環(huán)氧化酶抑制劑對壓力超負荷性心肌肥厚大鼠的作用及機制研究

王靜文 魏明慧 孫浩榮 蔣碧輝 薛明明

心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)是造成我國居民死亡和疾病負擔的首要病因,而血壓升高是CVD 中最常見的潛在危險因素[1,2]。 壓力超負荷性心肌肥厚(pressure-overload induced cardiac hypertrophy,POH)是對高血壓的適應(yīng)性和代償機制,早期階段心肌細胞增大、蛋白質(zhì)合成增多、肌節(jié)增長,從而維持心室功能[3～5]。 然而,持續(xù)的壓力超負荷會使心臟進入失代償階段,并促使心肌細胞凋亡和纖維化重構(gòu),收縮和舒張功能障礙,最終導(dǎo)致心力衰竭[6]。

環(huán)氧化酶(cyclooxygenase,COX)有兩個異構(gòu)體,COX-1 介導(dǎo)生理性前列腺素形成,COX-2 存在于炎癥部位,受外界細胞因子刺激時大量表達[7]。 非選擇性COX 抑制劑阿司匹林和特異性COX-2 抑制劑塞來昔布可通過抑制COX-2 實現(xiàn)解熱、抗炎和鎮(zhèn)痛作用[8,9]。 Notch 信號通路由Notch 跨膜受體、跨膜配體和細胞內(nèi)效應(yīng)器分子組成。 當配體與胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合時,促進NICD 胞內(nèi)釋放和核移位,調(diào)節(jié)下游靶基因Hes1 的表達[10]。 有研究證實,Notch 信號通路通過Notch1 受體調(diào)節(jié)心臟對壓力的反應(yīng),對心臟具有保護作用[11]。

目前關(guān)于阿司匹林和塞來昔布抗壓力超負荷性心肌肥厚作用的機制報道甚少,本實驗擬探究阿司匹林和塞來昔布是否通過Notch1 信號通路緩解壓力超負荷介導(dǎo)的心肌肥厚。

材料與方法

1.實驗動物及細胞株：SPF 級雄性Wistar 大鼠60只,體質(zhì)量為200 ±20g,由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學實驗動物研究中心提供,動物合格證號：SCXK(蒙)2014-0011;大鼠H9c2(2-1)心肌細胞,購自中國科學院細胞庫(上海)。

2.主要試劑與儀器：阿司匹林腸溶片購自中國辰欣藥業(yè)股份有限公司;塞來昔布膠囊購自中國輝瑞制藥有限公司;乙酰水楊酸購自上海易恩化學技術(shù)有限公司;塞來昔布購自美國Biovision 公司;免疫組化試劑盒、Notch1 抗體、Hes1 抗體購自北京博奧森有限公司;RNAiso Plus Total RNA 試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司;RevertAidTM第一鏈cDNA 合成試劑盒購自賽默飛世爾科技(中國) 有限公司;SYBR Green PCR 試劑盒購自日本TaKaRa 公司;ANP、Hes1蛋白抗體購自英國Abcam 公司;Notch1 蛋白抗體購自美國CST 公司。 無創(chuàng)尾動脈血壓儀(BP-300A)購自中國四川成都泰盟科技有限公司;超聲心動圖檢測儀(ACUSON SC2000)購自德國Siemens 公司;機械牽張裝置(Mechano Culture FX2)購自美國Cellscale公司。

3.動物模型的制備和分組：大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、模型+阿司匹林組(簡稱阿司匹林組)和模型+塞來昔布組(簡稱塞來昔布組)。 腹主動脈縮窄術(shù)(abdominal aortic constriction,AAC)以及給藥劑量參考文獻[12],于第8、10、12 周觀察實驗指標。

4.無創(chuàng)血壓測量：取材前進行血壓測量,記錄平均收縮壓(arterial systolic blood pressure,SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure,DBP)和心率(heart rate,HR)。

5.左心室質(zhì)量指數(shù)測定：稱取體質(zhì)量,取出心臟后預(yù)冷0.9%氯化鈉溶液沖洗殘余血液,濾紙吸干,迅速分離左心室,稱重并計算左心室質(zhì)量指數(shù)(left ventricular mass index,LVMI)。

6.超聲心動圖檢測：取材前行超聲心動圖檢測,采集左心室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左心室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening,LVFS)、左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular internal diameter at end-diastole,LVIDd)、左心室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular internal diameter at end-systole,LVIDs)、左心室舒張末期容積(left ventricular volume at end-diastole,LVEVd)和左心室收縮末期容積(left ventricular volume at end-systole,LVEVs)。

7.免疫組織化學染色及定量：按免疫組化試劑盒說明書步驟操作。 孵育Notch1、Hes1 抗體,400 倍視野下,獲得每張圖像的3 個隨機場。

8.qRT-PCR：提取心肌組織的總RNA,反轉(zhuǎn)錄cDNA 為模板進行熒光定量PCR。 各基因相對表達量用2-ΔΔCt表示。 引物序列詳見表1。

表1 qRT-PCR 引物序列

9.細胞培養(yǎng)與分組：H9c2 細胞隨機分為正常對照組、機械牽張(mechanical stretch,MS)組、MS + 阿司匹林組、MS +塞來昔布組、阿司匹林對照組和塞來昔布對照組。 20% 水平牽張力牽張細胞2h 誘導(dǎo)肥大,藥物干預(yù)濃度分別為2mmol/L 阿司匹林和25μmol/L 塞來昔布。

10.細胞轉(zhuǎn)染：Lipo8000TM介導(dǎo)Notch1 小干擾RNA(siRNA-Notch1)轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染后將細胞接種于彈性硅膠皿中,藥物干預(yù)同上。 轉(zhuǎn)染后分為正常對照組、MS 組、MS + 阿司匹林組、MS + 阿司匹林+ si-Notch1 組、MS + 塞來昔布組、MS + 塞來昔布+ si-Notch1 組、阿司匹林對照組、塞來昔布對照組和si-Notch1 組。

11.Western blot 法檢測：BCA 法蛋白定量后SDS-PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗(1 ∶1000 稀釋)和熒光二抗(1∶1000 稀釋),掃描條帶,ImageJ 定量分析灰度值。

12.統(tǒng)計學方法：應(yīng)用GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。 計量資料以均數(shù)± 標準差(±s)表示。 組間比較采用Tukey事后檢驗的方差單因素分析,以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1.阿司匹林和塞來昔布可減輕POH 大鼠心臟形態(tài)的變化：模型組LVMI 較假手術(shù)組升高,提示壓力超負荷性心肌肥厚大鼠造模成功;給藥10、12 周后LVMI 較模型組降低(P均＜0.05,表2)。

表2 各組大鼠左心室質(zhì)量指數(shù)(n =5,±s)

表2 各組大鼠左心室質(zhì)量指數(shù)(n =5,±s)

與同時間假手術(shù)組比較,*P ＜0.05;與同時間模型組比較,#P ＜0.05

時間假手術(shù)組模型組阿司匹林組塞來昔布組8 周3.72 ±0.06 4.44 ±0.18* 4.22 ±0.194.29 ±0.14 10 周 3.84 ±0.16 4.64 ±0.10* 4.09 ±0.07# 4.21 ±0.07#12 周 3.55 ±0.06 4.69 ±0.09* 3.85 ±0.21# 3.99 ±0.07#

2.阿司匹林和塞來昔布可抑制POH 大鼠心臟功能的下降和動脈血壓升高：M 型超聲心動圖的代表性圖像(圖1)。 模型組LVEF 和LVFS 較假手術(shù)組降低,LVIDd、LVIDs、LVEVd、LVEVs 較假手術(shù)組升高,給藥10、12 周后LVEF、LVFS 較模型組升高,LVIDd、LVIDs、LVEVd、LVEVs 較模型組降低(P均＜0.05,圖2)。 取材前測量動脈血壓,模型組SBP、DBP、HR 較假手術(shù)組升高,給藥后這些參數(shù)趨于正常(P均＜0.05,表3)。

表3 各組大鼠的血壓參數(shù)(±s,n =5)

表3 各組大鼠的血壓參數(shù)(±s,n =5)

與同時間假手術(shù)組比較,*P ＜0.05;與同時間模型組比較,#P ＜0.05

時間組別SBP(mmHg)DBP(mmHg)HR(次/分)假手術(shù)組92.29±3.1176.95±7.11293.20±19.16 8 周模型組119.03±4.96* 100.51±2.90* 399.80±16.76*阿司匹林組 105.17±4.96#86.57±5.41# 319.40±28.86#塞來昔布組 102.84±5.69#85.26±8.23# 310.40±27.58#10 周假手術(shù)組93.01±8.5481.90±4.76301.20±27.13模型組135.17±12.28* 107.90±10.93* 397.60±11.11*阿司匹林組 103.42±4.25#85.77±5.91# 306.00±11.75#塞來昔布組 104.29±6.05#87.68±7.39# 318.40±22.69#12 周假手術(shù)組94.80±8.0178.94±6.42307.00±21.99模型組144.37±11.14* 118.31±7.28* 405.40±18.77*阿司匹林組93.58±5.51#79.18±6.88# 310.40±11.96#塞來昔布組 100.33±7.85#83.97±9.30# 306.40±10.93#

圖1 M 型超聲心動圖的代表性圖像(實線箭頭所示為LVIDd,虛線箭頭所示為LVIDs)

圖2 各組大鼠M 型超聲檢測結(jié)果(n =5,±s,*P ＜0.05)

3.阿司匹林和塞來昔布上調(diào)POH 大鼠的Notch1信號通路：免疫組化染色結(jié)果顯示,模型組Notch1 和Hes1 蛋白表達較假手術(shù)組降低,給藥后Hes1 蛋白較模型組表達升高,阿司匹林組(10、12 周)和塞來昔布組(12 周)Notch1 蛋白較模型組表達升高(P均＜0.05,圖3 中A 和B)。 qRT-PCR 結(jié)果顯示,模型組Notch1 和Hes1mRNA 表達較假手術(shù)組降低,給藥后Notch1 和Hes1mRNA 較模型組表達升高(P均＜0.05,圖3 中C 和D)。

圖3 阿司匹林和塞來昔布對Notch1 信號通路的影響

4.阿司匹林和塞來昔布通過上調(diào)Notch1 信號通路緩解MS 誘導(dǎo)的細胞肥大：藥物干預(yù)MS 誘導(dǎo)的心肌細胞48h 可降低ANP 蛋白的表達(P均＜0.05,圖4)。 MS 組Notch1 和Hes1 蛋白表達較正常對照組降低,藥物干預(yù)后Notch1 和Hes1 蛋白表達較MS 組增加(P均＜0.05,圖5)。

圖4 Western blot 法檢測阿司匹林和塞來昔布干預(yù)時間

圖5 Western blot 法檢測阿司匹林和塞來昔布對Notch1 信號通路的影響

5.敲低Notch1 的表達抑制了阿司匹林和塞來昔布對MS 誘導(dǎo)細胞肥大的保護作用以及對Notch1信號通路的影響：與MS +阿司匹林組比較,MS + 阿司匹林+si-Notch1 組ANP 蛋白顯著升高,塞來昔布亦如此(P均＜0.05,圖6A);與MS + 阿司匹林組比較,MS + 阿司匹林+ si-Notch1 組Notch1、Hes1 蛋白顯著降低,塞來昔布亦如此(P均＜0.05,圖6 中B 和C)。

圖6 Western blot 法檢測敲低Notch1 后對ANP 蛋白和Notch1 信號通路的影響

討 論

體內(nèi)實驗與體外實驗共同揭示了阿司匹林和塞來昔布抗壓力超負荷性心肌肥厚的分子機制。 阿司匹林和塞來昔布顯著減輕了AAC 誘導(dǎo)的大鼠心肌肥厚和MS 誘導(dǎo)的H9c2 心肌細胞肥大。 體內(nèi)實驗與體外實驗結(jié)果一致,表明阿司匹林和塞來昔布上調(diào)了Notch1 及其下游靶基因Hes1 的表達。 敲低Notch1的表達顯著逆轉(zhuǎn)了阿司匹林和塞來昔布抗心肌肥厚的作用以及其對Notch1 信號通路的調(diào)控。

壓力超負荷性心肌肥厚的發(fā)生機制盡管還沒有完全明確,但主要由于高血壓所造成的血液壓力超負荷,從而促使心肌細胞蛋白質(zhì)合成、肌節(jié)數(shù)量以及單個心肌細胞體積的增加[13]。 壓力超負荷性心肌肥厚隨著時間的推移,往往伴隨著心臟形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的改變,本研究采用8、10 和12 周3 個時間點進行觀察。

M 型超聲心動圖評價大鼠心功能,AAC 可誘導(dǎo)大鼠左心室肥厚和左心功能下降,具體表現(xiàn)為舒張末期和收縮末期LVID、LVEV 升高以及LVEF、LVFS 下降。 給藥10 和12 周后上述現(xiàn)象可被緩解,因此阿司匹林和塞來昔布可改善AAC 誘導(dǎo)大鼠左心室肥厚和左心功能下降。 動脈血壓與LVMI 測定結(jié)果也同樣證實了這一點,且肥厚心肌形態(tài)的改變要早于結(jié)構(gòu)和功能的改變。

既往研究表明,機械牽張引發(fā)的壓力超負荷會促進炎性反應(yīng)導(dǎo)致心肌肥厚[14]。 Notch1 作為機械壓力感受性蛋白,它的激活可保護心肌細胞免受損傷,反之加劇心肌肥厚和纖維化[15]。 為了進一步探究Notch1 信號通路以及其是否在阿司匹林和塞來昔布的抗心肌肥厚過程中起關(guān)鍵作用,本實驗于藥物處理前后對Notch1 信號通路表達進行檢測,并通過轉(zhuǎn)染小干擾RNA 敲低Notch1 表達。 結(jié)果表明,在AAC 誘導(dǎo)的心肌肥厚大鼠和MS 誘導(dǎo)的肥大細胞中Notch1、Hes1 表達下調(diào),阿司匹林和塞來昔布能夠部分恢復(fù)Notch1 信號通路,而敲低Notch1 后其通路被阻斷,心肌肥厚標志物ANP 的表達顯著上調(diào),反向驗證了阿司匹林和塞來昔布對心肌肥厚的抑制可能是通過上調(diào)Notch1 信號通路實現(xiàn)的。

綜上所述,阿司匹林和塞來昔布通過激活Notch1信號通路對壓力超負荷性心肌肥厚發(fā)揮保護作用。 在未來研究中,環(huán)氧化酶抑制劑對機械壓力感受性蛋白Notch1 表達的具體調(diào)控機制仍有待于進一步研究。