一株新的多重耐藥福氏志賀菌噬菌體生物學特性及基因組分析

文暢 劉晨 盧詩韻 許忠兵 艾超凡 廖漢鵬 周順桂

（福建省土壤環(huán)境健康與調控重點實驗室 福建農(nóng)林大學資源與環(huán)境學院，福州 350002）

抗生素在臨床醫(yī)學和畜禽養(yǎng)殖等行業(yè)中發(fā)揮重要的作用，是治療細菌感染的有效藥物。然而近些年抗生素大量濫用導致一些病原菌耐藥性問題愈發(fā)嚴峻，嚴重威脅整個人類健康［1］。例如常見的福氏志賀氏菌（Shigella flexneri，S. flexneri）是一種人畜共患條件致病菌，它會引起細菌性痢疾，是志賀氏菌病的主要病因之一［2］。志賀氏菌病是世界上最重要的食源性和水源性疾病之一，志賀氏菌病患者可能會出現(xiàn)繼發(fā)性并發(fā)癥，如敗血癥、肺炎和溶血性尿毒癥綜合征［3］。雖然目前抗生素是治療志賀菌病的有效手段，但臨床出現(xiàn)越來越多的多重耐藥志賀菌，使抗生素治療志賀菌病受到嚴重威脅［4］。因此，開發(fā)治療多重耐藥S. flexneri感染的方法迫在眉睫。

噬菌體（phage）是感染細菌等原核生物的一類病毒。據(jù)估計，地球上噬菌體總量達1032個，廣泛存在于養(yǎng)殖場、污水、土壤與海洋等自然環(huán)境［5］以及人體動物腸道中［6］。根據(jù)其生活周期不同，分為溫和（溶原）噬菌體和烈性噬菌體［7］；按照宿主范圍不同，可分為廣譜性噬菌體和特異性噬菌體［8］。由于大部分烈性噬菌體具有專一性高、裂解能力強、增殖速度快和不受細菌耐藥性影響等特點，因此被視為細菌“天然殺手”［9］。早在20世紀初，噬菌體療法就被臨床應用于皮膚科、眼科、泌尿科、口腔科、耳鼻喉科和外科手術等細菌感染的治療，然而隨著抗生素發(fā)現(xiàn)被慢慢取代［10］。近些年隨著抗生素耐藥性問題加劇，噬菌體療法又重新成為人們的研究熱點。目前，國內外已逐漸將噬菌體廣泛應用于人類、動物細菌性感染等疾病的治療以及環(huán)境、食品和土壤根際等方面病原菌的清除。譬如，Law等［11］用噬菌體療法成功治療囊性纖維化患者耐多藥銅綠假單胞菌感染；Saussereau等［12］將噬菌體療法用于臨床慢性肺部感染等治療；Wang等［13］利用噬菌體防控土傳病原青枯菌。由此可見，噬菌體療法在耐藥病原菌治療方面有著良好的應用前景。

噬菌體療法用于病原菌S. flexneri的感染也越來越受重視。Xu等［14］分離出潛伏期約為35 min的S.flexneri 短尾噬菌體vB_ShiP-A7，成功將小鼠腸道多重耐藥S. flexneri的感染降低3-10倍；Shahin等［15］分離出一株侵染S. flexneri潛伏期為20 min的長尾烈性噬菌體vB_SflS-ISF001，可將食用雞肉S. flexneri的感染數(shù)量降低2個數(shù)量級。雖然噬菌體療法對動物和食品中S. flexneri感染已有初步成效，但大多S. flexneri噬菌體的宿主專一性和噬菌體抗性的出現(xiàn)是單一噬菌體療法面臨的重大挑戰(zhàn)。通過使用兩個或更多噬菌體的噬菌體雞尾酒療法，不僅可以增加宿主范圍，還能降低噬菌體抗性的可能性［16］。然而，目前依然缺乏種類多樣且高效穩(wěn)定的多重耐藥S.flexneri的噬菌體資源。

本研究從活性污泥中分離出一株多重耐藥S.flexneri肌尾烈性噬菌體P003，對其形態(tài)、最佳感染復數(shù)、一步生長曲線、溫度和pH穩(wěn)定性等生理特性進行測定。通過全基因組測序進行生物信息學分析，從基因組水平判斷其潛在功能和安全性，并明確其系統(tǒng)發(fā)育進化關系，為后續(xù)噬菌體療法在多重耐藥S. flexner的應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株及樣品來源：本實驗涉及的宿主菌S.flexneri B003及其噬菌體P003均由本實驗室從榕北海峽環(huán)保污水處理廠的活性污泥中分離獲得。用于裂解譜分析的其他15株菌株，具體為志賀菌屬（Shigella）3株、埃希氏菌屬（Escherichia）7株、沙雷氏菌屬（Serratia）2株、腸桿菌屬（Enterobacter）和克雷伯菌屬（Klebsiella）各1株。其中E. coli DH5α購于生工生物工程（上海）股份有限公司，E.coli HB101由天津衛(wèi)生學環(huán)境醫(yī)學研究所惠贈，E.coli OP50由南京農(nóng)業(yè)大學惠贈，其他菌株由本實驗室保存。

培養(yǎng)條件：使用的培養(yǎng)基有LB（Luria-Bertani）液體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基（1.5% W/V瓊脂）、LB半固體培養(yǎng)基（0.5% W/V瓊脂）。宿主菌和噬菌體均在160 r/min、37℃條件下培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 宿主菌分離及耐藥性鑒定 用無菌接種環(huán)蘸取污泥樣品稀釋液，在LB固體平板上劃線，過夜培養(yǎng)，挑單菌重復劃線3次進行純化。將菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行16S rRNA基因測序鑒定。蘸取適量菌液分別在含有不同抗生素的LB固體藥板上劃線，觀察細菌生長情況，重復3次。抗生素選用常見的四環(huán)素（2 μg/mL）、氯霉素（16 μg/mL）、氨芐青霉素（100 μg/mL）、卡那霉素（100 μg/mL）、阿莫西林（64 μg/mL）、硫酸鏈霉素（30 μg/mL）、慶大霉素（10 μg/mL）、紅霉素（15 μg/mL）和利福平（100 μg/mL）［17］。

1.2.2 噬菌體分離純化及效價測定 將S. flexneri B003與污泥濾液（0.22 μm水系濾膜）混合于LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)。取適量共培液于LB半固體培養(yǎng)基（約55℃）中，迅速搖勻后倒入瓊脂平板上，37℃過夜培養(yǎng)。挑取單個形態(tài)清晰的噬菌斑與S.flexneri菌液進行增殖純化，重復3次后即獲得純噬菌體。將共培液離心（12 000 r/min，4℃，3 min），過濾（0.22 μm），濾液梯度稀釋，分別取10 μL點滴于含菌平板上過夜培養(yǎng)，統(tǒng)計最大稀釋倍數(shù)下的單噬菌斑個數(shù)。噬菌體效價（PFU/mL）＝噬菌斑個數(shù)×稀釋倍數(shù)×100。

1.2.3 噬菌體形態(tài)學觀察 取20 μL P003和S.flexneri B003的共培液滴到200目銅網(wǎng)上，靜置5 min，用濾紙吸去多余共培液，干燥1 min。向銅網(wǎng)加入1滴1%的磷鎢酸，室溫靜置10 min，置于日立 HT7700 型透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）下觀察P003形態(tài)。

1.2.4 噬菌體最佳感染復數(shù)及一步生長曲線測定 將S. flexneri B003培養(yǎng)至對數(shù)期（108CFU/mL），P003調至不同滴度（106-1010PFU/mL）。按照噬菌體感染復數(shù)（multiplicity of infection，MOI）為0.01、0.1、1、10、100的比例混合于5 mL液體LB，培養(yǎng)12 h，測定效價，重復3次，測得最高效價的感染復數(shù)即為最佳感染復數(shù)。在最佳感染復數(shù)條件下，S. flexneri和P003各取200 μL加入20 mL液體LB，37℃培養(yǎng)5 min，離心棄上清，加入適量液體LB重懸沉淀，再次離心棄上清液，重新加入20 mL液體LB，37℃振蕩培養(yǎng)。10 min取一次樣，測定噬菌體效價，重復3次。繪制噬菌體一步生長曲線，得出P003侵染宿主菌的潛伏期、裂解期和平臺期。

1.2.5 噬菌體溫度、pH及紫外穩(wěn)定性測定 熱穩(wěn)定性：分別取1 mL P003于無菌離心管中，置于4、20、30、40、50、60、70和80℃恒溫水浴鍋孵育2 h。pH敏感性：分別取100 μL P003加入900 μL pH值為3、4、5、6、7、8、9、10的無菌液體LB，30℃水浴2 h。紫外敏感性：分別取1 mL P003均勻鋪于無菌培養(yǎng)皿中，在距離紫外燈30 cm處靜置照射0、5、10、15和20 min。通過測定P003在以上不同處理條件下的效價來反映其生物學穩(wěn)定性。

1.2.6 噬菌體宿主譜測定 對包含宿主菌在內的16株菌株進行噬菌體侵染測定。取300 μL單菌菌液加入30 mL固體LB培養(yǎng)基（55℃），迅速搖勻，倒入培養(yǎng)皿，待凝固。取20 μL噬菌體懸液點滴在已凝固的含菌平板，37℃過夜培養(yǎng)，觀察是否出現(xiàn)噬菌斑。每次測定重復3次。

1.2.7 噬菌體基因組測序及分析 使用λ噬菌體基因組DNA提取試劑盒（北京艾比根生物技術有限公司）提取噬菌體DNA，送至廣東美格基因科技有限公司，使用Illumina HiSeq novaseq 6000平臺對噬菌體基因進行測序。測序結果采用軟件Soapnuke［18］進行數(shù)據(jù)質控。使用 SOAPaligner［19］、BWA［20］等軟件去除宿主污染。序列通過組裝軟件SPAdes［21］進行拼接。使用blast軟件，將獲得序列與病毒數(shù)據(jù)庫（NCBI）進行比對，使用BWA和samtools軟件將序列與目標病毒序列進行比對，獲得基因組GC含量及結構特征。采用MetaGeneMark［22］對病毒序列進行基因預測，利用預測基因的蛋白序列與UniProtKB數(shù)據(jù)庫的病毒序列（ViralZone［23］，reviewed proteins https：//viralzone.expasy.org/）比對，獲取病毒的功能注釋信息。通過CGView Server繪制噬菌體基因組圖譜［24］；使用軟件R中ggplot2和gggenes包進行基因功能注釋；采用軟件mauve將NCBI比對到相似度較高的噬菌體基因組共線性分析［25］；使用軟件MEGA 6鄰接法（bootstrap設為1 000）構建噬菌體衣殼蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹［26］。

2 結果

2.1 宿主菌抗生素耐藥性

宿主菌S. flexneri B003初步鑒定為一株潛在多重耐藥病原菌，對四環(huán)素、氯霉素、氨芐青霉素、阿莫西林、硫酸鏈霉素、慶大霉素、紅霉素和利福平8種抗生素具有耐藥性（表1），表明其在環(huán)境中對人類健康存在潛在風險。

表1 宿主菌耐藥性Table 1 Antibiotic sensitivity of host bacteria

2.2 噬菌體分離鑒定及形態(tài)學特征

從活性污泥中分離純化到一株多重耐藥S.flexneri噬菌體，命名為P003。經(jīng)過雙層平板法培養(yǎng)，在S. flexneri B003菌苔上出現(xiàn)清晰透亮且大小均勻的噬菌斑，大小1.5-2.0 mm（圖1-A）。透射電鏡觀察，P003由典型的正二十面體頭部和帶收縮性尾鞘的尾部構成，頭部直徑80 nm±2 nm，尾部116 nm±1 nm（圖1-B）。根據(jù)病毒形態(tài)學分類，初步鑒定為有尾噬菌體目（Caudovirales）、肌尾噬菌體科（Myoviridae）。

圖1 噬菌體P003噬菌斑（A）及透射電鏡形態(tài)（B）Fig.1 Plaque（A）and morphology by TEM（B）of phage P003

2.3 噬菌體最佳感染復數(shù)及一步生長曲線

通過測定P003在不同MOI培養(yǎng)下的效價分析其侵染S. flexneri B003的能力。如圖2-A所示，P003的最佳MOI為10，效價可達109PFU/mL。以取樣時間為橫坐標，P003滴度的對數(shù)為縱坐標，繪制一步生長曲線。如圖2-B所示，在0-10 min內，效價無明顯變化，10-40 min內，效價急劇增加，因此P003侵染S. flexneri B003的潛伏期約為10 min，爆發(fā)期約為30 min。在侵染40 min后效價趨于穩(wěn)定，P003進入裂解周期的平臺期。

圖2 噬菌體P003最佳感染復數(shù)（A）及一步生長曲線（B）Fig.2 Optimal multiplicity of infection（A）and one-step growth curve of phage P003（B）

2.4 噬菌體溫度、pH及紫外穩(wěn)定性

在不同條件處理后對P003進行效價測定評估其生物學穩(wěn)定性。熱穩(wěn)定性如圖3-A所示，P003在4-60℃范圍內有較穩(wěn)定的裂解活性，滴度約107PFU/mL。溫度大于60℃時活性急劇下降，當溫度達到80℃時，喪失裂解能力，表明P003對溫度有一定范圍的耐受性，但是高溫（80℃）也能使其迅速失活。酸堿耐受性如圖3-B所示，P003在pH 7時活性最高，滴度可達109PFU/mL。其效價隨著酸性或堿性的增加而逐漸降低，但pH值在3-10時，P003均有一定活性，表明其對酸堿有一定范圍的耐受能力，且是一株更耐酸的噬菌體。紫外耐受性如圖3-C所示，隨著紫外照射時間的增加，P003效價不斷降低，紫外照射20 min可導致P003完全失活。

圖3 噬菌體P003溫度（A）、pH（B）及紫外（C）穩(wěn)定性Fig. 3 Temperature (A), pH (B) and UV (C) stability of phage P003

2.5 噬菌體宿主譜

通過對16株菌株裂解譜分析，結果發(fā)現(xiàn)噬菌體P003僅對多重耐藥S. flexneri B003有侵染裂解能力，所測試的其他福氏志賀菌、大腸桿菌和沙雷氏菌等15株菌株的平板均未出現(xiàn)噬菌斑（表2），表明P003是一株宿主特異性較高的噬菌體，對其他菌株無害。

表2 噬菌體P003裂解譜Table 2 Lytic range of phage P003

2.6 噬菌體全基因組分析

測序結果表明P003基因組為雙鏈DNA，全長68 721 bp，GC含量約46.14%（圖4）。使用Blast（v2.9.0+）軟件將基因組序列與NCBI Refseq數(shù)據(jù)庫比對，預測編碼99個開放閱讀框（open reading frame，ORF）。P003基因組中暫未發(fā)現(xiàn)已知抗生素抗性基因和毒力因子，表明了其在基因組水平上的安全性。

圖4 噬菌體P003全基因組圖譜Fig.4 Genome profile of phage P003

噬菌體P003編碼的99個ORF中有13個ORF注釋到已知功能基因，主要分為以下4類：DNA復制組裝基因、DNA代謝功能基因、結構基因和裂解基因。其他為未表征的假定蛋白（圖5）。

圖5 噬菌體P003基因功能注釋Fig. 5 Gene function annotation of phage P003

（1）噬菌體DNA復制組裝基因：DNA聚合酶（ORF45）在催化合成脫氧核糖核酸中起著重要作用，參與DNA合成表達相關的還有DNA解旋酶（ORF54）、DNA連接酶（ORF37）、DNA引發(fā)酶（ORF61）、大亞基終止酶（ORF4）。

（2）噬菌體代謝功能基因：僅預測出兩個已知與代謝調控相關的蛋白，分別為轉糖基酶（ORF27）和脫氫還原酶（ORF48）。轉糖基酶參與噬菌體DNA進入宿主細胞所必需的宿主肽聚糖消化過程，其缺失可能導致噬菌體DNA復制和宿主細胞裂解被延遲。

（3）噬菌體結構基因：分為頭部蛋白和尾部蛋白。頭部蛋白包括主要衣殼蛋白（ORF12）、小衣殼蛋白（ORF8）和頭纖維蛋白（ORF9）。尾部蛋白包括基板楔形蛋白（ORF21）和尾纖維蛋白（ORF98），基板蛋白在噬菌體吸附中起關鍵作用，這是噬菌體復制周期的第一步。

（4）噬菌體裂解基因：內溶素A（ORF34）是P003基因組中唯一被注釋到與裂解相關的基因。內溶素是噬菌體編碼的肽聚糖水解酶，噬菌體繁殖周期結束時在宿主細胞內合成，其在裂解宿主細胞過程中起著關鍵作用。

將噬菌體P003全基因組與NCBI Refseq病毒數(shù)據(jù)庫比對，結果發(fā)現(xiàn)其與5株大腸桿菌噬菌體同源性較高，覆蓋率在90%以上，相似度在95%以上（表3）。選取同源性最高的3株大腸桿菌噬菌體基因組進行共線性比較，結果顯示噬菌體P003局部基因與其他3株噬菌體存在差異，基因排布明顯不同（圖6），且不能侵染大腸桿菌，初步鑒定P003是一株新的噬菌體。

圖6 噬菌體P003與3株大腸桿菌噬菌體全基因序列比對Fig. 6 Whole-gene sequence alignment of phage P003 with 3 Escherichia phages

表3 噬菌體P003與數(shù)據(jù)庫中病毒基因組比較分析Table 3 Comparative analysis of phage P003 with virus database based on genome

2.7 噬菌體系統(tǒng)發(fā)育樹

為了說明噬菌體P003與其他同源噬菌體之間的系統(tǒng)進化關系，選取P003具有進化意義的主要衣殼蛋白序列（ORF12）和NCBI數(shù)據(jù)庫比對獲得的同源蛋白序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖7）。結果顯示P003與大腸桿菌噬菌體ECML-117和FEC19在同一分支上，表明P003與大腸桿菌噬菌體有較高親緣關系。

圖7 基于噬菌體P003主要衣殼蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree based on the major capsid protein of phage P003

3 討論

近年來，抗生素大量濫用促使病原菌對抗生素產(chǎn)生的多重耐藥性問題日益加劇，世界衛(wèi)生組織已將抗生素耐藥性問題列為2019年全球健康面臨的十大威脅之一［27］。據(jù)估計，到2050年全球每年約有1 000萬人死于抗生素耐藥性引起的細菌性疾病，比癌癥死亡人數(shù)多180萬［28］。因此，人們正在積極探索治療病原菌的其他方法，比如疫苗、微生態(tài)制劑、植物提取物和噬菌體等生物化學方法［29］，另外還有超高溫、電場和輻射殺菌等物理方法［30］。噬菌體作為地球上最豐富的微生物實體［31］，大多烈性噬菌體有宿主專一性高、有較強的自我繁殖能力且對人體和動物無害等顯著優(yōu)勢［32］，成為一種理想的抗生素替代品。近年來噬菌體療法在臨床醫(yī)學取得較大進展，尤其是被稱為噬菌體雞尾酒的多噬菌體療法。譬如，F(xiàn)abijan等［33］通過靜脈注射作為輔助治劑的3種肌病毒科噬菌體AB-SA01治療金黃色葡萄球菌嚴重感染患者，Melo等［34］研發(fā)了噬菌體混合物治療奇異變形桿菌引起的尿路感染等，這表明噬菌體雞尾酒療法具有良好的安全性和令人滿意的療效。

志賀菌是人畜常見易感病原菌之一，其主要通過水源、食源和排泄物等途徑感染，據(jù)報道世界上每年引起16萬人死亡［35］。目前越來越多的福氏志賀菌進化出多重抗生素耐藥性，這使抗生素療法面臨重大挑戰(zhàn)。雖然噬菌體作為一種專性治療病原菌的有效途徑，但是目前仍然缺乏能高效裂解多重耐藥病原菌S. flexneri的噬菌體資源，因此，不斷加強噬菌體分離培養(yǎng)是噬菌體療法應用的必要前提。

噬菌體分離培養(yǎng)需具備豐富噬菌體來源的樣品以及高效富集分離的方法。溫度、pH和紫外等理化條件不僅能限制細菌生存，也可通過影響噬菌體蛋白結構來決定其活性［28］。本研究從活性污泥中分離獲得一株多重耐藥S. flexneri噬菌體P003，在溫度4-70℃、pH 4.0-10依然保持活性，高溫80℃和紫外照射20 min可使其完全失活。一步生長曲線表明，P003侵染S. flexneri的潛伏期僅為10 min，相比何秀等［36］研究從養(yǎng)雞場中分離出潛伏期為75 min的S. flexneri噬菌體ΦDS8，P003有更快裂解S. flexneri的優(yōu)勢。通過生物信息學對P003進行全基因組比對和系統(tǒng)發(fā)育樹分析，均顯示其與大腸桿菌噬菌體有較高的親緣關系，可能由于P003宿主S. flexneri在系統(tǒng)發(fā)育上與大腸桿菌高度相似［15］。噬菌體P003基因排布與大腸桿菌噬菌體存在明顯差異，且宿主譜測定結果顯示，P003有較高的宿主特異性并不能侵染大腸桿菌，其形態(tài)與處于進化樹同一分支的大腸桿菌ECML-117依然存在差異［37］。綜上，P003被鑒定是一株新的烈性噬菌體，且對溫度和酸堿度有較寬耐受范圍。

隨著噬菌體被廣泛應用和研究，噬菌體的局限性和安全性也值得人們密切關注。如現(xiàn)在已知可培養(yǎng)的噬菌體較少，且專性噬菌體裂解譜過窄，只能針對某種病原菌的感染［38］。同時也應該注意，只有基因背景清晰、裂解作用強的噬菌體才能用于噬菌體療法，溶原噬菌體可能攜帶抗性基因和其他毒力基因，通過轉導作用加速耐藥性在其他微生物間的水平傳播［39］。本研究分離的P003是一株能快速侵染宿主菌且有較強裂解能力的烈性噬菌體，其基因組暫未檢測到已知耐藥基因和毒力因子，初步確保了基因組水平上的安全可靠性，本研究為將來利用噬菌體療法防治多重耐藥病原菌S. flexneri感染提供了新的菌種資源。

4 結論

本研究分離并鑒定了一株新的專性裂解多重耐藥病原菌S. flexneri的噬菌體P003。噬菌體P003對溫度和酸堿度有較寬的耐受范圍，侵染迅速，裂解能力較強，基因組未發(fā)現(xiàn)抗生素抗性基因和毒力因子。