時，樹木的受損細胞可以釋放化學(xué)物質(zhì)來刺激模式識別受體并激活寄主松樹的防御系統(tǒng)，使松樹產(chǎn)生增厚細胞壁，產(chǎn)生活性氧，并積累醇、醛和萜烯等次生代謝產(chǎn)物現(xiàn)象［4-6］。松材線蟲以松樹的管胞和射線細胞為食，并依靠體內(nèi)的酶類抵御入侵宿主過程中遇到的防御阻礙［7-8］。松材線蟲體內(nèi)各種酶類的研究已經(jīng)成為松萎蔫病致病機制研究的熱點，過氧化物酶是松材線蟲應(yīng)對寄主防御反應(yīng)重要酶類，該酶由線蟲口針分泌至體外發(fā)揮作用，降低由寄主防御系統(tǒng)產(chǎn)生的活性氧對松材線蟲的傷害［9］。Fu等［10］克隆了一個在松材線蟲尾部表達的Bx-Prx基因，該基因表達的產(chǎn)物同屬于過氧化酶類，通過RNA干擾Bx-Prx的表達可以降低松材線蟲的繁殖率。細胞色素P450通路被認為是松材線蟲的主要解毒途徑［3，11-13］，干擾色素 P450家族 中 CYP33C9、CYP33C4、CYP33D3三個基因的表達，松材線蟲的活性和致病性均顯著降低［14］。

在之前的研究中，為了探究松材線蟲體內(nèi)一種醇脫氫酶的生理功能，我們使用醇脫氫酶的特異性抑制劑甲吡唑處理松材線蟲，結(jié)果顯示松材線蟲的取食能力和運動能力均明顯降低，表明醇代謝途徑對松材線蟲生長發(fā)育發(fā)揮著重要作用［15］。醛脫氫酶是醇類物質(zhì)代謝途徑中重要的一環(huán)，承擔(dān)著將毒性較大的醛類轉(zhuǎn)化為酸的重要功能［16］。轉(zhuǎn)錄組分析顯示，甲吡唑處理的松材線蟲，其體內(nèi)一種編碼醛脫氫酶的基因表達水平顯著升高。本文通過研究該醛脫氫酶的理化性質(zhì)，為深入了解該酶在松萎蔫病病理進程中的作用打下基礎(chǔ)，也為以醛脫氫酶為靶點的殺線藥物的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

野生松材線蟲取自嶗山（中國，青島市）上的枯萎黑松，將松枝剪成1 cm3左右的小塊，采用貝爾曼漏斗法分離野生松材線蟲［15］。將分離出的線蟲接種于長滿灰葡萄孢的馬鈴薯淀粉瓊脂培養(yǎng)基中，在25℃下避光培養(yǎng)一周左右［17］。本實驗所用的大腸桿菌DH5α和BL21（DE3）菌株及表達載體pET-15b購自Novagen公司并由本實驗室保存。實驗所用的限制核酸內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶購自NEB公司（北京）；Taq DNA聚合酶、瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技有限公司（北京）；pMD-18T載體、RNA提取試劑RNAiso購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；乙醛購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）購自上海源葉生物科技有限公司；其他化學(xué)試劑為分析純級別，購自上海滬試實驗室器材股份有限公司；引物合成和質(zhì)粒測序工作由上海生工公司完成。

1.2 方法

1.2.1 松材線蟲總RNA的提取及cDNA的合成 使用RNAiso試劑從松材線蟲中提取總RNA，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳分析。以松材線蟲總RNA模板，按照寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司cDNA第一鏈合成試劑盒說明書操作，反轉(zhuǎn)錄mRNA生成cDNA第一鏈。

1.2.2 目的基因克隆及表達載體構(gòu)建 根據(jù)轉(zhuǎn)錄組的測序結(jié)果，分別設(shè)計一對帶有Nde I和BamH I酶切位點的特異引物（引物序列見表1），以松材線蟲cDNA第一鏈為模板按如下程序擴增目的基因：94℃預(yù)變性 5 min；94℃變性 50 s，57℃退火 40 s，72℃延伸90 s，共進行35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳分離，用瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒回收目的基因，16℃下與pMD-18T載體連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5α，在含有氨芐青霉素（100 μg/mL）LB培養(yǎng)基篩選陽性克隆，挑取單克隆培養(yǎng)后提取質(zhì)粒并測序，序列正確的質(zhì)粒命名為pMD-18T-aldh。

表1 本試驗所用引物Table 1 PCR primers used in this study

pMD-18T-aldh經(jīng)Nde I/BamH I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳分離載體pMD-18T與aldh，用瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒回收aldh。用NdeI/BamHI雙酶切表達載體pET-15b后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，用瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒回收pET-15b。回收的載體pET-15b和aldh混合后用T4DNA連接酶于16℃下連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5α，在含有氨芐青霉素（100 μg/mL）LB培養(yǎng)基篩選陽性克隆，挑取單克隆培養(yǎng)后提取質(zhì)粒并測序，序列正確的質(zhì)粒命名為pET-15b-aldh。

1.2.3 醛脫氫酶結(jié)構(gòu)預(yù)測 醛脫氫酶的三級結(jié)構(gòu)通過在線網(wǎng)站http：// www.sbg.bio. ic. ac.uk/ phyre2 /html/page..cgi?id=index預(yù)測。通過在線網(wǎng)站https：// www.novopro.cn /tools/ signalp.html預(yù)測醛脫氫酶是否含有信號肽。利用NPS@ SOPMA工具分析重組醛脫氫酶的二級結(jié)構(gòu)。

1.2.4 表達及重組蛋白純化 將測序正確的表達載體pET-15b-aldh轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，在含有氨芐青霉素（100 μg/mL）LB培養(yǎng)基篩選陽性克隆，陽性克隆即為構(gòu)建的工程菌，挑取單菌落于37℃、150 r/min 的搖床中培養(yǎng)過夜。按1.5%（體積比）的接種量將培養(yǎng)液接種至4 L LB液體培養(yǎng)基中（含100 μg/mL 氨芐青霉素）進行菌體擴大培養(yǎng)。當(dāng)OD600等于1時加入β-異丙基硫代半乳糖苷（麥克林，上海）至終濃度為0.4 mmol/L 誘導(dǎo)目的蛋白表達，28℃誘導(dǎo)4 h。4℃，8 000×g，離心20 min收集菌體。菌體用結(jié)合緩沖溶液（20 mmol/L Tris-Cl，pH 8.3，5 mmol/L 咪唑，500 mmol/L NaCl）懸浮后，用超聲波破碎細胞，4℃，12 000×g，離心30 min獲得粗酶液。Ni-NTA樹脂用平衡緩沖液平衡處理后裝柱（1.2 cm×5.0 cm），加入粗酶液，然后用2種含有不同濃度咪唑的洗滌緩沖液進行逐步洗脫雜蛋白（洗滌緩沖液1：20 mmol/L Tris-Cl，pH8.3，30 mmol/L 咪唑，500 mmol/L NaCl；洗滌緩沖液 2 ：20 mmol/L Tris-Cl，pH 8.3，63 mmol/L 咪唑，500 mmol/L NaCl），最后用洗脫緩沖液（20 mmol/L Tris-Cl，pH8.3，500 mmol/L 咪唑，500 mmol/L NaCl）洗脫目的蛋白，4℃條件下洗脫蛋白溶液對Tris-Cl緩沖液（10 mmol/L，pH 8.0）透析脫鹽。用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，并用分離膠濃度為12% 的SDS-PAGE 分析純化結(jié)果［18］。

1.2.5 重組醛脫氫酶米氏常數(shù)的測定 在25℃下，以甲醛為底物測定重組醛脫氫酶的米氏常數(shù)。反應(yīng)根據(jù)Okibe的方法稍作更改，反應(yīng)總體積為 2 mL，含 5 mmol/L Tris-Cl 緩沖液（pH 8.3），3 mmol/L MgCl2，10 mmol/L 氧化型NAD和0.32 mg重組醛脫氫酶，以及不同濃度的甲醛（15 mmol/L-40 mmol/L）［19］。反應(yīng)時間10 min，通過測定反應(yīng)體系在340 nm 吸光度變化求出反應(yīng)速度，采用雙倒數(shù)作圖法求出醛脫氫酶的Km值，還原型NADH在340 nm 的毫摩爾消光系數(shù)為6.22 mmol/L/cm［20］。使吸光度增加0.01所需的酶量定義為1 U。

1.2.6 不同pH值對醛脫氫酶反應(yīng)速度的影響 在不同pH值下分別測定醛脫氫酶反應(yīng)速度。在25℃下，反應(yīng)時間5 min。采用如下6種不同緩沖液體系創(chuàng)造不同的pH環(huán)境：0.2 mol/L NaAC-HAC緩沖液（pH5.5）；0.2 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液（pH6.5）；0.2 mol/L Tris-Cl緩沖液（pH7.5）；0.2 mol/L Tris-Cl緩沖液（pH8.5）；0.2 mol/L Gly-NaOH 緩沖液（pH9.5）；0.2 mol/L Gly-NaOH緩沖液（pH10.5）。反應(yīng)總體積為2 mL，向上述不同的反應(yīng)緩沖液分別加入0.3 mmol/L KCl、5 mmol/L 氧化型 NAD、50 mmol/L 乙醛和0.63 mg重組醛脫氫酶。在340 nm下測定反應(yīng)體系吸光度的變化，計算反應(yīng)速度。

1.2.7 溫度對醛脫氫酶反應(yīng)速度的影響 在不同溫度條件下（15℃-50℃）分別測定醛脫氫酶的反應(yīng)速度。反應(yīng)時間為5 min的反應(yīng)體系含有0.2 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液（pH6.5），0.3 mmol/L KCl，5 mmol/L 氧化型NAD，50 mmol/L 乙醛和0.63 mg重組醛脫氫酶，反應(yīng)總體積為2 mL。在340 nm下測定反應(yīng)體系吸光度的變化，計算反應(yīng)速度。

1.2.8 金屬離子對醛脫氫酶反應(yīng)速度的影響 在25℃下，在5 mmol/L Tris-Cl緩沖液（pH8.3）中分別加入10 mmol/L 氧化型NAD，0.32 mg重組醛脫氫酶，35 mmol/L 甲醛，及終濃度為3 mmol/L 不同金屬離子（Mn2+、Na+、Ca2+、Ni2+、K+、Fe3+），反應(yīng)體系為2 mL，反應(yīng)時間5 min。在340 nm下測定反應(yīng)體系吸光度的變化，計算反應(yīng)速度。

1.2.9 醛脫氫酶對不同底物的催化能力 在25℃下，在5 mmol/L Tris-Cl緩沖液（pH8.3）中，測定以不同醛類為底物時酶的反應(yīng)速度，用于測試的醛類有：香草醛、戊二醛、甲醛、乙醛和4-（二甲氨基）-苯甲醛（簡寫為PDAB）。反應(yīng)總體積為2 mL，反應(yīng)時間5 min，反應(yīng)體系中分別加入終濃度為35 mmol/L上述不同的醛，10 mmol/L 氧化型NAD和0.32 mg重組醛脫氫酶，3 mmol/L MgCl2。在340 nm下測定反應(yīng)體系吸光度的變化，計算反應(yīng)速度。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的克隆及表達載體的構(gòu)建

使用RNAiso試劑成功從松材線蟲中提取了總RNA并反轉(zhuǎn)錄獲得了cDNA第一鏈。以此為模板通過RT-PCR成功擴增出一段約1.3 kb的片段，將該片段連入pMD-18T構(gòu)建pMD-18T-aldh。測序結(jié)果顯示，擴增得到的片段與GenBank序列號為CAD5152421.1的序列一致。該片段有完整的開放閱讀框，大小為1 353 bp，編碼451 個氨基酸殘基（圖1），根據(jù)EXPASY 分析，醛脫氫酶理論大小約為51 kD，理論等電點（pI）為4.8。

圖1 松材線蟲aldh基因序列和推測的氨基酸序列Fig.1 Sequences and predicted amino acid sequences of gene aldh from PWN（pine wilt disease）

2.2 重組醛脫氫酶的結(jié)構(gòu)預(yù)測

使用在線工具預(yù)測得到的重組醛脫氫酶的三維結(jié)構(gòu)如圖2-A所示。通過NPS@ SOPMA工具分析，結(jié)果如圖2-B顯示，醛脫氫酶二級結(jié)構(gòu)有較多的α螺旋結(jié)構(gòu)（藍色），占47.33%，其次是紫紅代表的無規(guī)卷曲占29.78%。利用在線工具預(yù)測重組醛脫氫酶信號肽，重組醛脫氫酶不具有信號肽結(jié)構(gòu)。

圖2 醛脫氫酶三維結(jié)構(gòu)（A）和二級結(jié)構(gòu)預(yù)測（B）Fig.2 Prediction of the 3-dimensional structure（A）and 2 -dimensional structure（B）of aldehyde dehydrogenase

2.3 重組醛脫氫酶的表達及純化

轉(zhuǎn)化表達載體pET-15b-aldh的大腸桿菌BL21（DE3）經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后積累大量目的蛋白（圖3），經(jīng)SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示，利用鎳柱親和層析純化出一種相對分子量約為51 kD的蛋白，與aldh編碼的醛脫氫酶的理論大小一致。

圖3 重組醛脫氫酶的表達與純化Fig. 3 Expression and purification of the recombinant alde-hyde dehydrogenase

2.4 重組醛脫氫酶米氏常數(shù)的測定

以反應(yīng)速度的倒數(shù)（1/v）對底物濃度的倒數(shù)（1/［s］）作圖，如圖4所示，根據(jù)Lineweaver-Burk方程式求得醛脫氫酶的Km值。當(dāng)用甲醛為底物，氧化型NAD為輔因子時，Km為27.87 mmol/L。

圖4 通過Lineweaver-Burk計算醛脫氫酶的Km值Fig. 4 Km of the recombinant aldehyde dehydrogenase calculated by Lineweaver-Burk plot

2.5 pH對重組醛脫氫酶反應(yīng)速度的影響

反應(yīng)體系的pH值對醛脫氫酶反應(yīng)速度的影響如圖5所示，pH值的變化范圍從5.5-10.5，重組醛脫氫酶在不同環(huán)境中表現(xiàn)出了不同反應(yīng)速度，從圖中可知重組醛脫氫酶的最適pH值為7.5，當(dāng)pH值為10.5時，醛脫氫酶檢測不到催化活性。

圖5 不同pH值對醛脫氫酶反應(yīng)速度的影響Fig. 5 Effects of pH values on aldehyde dehydrogenase reaction rates

2.6 不同溫度對醛脫氫酶反應(yīng)速度的影響

溫度對醛脫氫酶催化活力影響較大，當(dāng)測試溫度范圍為15℃-50℃，由圖6可知重組醛脫氫酶的最適溫度為25℃，當(dāng)反應(yīng)溫度達到50℃時，已檢測不到催化活性。

圖6 不同溫度對醛脫氫酶活性的影響Fig. 6 Effects of temperatures on aldehyde dehydrogenase activity

2.7 金屬離子對醛脫氫酶反應(yīng)速度的影響

向測試體系分別添加終濃度為3 mmol/L的不同的金屬離子，與完全不添加金屬離子相比，F(xiàn)e3+和Ni2+能夠提高酶的活力，Mn2+、Na+、K+和Ca2+對重組醛脫氫酶的活性均有抑制作用（圖7）。

圖7 不同金屬離子對醛脫氫酶反應(yīng)速度的影響Fig. 7 Effects of metal ions on aldehyde dehydrogenase reaction rates

2.8 醛脫氫酶對不同醛類的催化能力

在供試的5種醛類中，重組醛脫氫酶對香草醛顯示了較高的催化活力（圖8），酶活力為（4.06±0.20）U，對乙醛的催化活性最低，酶活僅為（0.866±0.12）U。對結(jié)構(gòu)復(fù)雜的芳香族醛類4-（二甲氨基）-苯甲醛的沒有檢測到催化活性。

圖8 醛脫氫酶對不同醛類的催化活性Fig. 8 Catalyzed activities of aldehyde dehydrogenase on different aldehydes

3 討論

松樹對松材線蟲的抗性與其體內(nèi)次生代謝物有關(guān)。馬尾松種源的抗性與α-松油醇、長葉烯、雪松烯和金合歡烯等成分呈正相關(guān)［21］。馬尾松富含松醇，其含量也與馬尾松的抗逆性密切相關(guān)［22］。松材線蟲侵染黑松后，宿主產(chǎn)生的揮發(fā)性成分中檢測到乙醇和萜類化合物［23］。已有研究表明，松樹產(chǎn)生的揮發(fā)物反式-2-己烯醛有較好的殺線活性［24］，松樹正常的脂類代謝也會產(chǎn)生丙二醛。松材線蟲在入侵宿主的過程中，需要克服宿主產(chǎn)生的這些醇類、醛類等次生代謝產(chǎn)物，才能成功定殖并致病。前期我們研究發(fā)現(xiàn)，松材線蟲的醇脫氫酶能夠催化多種醇類化合物的脫氫反應(yīng)生成醛類化合物［15］，但無論宿主體內(nèi)還是松材線蟲代謝產(chǎn)生的醛類物質(zhì)仍然具有較大毒性，需要進一步氧化為酸類成分才能進一步解毒和利用，推測松材線蟲體內(nèi)的醛脫氫酶就有此種功能，因此，松材線蟲醛脫氫酶可能成為松萎蔫病防治的一個潛在靶點，但目前尚未有松材線蟲醛脫氫酶的研究報道。

通過生物信息學(xué)方法，我們在GenBank中發(fā)現(xiàn)了13個與醛脫氫酶的編碼基因高度同源的序列（未公開結(jié)果），本文通過RT-PCR的方法從松材線蟲體內(nèi)成功克隆出一個編碼醛脫氫酶的cDNA，并成功構(gòu)建了表達載體。轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）中構(gòu)建了工程菌，IPTG誘導(dǎo)該基因的高效表達，并利用親和層析的方法純化獲得該基因編碼的醛脫氫酶?；钚苑治鲲@示，以甲醛為底物，以氧化型NAD為輔酶，通過雙倒數(shù)作圖法求得醛脫氫酶的Km值為27.87 mmol/L，與其他使用NAD作為輔因子的醛脫氫酶相比，來自太平洋火色桿菌（Flammeovirga pacifica）的一種醛脫氫酶，其Km值為（421±23.5）μmol/L；大腸桿菌的甘油醛-3-磷酸脫氫酶（C192A）的Km值為（0.074±0.004）mmol/L［25-26］，松材線蟲的醛脫氫酶具有中等的Km值。在對不同底物的催化活性的實驗中，松材線蟲的醛脫氫酶表現(xiàn)出了對香草醛較好的催化活性，這可能是松材線蟲在松樹體內(nèi)抵御香草醛的重要手段，而香草醛存在于感病樟子松木質(zhì)部和赤松樹皮部位［27-28］。

已有很多研究報道金屬離子顯著影響醛脫氫酶的活性，嗜熱脫氮土壤芽孢桿菌（Geobacillus thermodenitrificans）NG802 的醛脫氫酶可被 Mg2+、Ca2+和Mn2+的激活，但受到Co2+、Cu2+和Ni2+的抑制［29］。本研究發(fā)現(xiàn)Fe3+和Ni2+可提高松材線蟲醛脫氫酶的活性，而Ca2+、Mn2+、Na+和K+可降低酶活性，這為醛脫氫酶的開發(fā)利用打下基礎(chǔ)。此外，對該酶的一級結(jié)構(gòu)比對分析發(fā)現(xiàn)，該醛脫氫酶內(nèi)位于催化中心的保守氨基酸殘基并不是半胱氨酸（Cys），而是亮氨酸（Leu），但其C-端緊鄰Leu殘基的是組氨酸殘基（His），而不是常見的非極性氨基酸殘基（圖9），推測His參與了醛類化合物的催化作用。因此，對松材線蟲醛脫氫酶的深入研究有助于我們了解它們的理化性質(zhì)并為松萎蔫病藥物的研發(fā)提供更多的線索。

圖9 多序列對比不同來源的醛脫氫酶的一級結(jié)構(gòu)Fig.9 Multiple sequences alignments of primary structures of aldehyde dehydrogenases from different sources

4 結(jié)論

本研究克隆了松材線蟲體內(nèi)一個編碼醛脫氫酶的cDNA，獲得了重組醛脫氫酶，研究了該醛脫氫酶的生化性質(zhì)，證實以甲醛為底物的醛脫氫酶Km值為27.87 mmol/L，最適pH值為7.5，最適溫度為25℃，F(xiàn)e3+和Ni2+可提高其酶活性，Ca2+、Mn2+、Na+和K+可降低該酶活性。重組醛脫氫酶對5種測試醛類化合物顯示出不同的催化活性，香草醛是其最佳底物。