血清DKK-1水平與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎伴肺間質(zhì)病變的關(guān)系

楊 慧 陶 蓓 何成松

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以多關(guān)節(jié)炎為主要特征的自身免疫性疾病[1]。 RA發(fā)生肺間質(zhì)病變(interstitial lung disease, ILD)提示病情較重,與無ILD 的RA 患者比較,預(yù)后較差,死亡的風(fēng)險(xiǎn)更高[2,3]。 DKK-1(Dickkopf-1)是一種可以抑制Wnt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的分泌蛋白。 研究發(fā)現(xiàn),其參與了慢性炎癥關(guān)節(jié)病的發(fā)病機(jī)制,并且與RA 患者疾病活動(dòng)度具有一定的關(guān)系[4,5]。 Bongartz 等[6]研究指出,DKK-1 在特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)患者肺部的表達(dá),與健康肺部比較,DKK-1 在纖維化中的mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)顯著增加。 目前關(guān)于RA 合并ILD 患者血清中DKK-1 水平變化的研究較為少見。 本研究通過測定RA 合并ILD 患者血清中DKK-1 表達(dá)水平,探討血清中DKK-1水平與RA 合并ILD 的關(guān)系。

對(duì)象與方法

1.研究對(duì)象：選取2020年10月1日～2021年8月30日就診于西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科的112 例RA 患者。 納入標(biāo)準(zhǔn)：符合2010年美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(American College of Rheumatism,ACR)/歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟(European League against Rheumatism,EULAR)修訂的RA 分類標(biāo)準(zhǔn)[7]。 RA 合并ILD 的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照美國胸科協(xié)會(huì)/歐洲呼吸協(xié)會(huì)(ATS/ERS)2002年制定的肺間質(zhì)纖維化的分類標(biāo)準(zhǔn)[8]。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重肺部感染、肺結(jié)核、慢性阻塞性肺疾病、肺塵埃沉著病以及肺腫瘤等;②合并其他自身免疫性疾病(如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、皮肌炎、干燥綜合征等)、血液系統(tǒng)疾病(如白血病、多發(fā)性骨髓瘤)以及梅毒、HIV 等傳染病史;③嚴(yán)重心臟、肺和腎臟功能不全的患者。 根據(jù)肺HRCT 結(jié)果,將患者分為單純RA 組(n=62),其中男性9 例,女性53 例,患者平均年齡為54.68 ±10.40 歲;RA 合并肺間質(zhì)病變(RA-ILD)組(n=50),其中男性20 例,女性30 例,患者平均年齡為60.16 ±9.02 歲。 另選取同期于西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院進(jìn)行體檢的30 例健康人群作為健康對(duì)照組,其中男性15 例,女性15 例,平均年齡為48.87 ±15.19 歲。 本研究通過筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)審批(倫理審批號(hào)：KY2021232)。 所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

2.臨床相關(guān)資料：(1)臨床數(shù)據(jù)：性別、年齡、吸煙史、發(fā)病年齡、病程、壓痛關(guān)節(jié)數(shù)、腫脹關(guān)節(jié)數(shù)、身高、體重。 (2)實(shí)驗(yàn)室結(jié)果：紅細(xì)胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR)、C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)、抗環(huán)瓜氨酸肽(cyclic citrullinated peptide,CCP)抗體、類風(fēng)濕因子(rheumatoid factor,RF)、抗突變型瓜氨酸波形蛋白(modified citrullinated vimentin,MCV)抗體、抗核抗體(antinuclear antibody,ANA)、白細(xì)胞(white blood cell,WBC)計(jì)數(shù)、血紅蛋白(hemoglobin,Hb)、血小板(platelets,PLT)計(jì)數(shù)以及肺HRCT 等臨床資料,并計(jì)算出體重指數(shù)(body mass index,BMI)、疾病活動(dòng)指數(shù)(DAS28)等結(jié)果。

3.標(biāo)本的采集以及血清DKK-1 濃度的檢測：收集所有受試者清晨空腹靜脈血3ml,待血液凝固后以2000r/min 離心,離心10min,評(píng)估標(biāo)本合格后收集上清液,并存儲(chǔ)于-40℃冰箱中備用。 使用武漢科鹿生物科技有限公司的人DKK-1 ELISA 試劑盒進(jìn)行檢測,按照操作步驟測定所有受試者血清中DKK-1 濃度。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：使用R (Version 4.1.1; R Core Team, 2021)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)(百分比)[n(%)]表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)。 計(jì)量資料以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,組間各特征的比較采用單因素方差分析、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。 采用Pearson分析評(píng)估變量之間的關(guān)聯(lián)。 繪制受試者工作特征(receiver operator characteristic,ROC)曲線衡量DKK-1 在RA-ILD 中的診斷價(jià)值。 多因素二元Logistic回歸分析RA 合并ILD 發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。 以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.RA-ILD 組與單純RA 組臨床資料比較：臨床數(shù)據(jù)中男性比例、吸煙史、年齡、發(fā)病年齡、壓痛關(guān)節(jié)數(shù)、腫脹關(guān)節(jié)數(shù)比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均 ＜0.05)。 實(shí)驗(yàn)室結(jié)果中WBC、ESR、CRP 及DAS28 比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均 ＜0.05)。 RA-ILD組中抗CCP 抗體、RF 水平高于單純RA 組,但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05)。 病程、抗MCV 抗體、RF、Hb、PLT、ANA 水平、BMI 比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05),詳見表1。

表1 RI-ILD 組與單純RA 組臨床資料比較[n(%),±s]

表1 RI-ILD 組與單純RA 組臨床資料比較[n(%),±s]

項(xiàng)目單純RA 組RA 合并ILD 組t/χ2P男性9(14.5)20(40.0)9.3670.002年齡(歲)54.68 ±10.4060.16 ±9.02-2.9400.004發(fā)病年齡(歲)46.79 ±11.6854.54 ±9.53-3.783＜0.001病程(年)7.86 ±10.315.69 ±7.821.2290.222吸煙史6(9.7)15(30.0)7.5030.006壓痛關(guān)節(jié)數(shù)(個(gè))9.40 ±4.1514.24 ±3.78-6.383＜0.001腫脹關(guān)節(jié)數(shù)(個(gè))6.82 ±3.3710.74 ±3.76-5.804＜0.001 ESR(mm/h)57.26 ±31.8279.40 ±35.68-3.4670.001 CRP(mg/L)24.08 ±26.6747.95 ±47.25-3.1860.002 WBC(×109 /L)7.43 ±2.5810.11 ±8.56-2.1330.037 Hb(g/L)114.68 ±16.20115.32 ±20.37-0.1850.853 PLT(×109 /L)282.39 ±100.81314.18 ±141.72-1.3360.185 RF(IU/ml)238.81 ±246.25304.85 ±253.53-1.3920.167抗MCV 抗體(U/ml)591.92 ±417.48581.24 ±408.010.1350.892抗CCP 抗體(U/ml)312.68 ±185.02337.82 ±181.77-0.7200.473 ANA 陽性28(45.2)18(36.0)0.9590.327 BMI(kg/m2)23.15 ±3.9123.29 ±3.22-0.2010.841 DAS285.79 ±0.896.65 ±0.79-5.382＜0.001

2.RA-ILD 組與單純RA 組以及健康對(duì)照組血清DKK-1 水平比較：RA-ILD 組中DKK-1 水平為42.17 ± 15.43ng/ml,高于單純 RA 組(30.19 ±8.85ng/ml)以及健康對(duì)照組(17.38 ±6.78ng/ml),3組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F= 46.050,P＜0.001)。 組間兩兩比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)。

3.DKK-1 水平對(duì)于診斷RA-ILD 價(jià)值分析：DKK-1 水平檢測RA 合并ILD 患者的敏感度和特異性分別為46.0% 和96.8% (曲線下面積=0.727),此時(shí)最佳臨界值為45.108ng/ml,敏感度與特異性分別為46.0%與96.8%。

4.DKK-1 與臨床變量的相關(guān)性分析：Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示,DKK-1 水平與發(fā)病年齡(r=0.208,P= 0.028)、壓痛關(guān)節(jié)數(shù)(r= 0.267,P=0.004)、腫脹關(guān)節(jié)數(shù)(r=0.212,P=0.025)、ESR(r=0.287,P=0.002)、DAS28(r=0.284,P=0.002)均呈正相關(guān)(P均＜0.05),詳見表2。 與性別、年齡、病程、BMI、CRP、RF、抗CCP 抗體、ANA 水平、抗MCV抗體、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白、血小板計(jì)數(shù)均無相關(guān)性(P均＞0.05)。

表2 DKK-1 與各個(gè)指標(biāo)相關(guān)性分析

5.多因素二元Logistic回歸分析：以患者是否合并肺間質(zhì)病變?yōu)橐蜃兞繉?duì)患者進(jìn)行多因素Logistic回歸分析,結(jié)果顯示壓痛關(guān)節(jié)數(shù)目及DKK-1 水平與RA 合并ILD 相關(guān),是其發(fā)生的危險(xiǎn)因素,女性是RA-ILD 發(fā)生的保護(hù)因素(P＜0.05),詳見表3。

表3 RA 患者中合并ILD 影響因素的多因素Logistic 回歸模型

討 論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種常見的風(fēng)濕性疾病,我國RA 患者中約有10.32% 發(fā)生肺間質(zhì)病變,而世界范圍內(nèi)僅為3.34%[9]。 研究表明,RA 合并ILD 的患者具有較高的病死率,并且RA-ILD早期臨床癥狀不典型,容易漏診,且部分ILD 早于關(guān)節(jié)癥狀出現(xiàn),所以及時(shí)發(fā)現(xiàn)對(duì)RA-ILD 的治療對(duì)RA-ILD 患者的預(yù)后具有重要意義,目前關(guān)于RA-ILD 的病因尚不清楚,認(rèn)為RA-ILD 的發(fā)病與遺傳易感性和環(huán)境因素相關(guān)[10]。 RA 合并ILD 患者的肺部病理表現(xiàn)分為兩個(gè)階段,早期為炎癥免疫反應(yīng)階段,可表現(xiàn)為肺泡炎,后期為肺纖維化階段,由于成纖維細(xì)胞病灶中肌成纖維細(xì)胞的激活導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)沉積增加,最終導(dǎo)致不可逆性肺間質(zhì)纖維化[11,12]。

DKK-1 可通過與受體LRP6 結(jié)合,抑制經(jīng)典Wnt 通路的活化,影響相應(yīng)的生物學(xué)功能[13]。 Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(type 2 alveolar epithelial cells,AEC2)是肺泡細(xì)胞中的干細(xì)胞,抑制DKK-1 的表達(dá)可以促進(jìn)Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞的增殖,并減弱PM2.5 誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化[14]。 Zhou 等[15]研究發(fā)現(xiàn),降低DKK-1 的表達(dá),可以阻斷成纖維細(xì)胞的活化并改善特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)。 既往研究發(fā)現(xiàn),DKK-1 在IPF 患者肺組織中表達(dá)增強(qiáng),能夠改變Wnt 誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞增殖[6]。 與其他自身免疫性疾病所致的ILD 不同在于,RA-ILD 與IPF 具有相似的風(fēng)險(xiǎn)因素,以及影像學(xué)和病理學(xué)相似表現(xiàn),并且它們預(yù)后差,中位生存期相似[16]。 上述研究表明,DKK-1 可能與RA 發(fā)生ILD 相關(guān)。

目前國內(nèi)外已有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)DKK-1 參與了RA 的發(fā)病,對(duì)RA 的診斷以及評(píng)估患者疾病活動(dòng)度具有一定的參考價(jià)值[5,17]。 然而關(guān)于RA 合并ILD患者血清中DKK-1 水平變化的研究較為少見。 Jing等[18]研究發(fā)現(xiàn),血清中DKK-1 在RA-ILD 組中的表達(dá)明顯升高,對(duì)識(shí)別RA-ILD 患者具有一定敏感度和特異性,在RA-ILD 中具有一定的預(yù)測價(jià)值。本研究發(fā)現(xiàn),RA 合并ILD 患者血清中DKK-1 表達(dá)水平亦升高明顯,且與單純RA 組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示DKK-1 可能參與了RA 發(fā)生ILD 的過程。 DKK-1 水平檢測RA 合并ILD 患者的敏感度和特異性分別為46.0% 和96.8%,曲線下面積=0.727,此時(shí)最佳臨界值為45.108ng/ml,95% CI：0.627 ～0.826,提示DKK-1 可能參與了ILD 的發(fā)生,對(duì)RA-ILD 具有一定診斷效能,可考慮與其他生物學(xué)指標(biāo)聯(lián)合檢測以提高診斷效能。

目前已經(jīng)確定了RA 患者發(fā)生ILD 的幾個(gè)危險(xiǎn)因素,包括高齡、男性、吸煙、CCP 抗體或RF 陽性,并且一些研究表明RA 疾病活動(dòng)度、吸煙是可預(yù)防的危險(xiǎn)因素[10,19]。 本研究中RA-ILD 組男性例數(shù)多、年齡大、吸煙率高,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),提示男性、高齡、吸煙可能與RA 并發(fā)ILD 相關(guān),這與既往文獻(xiàn)報(bào)道相符合[19]。 本研究中RA-ILD 組中RF、抗CCP 抗體水平高于單純RA 組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,考慮可能納入的RA 患者非初治患者相關(guān)。單因素分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義變量進(jìn)一步納入多因素Logistic回歸模型中,以探索RA 患者中出現(xiàn)合并ILD 的相關(guān)危險(xiǎn)因素,結(jié)果發(fā)現(xiàn),壓痛關(guān)節(jié)數(shù)以及DKK-1 是影響RA 患者并發(fā)ILD 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,女性是ILD 發(fā)生的保護(hù)因素,而年齡、吸煙、抗CCP 抗體、RF 均未納入多因素回歸分析中,提示可能與樣本量偏少以及多種因素影響有關(guān)。

既往研究發(fā)現(xiàn),RA-ILD 組的患者與單純RA 患者比較,ESR、CRP 等炎性指標(biāo)明顯升高[21]。 本研究亦發(fā)現(xiàn),RA-ILD 患者血清中ESR、CRP 均高于單純RA 組,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.5)。 在一項(xiàng)納入1419 例RA 患者的研究中,疾病活動(dòng)度越高的RA 患者發(fā)生ILD 的風(fēng)險(xiǎn)越高[22]。 本研究同樣發(fā)現(xiàn),DKK-1 水平與ESR、DAS28 均呈正相關(guān)(P均＜0.05),并且RA-ILD 組DAS28、ESR 明顯高于單純RA 組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),進(jìn)一步說明DKK-1 在RA-ILD 的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的作用,提示DKK-1 可反映RA 疾病活動(dòng)度,積極控制類風(fēng)濕疾病活動(dòng)度可以降低發(fā)生肺間質(zhì)病變的風(fēng)險(xiǎn)。

本研究的不足之處在于：①研究樣本量不足;②不同試劑盒的敏感度以及準(zhǔn)確度不同;③受試者未進(jìn)行肺功能的檢測。 以上的不足之處可能導(dǎo)致本研究與其他研究存在一定的差異。

綜上所述,DKK-1 參與了RA 的形成,在RA-ILD 的發(fā)生、發(fā)展中可能具有一定的作用,對(duì)于疾病活動(dòng)度高、男性、DKK-1 表達(dá)水平高的患者盡早進(jìn)行影像學(xué)檢查評(píng)估是否合并ILD。 但關(guān)于DKK-1在RA-ILD 中的作用機(jī)制有待于擴(kuò)大樣本量開展深入研究,為RA-ILD 患者提供新的治療靶點(diǎn)。