同時(shí)產(chǎn)碳青霉烯酶NDM-1和NDM-5的豬源大腸埃希氏菌的鑒定及耐藥性研究

李海利 郎利敏 張青嫻 游一 朱文豪 王治方 張立憲 王克領(lǐng)

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，鄭州 450002）

產(chǎn)房仔豬腹瀉一直是養(yǎng)豬生產(chǎn)中危害仔豬的一種嚴(yán)重的消化道疾?。?］，在集約化規(guī)?；i場(chǎng)、中小規(guī)模豬場(chǎng)以及農(nóng)村散養(yǎng)戶豬場(chǎng)，產(chǎn)房仔豬腹瀉不僅導(dǎo)致仔豬生長(zhǎng)緩慢，料報(bào)酬低、體型大小不一致，料肉比升高，成為僵豬甚至死亡，而且死亡率高，能達(dá)到100%死亡率。這嚴(yán)重影響了豬場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)效益和運(yùn)營(yíng)狀況，給養(yǎng)豬業(yè)帶來極大的危害和造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。引起產(chǎn)房仔豬腹瀉的原因主要有以下幾個(gè)方面：細(xì)菌、病毒、寄生蟲、應(yīng)激、霉菌等因素。其主要原因?yàn)榇竽c桿菌引起的黃白痢和斷奶仔豬腹瀉。

隨著養(yǎng)豬規(guī)模的擴(kuò)大和發(fā)展及抗生素的用量增加和濫用，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)，臨床出現(xiàn)多重耐藥菌株和超級(jí)耐藥菌株［2-6］。細(xì)菌耐藥機(jī)制的產(chǎn)生主要原因是細(xì)菌基因在菌體內(nèi)外、抗性環(huán)境及高濃度抗生素環(huán)境的壓力下發(fā)生變異，使細(xì)菌的細(xì)胞膜能阻止甚至外排抗菌藥物的進(jìn)入，使其具有了生成生物膜的能力［7-11］。其中，細(xì)菌產(chǎn)生滅活酶或修飾酶是耐藥菌的重要耐藥機(jī)制，而β-內(nèi)酰胺酶是此類酶中數(shù)量最多者。到目前為止，細(xì)菌產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶已近500種。新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶（NDM）在一印度裔瑞典患者的泌尿道肺炎克雷伯菌分離株中檢測(cè)到，2008年第一次被報(bào)道，從此，NDM酶迅速傳播并在多個(gè)國(guó)家的病例中有發(fā)現(xiàn)［12-17］。NDM型金屬酶可高效水解多種抗生素，攜帶有該酶的菌株對(duì)幾乎所有的抗生素均耐藥，包括碳青霉烯類和β-內(nèi)酰胺類在內(nèi)的多類抗菌藥物，所以被稱為“超級(jí)細(xì)菌”［18-22］。NDM基因主要包括NDM-1-NDM-50的幾十個(gè)亞型，其中動(dòng)物源大腸桿菌上NDM-1和NDM-5基因的流行率呈遞增趨勢(shì)［23-27］，幾乎突破了臨床抗感染治療的最后一道防線［28-32］。因此，研發(fā)新型藥物、替抗藥物或者尋找一種有效的抗生素替代療法成為擺在全球科研工作者面前的重要科學(xué)問題。

本研究從產(chǎn)房仔豬腹瀉病例中分離到1株同時(shí)產(chǎn)碳青霉烯酶NDM-1和NDM-5的大腸埃希菌，該菌株對(duì)臨床常用的β-內(nèi)酰胺類和碳青霉烯類抗生素全部耐藥。但是，對(duì)磺胺甲惡唑、頭孢美唑、大觀霉素、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/克拉維酸、頭孢他啶/克拉維酸、頭孢噻肟/克拉維酸、頭孢哌酮/舒巴坦、氨曲南敏感。通過高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析技術(shù)，對(duì)HN2106菌株的基因組特征、耐藥質(zhì)粒特征進(jìn)行了分析，以期為由超級(jí)耐藥細(xì)菌引起的產(chǎn)房仔豬腹瀉的防治提供科學(xué)參考并為耐藥菌的控制及新藥研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 本實(shí)驗(yàn)室留存（2021年1-12月）從河南省及周邊地區(qū)豬場(chǎng)產(chǎn)房仔豬腹瀉病例中分離鑒定的亞胺培南敏感性減低的87株大腸桿菌，經(jīng)過PCR檢測(cè)和測(cè)序確定其攜帶NDM基因，篩選出一株同時(shí)攜帶NDM-1和NDM-5的大腸桿菌，命名為HN2106，以HN2106作為實(shí)驗(yàn)菌株，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑與器材 美羅培南和亞胺培南購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；青霉素G、氨芐西林、海他西林、阿莫西林、苯唑西林、氯唑西林、頭孢噻吩、頭孢氨芐、頭孢羥氨芐、頭孢孟多、頭孢西丁、頭孢克洛、頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢唑肟、頭孢曲松、頭孢哌酮、頭孢他啶、頭孢噻呋、頭孢比肟、頭孢喹肟等藥敏紙片購(gòu)自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)有限公司，引物合成和分子實(shí)驗(yàn)所需試劑購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 耐藥基因篩查 根據(jù)文獻(xiàn)查閱碳青霉烯酶耐藥基因［33-34］，基因引物信息見表1。

表1 NDM-5 耐藥基因引物序列Table 1 Primer sequence of NDM-5-resistant gene

1.2.2 藥敏試驗(yàn) 采用藥敏紙片法進(jìn)行耐藥表型測(cè)定。判定標(biāo)準(zhǔn)采用中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部醫(yī)政司（紙片法抗菌藥物敏感試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)：WS/T125-1999）。

1.2.3 基因組測(cè)序及分析 采用二代+三代即Illumina Hiseq+PacBio的測(cè)序方式，對(duì)HN2106進(jìn)行全基因組測(cè)序和生物信息學(xué)分析。應(yīng)用BLAST和MEGA軟件對(duì)序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析、系統(tǒng)進(jìn)化樹分析和NDM-1及其亞型鑒定。

2 結(jié)果

2.1 大腸埃希氏菌HN2106的藥物敏感性

對(duì)臨床常用的β-內(nèi)酰胺類抗生素和碳青霉烯類抗生素進(jìn)行了藥物敏感性試驗(yàn)，藥敏結(jié)果如表2所示。該菌株對(duì)臨床常用的β-內(nèi)酰胺類抗生素和碳青霉烯類抗生素全部耐藥，對(duì)磺胺甲惡唑、頭孢美唑、大觀霉素、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/克拉維酸、頭孢他啶/克拉維酸、頭孢噻肟/克拉維酸、頭孢哌酮/舒巴坦、氨曲南敏感。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of drug susceptibility testing

2.2 大腸埃希氏菌HN2106的基因組特征

Circos基因組圈圖可以全面展示基因組的特征，通過Circos軟件繪制單個(gè)樣本基因組圈圖（圖1）。大腸埃希氏菌HN2106的基因組圖包含5 179 971 bp，其G+C含量為50.59%。利用PlasFlow（https：//github.com/smaegol/PlasFlow）軟件對(duì)細(xì)菌基因組組裝結(jié)果進(jìn)行質(zhì)粒的鑒定，獲得的質(zhì)粒序列利用 BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi） 和PLSDB 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https：//ccb-microbe.cs.uni-saarland.de/plsdb/）進(jìn)行質(zhì)粒注釋。經(jīng)分析顯示，HN2106中含有7個(gè)質(zhì)粒（plasmid A、plasmid B、plasmid C、plasmid D、plasmid E、plasmi D 和 plasmid G），3種類型，分別為Col、IncFII、IncQ1。

圖1 HN2106基因組圈圖Fig. 1 Genome circle diagram of E. coli HN2106

2.3 pNDM5-HN2106質(zhì)粒分析

pNDM5-HN2106（plasmid B） 長(zhǎng) 度 為 74 815 bp，其G+C含量為50.24%（圖2）。通過分析顯示，該質(zhì)粒含有1個(gè)耐藥基因blaNDM-5，該質(zhì)粒類型 為 IncQ1。 通 過 將 pNDM5-HN2106（plasmid B）全序列和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，該質(zhì)粒和最近報(bào)道的1個(gè)質(zhì)粒pKP-NDM-5（Accession No CP084746.1）匹配（99.76%的相似性和覆蓋率，該質(zhì)粒來源于肺炎克雷伯菌）。該質(zhì)粒和另一個(gè)質(zhì)粒NDM1 plasmid unnamed 2（Accession No CP083890.1）也有很高的相似性（99.08%的相似性和覆蓋率，該質(zhì)粒來源于1株大腸埃希氏菌）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證pNDM5-HN21（plasmid B）的基因型，用MEGA軟件對(duì)35個(gè)NDM基因質(zhì)粒進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分型，分型結(jié)果顯示，與pKP-NDM-5（Accession No CP084746.1）親緣關(guān)系最近，聚入同一分支，為NDM5型。

圖2 Plasmid B圈圖Fig. 2 Plasmid B circle

2.4 pNDM1-HN2106（plasmid C）質(zhì)粒分析

pNDM1-HN2106（plasmid C） 長(zhǎng) 度 為 35 423 bp，其G+C含量為53.44%（圖3）。該質(zhì)粒含有1個(gè)耐藥基因blaNDM-1，質(zhì)粒類型為IncFII。通過將pNDM1-HN2106（plasmid C）全序列和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，該質(zhì)粒和最近報(bào)道的1個(gè)質(zhì)粒p1108-NDM（Accession No MG825381.1）匹配（99.98%的相似性和覆蓋率，該質(zhì)粒來源于1株大腸埃希氏菌）。此外，該質(zhì)粒和其他一些質(zhì)粒也有很高的相似性，例如p8C57-NDM（Accession No MT407546.1）、pNDM33-3（AccessionNo CP076650.1）等。為了進(jìn)一步確定pNDM-HN21（plasmid C）的基因型，用MEGA軟件對(duì)55個(gè)NDM基因質(zhì)粒進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分型，分型結(jié)果顯示，pNDM-HN2106（Plasmid C）的基因型與p1108-NDM（Accession No MG825381.1，該質(zhì)粒來源于大腸埃希氏菌，99.98%的相似性和覆蓋率）和p8C57-NDM（Accession No MT407546.1，95%的覆蓋率和99.98%的序列相似性，該質(zhì)粒來源于大腸埃希氏菌）親緣關(guān)系最近，聚入同一分支，為NDM1型。

圖3 Plasmid C圈圖Fig. 3 Plasmid C circle diagram

2.5 大腸埃希氏菌HN2106耐藥基因

經(jīng)綜合的抗生素抗性基因數(shù)據(jù)庫(kù)（Comprehensive Antibiotic Resistance Database，CARD）分析顯示，HN2106含有21種類型的抗生素耐藥基因（圖4），包括大環(huán)內(nèi)脂類、四環(huán)素類、氟喹諾酮類、青霉烷類、頭孢菌素類、苯丙醇類、頭霉素類、氨基糖苷類、肽類、碳青霉烯類、氨基香豆素類、單胺菌素類、青酶烯類、利福霉素類、甘氨酰環(huán)素類、吖啶染料類、糖肽類、林可酰胺類、三氯生類、硝基咪唑類、其他類（截短側(cè)耳素類、鏈霉殺陽菌素類、核苷類、磺胺類、二氨基嘧啶類、磷霉素類、惡唑烷酮類、硝基呋喃類、莫匹羅星類、砜類、雙環(huán)霉素類、游離脂肪酸類、氯化苯甲烴銨類、若丹明類）。具體耐藥基因見附件1。

圖4 21種類型的抗生素耐藥基因Fig. 4 21 types of antibiotic resistance genes

3 討論

隨著碳青霉烯類和β-內(nèi)酰胺類抗生素的廣泛應(yīng)用或不規(guī)范應(yīng)用，使大腸桿菌對(duì)碳青霉烯類和β-內(nèi)酰胺酶抗生素產(chǎn)生了耐藥性，尤其是攜帶NDM基因的大腸桿菌的出現(xiàn)［35-38］。碳青酶烯類耐藥腸桿菌（carbapenem-resistant enterobacteriaceae，CRE）和多重耐藥菌已成為臨床防控的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)［39］。NDM耐藥菌對(duì)幾乎所有的β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥，對(duì)動(dòng)物疾病治療、公共衛(wèi)生和食品安全提出了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)和造成了極大威脅［40-43］。NDM-1“超級(jí)細(xì)菌”是指許多種（NDM1-NDM50）擁有新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶-1（new delhi-metallo-1，NDM-1）基因的細(xì)菌的統(tǒng)稱，攜帶該基因的耐藥菌被稱為“超級(jí)細(xì)菌”［44-48］。目前，已檢測(cè)到產(chǎn)NDM-1基因的主要細(xì)菌包括摩氏摩根菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌等［49-53］。因此，開展NDM流行病學(xué)調(diào)查對(duì)臨床感染的防控和新藥物研發(fā)具有重要意義。本研究從產(chǎn)房仔豬腹瀉病例中分離出1株碳青霉烯酶耐藥基因，經(jīng)16S rRNA基因測(cè)序、NDM耐藥基因擴(kuò)增以及基因組測(cè)序分析，均表明該菌株為大腸埃希菌。藥敏試驗(yàn)顯示，該菌株除對(duì)碳青霉烯類抗生素亞胺培南耐藥外，還對(duì)檢測(cè)的其他類型抗菌藥物如β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥，表明該菌株為多重耐藥菌。再結(jié)合PCR檢測(cè)及全基因組測(cè)序分析，表明該菌株是一株產(chǎn)NDM-5和NDM-1的雙重質(zhì)粒的多重耐藥大腸埃希菌。

HN21含有21種類型的抗生素耐藥基因。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，blaNDM-5位于質(zhì)粒pNDM5-HN2106（plasmid B）上，blaNDM-1位于質(zhì)粒pNDM1-HN2106（plasmid C）上。以上結(jié)果表明，NDM耐藥基因主要位于質(zhì)粒上，借助質(zhì)粒的可傳遞性，并通過質(zhì)粒復(fù)制、接合、轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)座子移位，NDM耐藥基因便很容易地傳播給其他細(xì)菌，引起更大范圍的暴發(fā)流行和更廣泛的耐藥。

序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，blaNDM-5攜帶質(zhì)粒pNDM5-HN2106（plasmid B）和國(guó)內(nèi)所報(bào)道的1個(gè)質(zhì)粒pKPNDM-5（Accession No CP084746.1）在序列上有高度的一致性（99.76%的相似性和覆蓋率），該質(zhì)粒來源于浙江金華醫(yī)院分離的肺炎克雷伯菌。該質(zhì)粒和另一個(gè)質(zhì)粒NDM1 plasmid unnamed2（Accession No CP083890.1）也有很高的相似性（99.08%的相似性和覆蓋率），該質(zhì)粒來源于澳大利亞1株大腸埃希氏菌。通過基因進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，pNDM5-HN2106（plasmid B）的基因型與pKP-NDM-5（Accession No CP084746.1，99.76%的相似性和覆蓋率，該質(zhì)粒來源于肺炎克雷伯菌）親緣關(guān)系最近，聚入同一分支。因此，確定pNDM5-HN2106（plasmid B）為NDM5型。以上研究表明，pNDM5-HN2106（plasmid B）類似質(zhì)粒具有世界流行性的特點(diǎn)，同時(shí)該類型質(zhì)粒對(duì)blaNDM-5耐藥基因的傳播發(fā)揮著重要作用。該質(zhì)粒可在不同種屬之間傳播，分離自不同的細(xì)菌，包括肺炎克雷伯菌和大腸桿菌。表明該類型質(zhì)粒可以跨越種屬限制而自由傳播，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)這種類型質(zhì)?？梢苑蛛x自不同的樣本，包括人和動(dòng)物，進(jìn)一步說明了該類型質(zhì)粒傳播的廣泛性。

pNDM-1-HN2106（plasmid C）是本研究發(fā)現(xiàn)的另外一個(gè)含有NDM基因的質(zhì)粒，通過序列比對(duì)和分析發(fā)現(xiàn)，blaNDM-1攜帶質(zhì)粒pNDM1-HN2106（plasmid C） 和 國(guó) 內(nèi) 報(bào) 道 的 p1108-NDM，（Accession No MG825381.1，99.98%的相似性和覆蓋率，該質(zhì)粒來源于1株從食品中分離到的大腸埃希氏菌）、p8C57-NDM（Accession No MT407546.1，95%的覆蓋率和99.98%的序列相似性，該質(zhì)粒來源于大腸埃希氏菌）匹配。為了進(jìn)一步確定pNDM1-HN2106（plasmid C）的基因型，對(duì)55個(gè)NDM基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分型，確定pNDM1-HN2106（plasmid C）的基因型為NDM-1型。以上研究表明，pNDM1-HN2106（Plasmid C）質(zhì)?？梢栽谑称泛蛣?dòng)物之間相互傳播，這已說明了食品、動(dòng)物和人相互傳播的廣泛性。

本研究鑒定的HN2106為多重耐藥大腸埃希菌，經(jīng)全基因組測(cè)序，HN21中含有7個(gè)質(zhì)粒（plasmid A、plasmid B、plasmid C、plasmid D、plasmid E、plasmid F和plasmid G），Col、IncFII、IncQ1三種類型。主要攜帶兩種耐藥質(zhì)粒pNDM5-HN2106（plasmid B）和pNDM1-HN2106（plasmid C），分別介導(dǎo)blaNDM-5和blaNDM-1耐藥基因，為耐藥菌進(jìn)行傳播和擴(kuò)散形成了基礎(chǔ)。blaNDM-1耐藥基因的共存與傳播給動(dòng)物和人類及食品安全造成隱患和威脅，有必要加大對(duì)動(dòng)物領(lǐng)域的流行病學(xué)調(diào)查，為臨床防控提供參考。該研究為此類菌株的潛在傳播機(jī)制提供了依據(jù)，說明了臨床用藥的合理以及對(duì)此類菌株進(jìn)行監(jiān)控的重要性。

4 結(jié)論

通過對(duì)HN2106菌株碳青霉烯酶NDM-1和NDM-5的耐藥基因擴(kuò)增、測(cè)序及全基因組測(cè)序分析，證實(shí)了HN2106菌株攜帶NDM-1和NDM-5的耐藥基因，其中blaNDM-1位于質(zhì)粒pNDM-HN2106（Plasmid C）上，blaNDM-5位于質(zhì)粒pNDM5-HN2106（Plasmid B）上，分別介導(dǎo)blaNDM-1和blaNDM-5耐藥基因，是耐藥菌傳播的重要載體。全基因組耐藥基因預(yù)測(cè)結(jié)果顯示其同時(shí)還攜帶21種類型的抗生素耐藥基因。

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