IRAK1/4抑制劑對結(jié)腸炎小鼠腸道屏障功能的影響

嚴 博 李湘杰 喬雨晴 周林香 彭 帥 沈 磊

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)分為潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)和克羅恩病(Crohn's disease,CD),是一種慢性復(fù)發(fā)性腸道炎癥。UC 在病理上主要表現(xiàn)為結(jié)腸黏膜損傷,持續(xù)且彌漫性的炎癥改變,是一個涉及多因素的過程,通常在直腸和乙狀結(jié)腸首先發(fā)病,甚至逐漸發(fā)展為全結(jié)腸炎性病變[1,2]。 研究表明,白細胞介素-1 受體相關(guān)激酶(interleukin receptor-associated kinase,IRAKs)與多種疾病密切相關(guān)[3～5]。 其中,IRAK1/4 是Toll 樣受體(toll-like receptors, TLRs)介導(dǎo)的炎性信號通路中的兩個關(guān)鍵激酶,抑制IRAK1/4 活性可以減輕炎癥活動,減少組織損傷[6,7]。 炎癥活動常伴隨腸屏障的破壞,腸道屏障完整性受損被認為是導(dǎo)致IBD 的原因之一[8]。 腸上皮細胞(intestinal epithelial cells,IECs)、黏液層和緊密連接蛋白(tight junctions,TJs)是腸道屏障功能結(jié)構(gòu)的重要組成成分,有助于維持和調(diào)節(jié)腸道屏障[9,10]。 目前鮮有研究表明IRAK1/4 抑制劑在小鼠急性結(jié)腸炎中的作用,故本研究旨在探討IRAK1/4 抑制劑對小鼠結(jié)腸炎及其腸道屏障功能的調(diào)節(jié)保護作用。

材料與方法

1.實驗動物與材料：實驗采用30 只雄性小鼠(C57BL/6,6 ～8 周齡,體質(zhì)量約20g),購自北京華阜康生物科技有限公司。 DSS 購自美國MP Biomedicals 公司;IRAK1/4 抑制劑購自美國Med Chem Express 公司;ELISA 試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;PCR 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Sigma公司;兔多抗(ZO-1、occludin、claudin-1、JAM-A)購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,實驗動物使用符合《武漢大學(xué)人民醫(yī)院動物倫理委員會準則》,倫理批準號：WDRM20200901,實驗動物許可證號：SYXK(鄂)2020 ～0027。

2.實驗分組：正式實驗開始前,將小鼠于標準實驗室環(huán)境中(溫度21 ±2℃,濕度50% ±5%,12h/12h交替光照與黑暗)適應(yīng)性飼養(yǎng)7 天。 小鼠分為3 組：空白組：每天給予正常清潔飲水, 同時腹腔注射0.3ml 0.9%氯化鈉溶液;DSS 組：每天自由飲用質(zhì)量濃度為30g/L 的DSS 溶液,同時腹腔注射0.3ml 0.9%氯化鈉溶液;IRAK1/4 抑制劑組：在自由飲用DSS 溶液的同時,給予腹腔注射0.3ml IRAK1/4 抑制劑(10μmol/L,給藥濃度參考文獻[11, 12])。 依照上述分組及給藥模式連續(xù)造模7 天。

3.取材：實驗7 天后(最后一次給藥24 h 后),各組小鼠均未出現(xiàn)死亡。 將小鼠處死(頸椎脫臼法),行乙醇消毒后迅速解剖,取小鼠結(jié)直腸及回盲部,觀察腸道充血水腫和縮短情況,測量結(jié)腸長度;取病變明顯處結(jié)腸組織(通常為直腸和乙狀結(jié)腸)標本(約5mm × 10 mm),用多聚甲醛固定(質(zhì)量濃度為40g/L),石蠟包埋后切片并行HE 染色,另將部分新鮮結(jié)腸組織凍存于-80℃冰箱以備后續(xù)檢測。

4.疾病活動度評分：每天觀察記錄各組小鼠體質(zhì)量、糞便性狀及便血情況(隱血實驗及肉眼血便),計算疾病活動指數(shù)(disease activity index,DAI) 評分(表1)。

表1 DAI 評分

5.組織病理學(xué)評分：通過HE 染色切片觀察結(jié)腸黏膜形態(tài)及炎性細胞浸潤情況。 根據(jù)既往研究行組織學(xué)評分(表2)。

表2 組織病理學(xué)評分

6.結(jié)腸組織炎性細胞因子ELISA 檢測：選用標準的ELISA 試劑盒檢測結(jié)腸組織中炎性細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ 表達情況,利用酶標儀測定450nm 處吸光度(A)值。 所有ELISA 檢測均嚴格按照各試劑盒說明書進行。

7.結(jié)腸組織屏障蛋白表達檢測：蛋白免疫印記法檢測結(jié)腸組織ZO-1、occludin、claudin-1、JAM-A蛋白表達水平。 取小鼠結(jié)腸組織進行裂解、勻漿、離心制成細胞裂解液,然后用BCA 法測定蛋白濃度。采用PVDF 轉(zhuǎn)膜,再用含有5% 脫脂奶粉的TBST 室溫封閉2h,加入一抗ZO-1(1 ∶800)、occludin(1 ∶800)、claudin-1(1∶800)、JAM-A(1∶1000),在4℃恒溫下孵育過夜,TBST 充分洗滌5 ～6 次,每次5min。 加入辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)標記的一抗(1∶50000),37℃搖床孵育2h,TBST 充分洗滌5 ～6 次,每次5min;最后用ECL 高敏顯色液顯色并拍片,使用計算機Image-J 軟件進行分析,測定灰度值。

8.結(jié)腸組織黏蛋白RT-PCR 檢測：實時熒光定量PCR 檢測小鼠結(jié)腸組織中黏蛋白mucin-1 和mucin-2 mRNA 變化。 根據(jù)試劑盒制造商的方案,應(yīng)用TRIzol 試劑從結(jié)腸樣本中提取總RNA。 使用反轉(zhuǎn)錄酶從提取的RNA 中反轉(zhuǎn)錄cDNA。 real-time PCR采用ABI 7500 和SYBR Green 探針。 以β-actin 為內(nèi)參,引物序列詳見表3。

表3 PCR 引物序列

9.統(tǒng)計學(xué)方法：應(yīng)用GraphPad Prism 8 統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析并繪制統(tǒng)計圖。 多組間單因素分析采用方差分析。 以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.各組小鼠生命體征及DAI 評分：實驗過程中,空白組小鼠活動正常,體質(zhì)量均有不同程度增加,糞便正常;DSS 組小鼠均出現(xiàn)明顯體質(zhì)量下降,飲食飲水減少甚至出現(xiàn)拒食現(xiàn)象,在實驗后期出現(xiàn)肉眼可見的血便;IRAK1/4 抑制劑組雖有不同程度的體質(zhì)量下降,出血不同程度的血便,但程度均較DSS 組輕。 綜合上述情況行DAI 評分,與空白組比較,DSS 組評分明顯增加(P＜0.01),與DSS 組比較,IRAK1/4 抑制劑組顯著減低(P＜0.01,圖1A)。

圖1 各組DAI 評分及結(jié)腸長度

2.各組小鼠結(jié)腸長度及組織病理學(xué)評分：觀察各組結(jié)腸情況,空白組小鼠結(jié)腸未見明顯充血腫脹,DSS 組小鼠結(jié)腸充血腫脹,與空白組比較明顯縮短(P＜0.01)。 與DSS 組比較,IRAK1/4 抑制劑干預(yù)組后,結(jié)腸縮短及充血腫脹情況均有所改善(P＜0.01,圖1 B)。 分析結(jié)腸HE 染色切片,空白組小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)完整,無炎性細胞,腺體排列規(guī)則,DSS 組小鼠結(jié)腸黏膜嚴重破壞,腺體排列紊亂甚至消失,黏膜及黏膜下層可見大量炎性細胞浸潤,與空白組比較,病理學(xué)評分顯著升高(P＜0.01,圖2 中A、B、D);IRAK1/4 抑制劑組小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)及腺體排列較DSS 組相對完整,炎性細胞浸潤較少,病理學(xué)評分明顯降低(P＜0.01,圖2 中B、C、D)。

圖2 結(jié)腸組織病理切片(HE 染色, ×200)

3.各組小鼠結(jié)腸炎性細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ 表達水平：ELISA 法檢測各組小鼠結(jié)腸促炎性細胞因子表達水平,與空白組比較,DSS組IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ 表達水平明顯增加(P＜0.01),IRAK1/4 抑制劑組較DSS 組則相對減少(P＜0.01,圖3)。 表明IRAK1/4 抑制劑可減輕腸道炎癥。

圖3 結(jié)腸組織中炎性細胞因子的表達

4.蛋白免疫印記法檢測結(jié)腸組織中腸道屏障功能相關(guān)蛋白(ZO-1、occludin、claudin-1、JAM-A)的表達情況。 與空白組比較,DSS 組小鼠結(jié)腸ZO-1、occludin、claudin-1、JAM-A 蛋白表達顯著減少(P＜0.01),而IRAK1/4 抑制劑組的上述蛋白減輕程度均較DSS 組低(P＜0.01,圖4A、B)。

5.RT-PCR 檢測各組小鼠腸道黏蛋白(mucin-1、mucin-2)mRNA 的表達水平。 DSS 組與IRAK1/4抑制劑組的mucin-1 和mucin-2 表達水平均較空白組顯著減少(P＜0.01),但IRAK1/4 抑制劑組較DSS 組減少程度輕(P＜0.01,圖4C)。

圖4 各組屏障功能相關(guān)蛋白的表達

討 論

潰瘍性結(jié)腸炎是一種慢性復(fù)發(fā)性腸道炎癥疾病,其發(fā)病機制尚不完全清楚,但腸道黏膜損害和免疫異常在發(fā)病過程中起著不良效應(yīng)?，F(xiàn)行的治療多采用5-ASA、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑等抑制腸道炎性反應(yīng),隨著對腸道黏膜屏障功能的進一步認識,維持腸道黏膜屏障完整為治療UC 提供了新的思路[13]。

完整的腸黏膜對維持腸道功能和健康起著重要作用,在保護機體免受潛在有害致病微生物入侵的同時,維持機體的營養(yǎng)吸收和免疫感知功能。 腸上皮屏障由黏液層、上皮細胞和細胞間緊密連接組成,以維持腸道功能的完整和免疫穩(wěn)態(tài)[8]。 上皮黏液層由上皮杯狀細胞釋放的黏蛋白組成,是抵御病原體入侵的第一道防線,阻止細菌直接接觸上皮細胞[14]。 腸上皮細胞也表達跨膜黏蛋白,這些黏蛋白仍然附著在頂端表面,并與糖脂質(zhì)一起形成糖脂屏障層[15]。 細胞間緊密連接蛋白由跨膜蛋白和細胞內(nèi)膜或支架蛋白組成,是位于腸上皮細胞連接復(fù)合體頂端的細胞間復(fù)合體,在上皮細胞通透性中發(fā)揮主要作用[16～18]。

腸道黏膜屏障完整性的喪失是IBD 的一個特征。 腸道通透性增加可能是炎癥性腸病發(fā)病機制中的一個初始事件,使細菌等衍生的相關(guān)低分子進入黏膜并激起不可控的炎癥級聯(lián)信號[8]。 TNF-α、IFN-γ和白細胞介素都在緊密連接完整性調(diào)控中起著關(guān)鍵作用[19]。 對于TNF-α,抗TNF-α 單抗在IBD 中所表現(xiàn)出的優(yōu)秀臨床療效已經(jīng)足以表明其在IBD 發(fā)病機制中的相關(guān)突出作用,該抗體可減輕IBD 嚴重程度,恢復(fù)腸道屏障功能[20]。 通過抗TNF-α 治療恢復(fù)上皮屏障功能可能反映免疫系統(tǒng)受損的黏膜愈合情況; IFN-γ 被認為可改變肌動蛋白-肌球蛋白細胞骨架與緊密連接蛋白的相互作用,影響腸道屏障功能[21～23]。 無論細胞的能量水平如何,IFN-γ 也可以通過降低腺苷一磷酸活化蛋白激酶(AMPK)依賴通路中ZO-1 和occludin 的表達來誘導(dǎo)屏障通透性的增加[24]。 這兩種細胞因子的同時存在通過緊密連接蛋白的分離對腸道完整性產(chǎn)生不利影響。

細胞間緊密連接的破壞可增加結(jié)腸對有害致病微生物和毒素的通透性,引起腸道炎性反應(yīng),并發(fā)展成UC[25]。 UC 患者腸道屏障功能受損,腸壁通透性增加,使得病原體和毒素等有害物質(zhì)通過腸壁,進一步激活炎癥系統(tǒng),合成促炎性細胞因子,促進UC 的發(fā)展。 此外,產(chǎn)生的炎性細胞因子進一步加劇了上皮屏障功能的破壞,兩者形成惡性循環(huán),加劇腸道炎癥[18,26]。 與既往研究相似,本實驗中DSS 組小鼠結(jié)腸炎性細胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ)活性表達顯著增強,結(jié)腸黏膜緊密連接蛋白(ZO-1、occludin、claudin-1、JAM-A)和黏蛋白(mucin-1/2)的mRNA 表達均顯著降低,表明腸道炎癥發(fā)生的同時,腸道屏障功能受損。 而經(jīng)過IRAK1/4 抑制劑干預(yù)后在一定程度上逆轉(zhuǎn)了上述情況,說明抑制IRAK1/4 活性可在一定程度上緩解炎癥,維持腸道屏障的完整性。

本研究僅對IRAK1/4 抑制劑對結(jié)腸炎小鼠IRAK1/4 活性藥理抑制的基本作用進行了初步分析,探討了IRAK1/4 活性抑制與腸道炎癥和改善腸道屏障功能之間的關(guān)系。 雖然一定濃度的IRAK1/4 抑制劑可以有效緩解DSS 誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎,目前也有IRAK1/4 相關(guān)抑制劑在風濕性疾病和血液病中的臨床試驗,尚不清楚這些藥物在IBD 患者中使用是否安全有效。 因此,需要進一步的實驗研究將這些結(jié)果轉(zhuǎn)化為UC 患者的臨床應(yīng)用。

綜上所述,腸道屏障缺陷不僅是一種疾病表現(xiàn),并增強了對腸道屏障缺失致病機制的關(guān)注和在IBD治療管理中的研究。 筆者通過DSS 成功誘導(dǎo)小鼠實驗性結(jié)腸炎模型,并證明IRAK1/4 抑制劑對小鼠結(jié)腸炎和腸道屏障具有保護作用,但其作用機制仍需進一步研究。