Box-Behnken響應(yīng)面結(jié)合基準(zhǔn)關(guān)聯(lián)度和AHP-熵權(quán)法優(yōu)化經(jīng)典名方半夏瀉心湯的提取工藝

樊簫雨，楊凱麗，李花花，楊麒琳，楊天姿，白 潔，杜守穎

Box-Behnken響應(yīng)面結(jié)合基準(zhǔn)關(guān)聯(lián)度和AHP-熵權(quán)法優(yōu)化經(jīng)典名方半夏瀉心湯的提取工藝

樊簫雨，楊凱麗，李花花，楊麒琳，楊天姿，白 潔*，杜守穎*

北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488

評(píng)價(jià)現(xiàn)代工藝與傳統(tǒng)制法制得產(chǎn)品質(zhì)量的一致性，從質(zhì)量源于設(shè)計(jì)的理念出發(fā)，應(yīng)用Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)合基準(zhǔn)關(guān)聯(lián)度和層次分析法（AHP）-熵權(quán)法，確定經(jīng)典名方半夏瀉心湯（Banxia Xiexin Decoction，BXD）的提取工藝參數(shù)。以BXD中小檗堿、黃芩苷、甘草酸含量及出膏率和指紋圖譜相似度為關(guān)鍵質(zhì)量屬性，以料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)為關(guān)鍵工藝參數(shù)，采用單因素實(shí)驗(yàn)確定各因素水平，Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)、基準(zhǔn)關(guān)聯(lián)度和AHP-熵權(quán)法確定指標(biāo)權(quán)重系數(shù)，進(jìn)行綜合評(píng)分。根據(jù)綜合評(píng)分建立函數(shù)模型，反映各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，優(yōu)化提取工藝參數(shù)并進(jìn) 行驗(yàn)證。Box-Behnken響應(yīng)面連用基準(zhǔn)關(guān)聯(lián)度和AHP-熵權(quán)法建立的工藝評(píng)價(jià)函數(shù)模型：綜合評(píng)分＝SR出膏率×41.7%＋SR小檗堿×41.5%＋SR黃芩苷×6.1%＋SR甘草酸×5.2%＋SR指紋圖譜相似度×5.5%，該模型穩(wěn)定可靠，確定最佳提取工藝為全方飲片加7倍量水，提取0.5 h，提取1次。驗(yàn)證試驗(yàn)綜合評(píng)分均值為87.37，RSD為2.09%，符合基準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的要求，且方法具有適用性。篩選的BXD現(xiàn)代提取工藝參數(shù)具有可行性，為其他經(jīng)典名方的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

半夏瀉心湯；質(zhì)量源于設(shè)計(jì)；提取工藝；基準(zhǔn)關(guān)聯(lián)度；層次分析法；信息熵權(quán)法；Box-Behnken響應(yīng)面；小檗堿；黃芩苷；甘草酸

半夏瀉心湯（Banxia Xiexin Decoction，BXD）出自東漢張仲景的《傷寒雜病論》，2018年選入《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》[1]。書中記載“半夏半升（洗），黃芩、干姜、人參、甘草（炙）各三兩，黃連一兩，大棗十二枚（擘）。上七味，以水一斗，煮取六升，去滓，再煎取三升，溫服一升，日三 服”[2]。具有平調(diào)寒熱、散結(jié)消痞之功，用于治療小柴胡湯證誤下所致的脾胃受損、邪陷心下、胃氣痞塞而寒熱互結(jié)之痞證。現(xiàn)代臨床常用于治療胃潰瘍、胃炎、糖尿病胃輕癱、胃食管反流病、胃癌術(shù)后狀態(tài)等消化系統(tǒng)疾病[3-6]。2022年8月1日，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布《古代經(jīng)典名方關(guān)鍵信息表（25首方劑）（征求意見稿）》[7]，公布了BXD的關(guān)鍵信息，對(duì)方中所用飲片規(guī)格、用法用量及煎煮方法做以詳細(xì)說明。

根據(jù)2021年8月國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心發(fā)布的《按古代經(jīng)典名方目錄管理的中藥復(fù)方制劑藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》[8]（簡(jiǎn)稱《原則》），要求經(jīng)典名方的開發(fā)利用需按照國(guó)家發(fā)布的古代經(jīng)典名方關(guān)鍵信息及古籍記載，研究、制備基準(zhǔn)物質(zhì)，制劑質(zhì)量應(yīng)與制得基準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量基本保持一致，從而確定商業(yè)規(guī)模的制劑生產(chǎn)工藝。但考慮到現(xiàn)代工業(yè)化大生產(chǎn)過程難以與古法記載提取工藝保持一致，使經(jīng)典名方現(xiàn)代生產(chǎn)工藝制劑質(zhì)量與傳統(tǒng)制法保持一致仍存在很多困難。因此需摒棄傳統(tǒng)提取工藝設(shè)計(jì)默認(rèn)各指標(biāo)最高即為最優(yōu)的原則，以基準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量作為參比標(biāo)準(zhǔn)。而基準(zhǔn)物質(zhì)有多個(gè)質(zhì)控指標(biāo)，在工藝考察時(shí)需同時(shí)滿足各指標(biāo)的質(zhì)量要求，以往常用的試錯(cuò)性的研究就不再適用，這使得實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)需綜合考慮各因素的影響。因此在經(jīng)典名方的開發(fā)中，既要考慮經(jīng)典名方整體用藥的中醫(yī)特色，又要滿足制劑評(píng)價(jià)指標(biāo)多，質(zhì)量范圍明確的要求。為合理開發(fā)經(jīng)典名方，本實(shí)驗(yàn)從質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（quality by design，QbD）的理念出發(fā)，加強(qiáng)對(duì)制劑源頭及過程的控制，將樣品質(zhì)量控制從成品檢驗(yàn)移至前期工藝設(shè)計(jì)及生產(chǎn)過程中，從設(shè)計(jì)層次保證制劑質(zhì)量[9]。通過引入基準(zhǔn)關(guān)聯(lián)度（standard relation，SR）和層次分析（analytic hierarchy process，AHP）-熵權(quán)法，將基準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)量設(shè)為標(biāo)準(zhǔn)值，將測(cè)得值與之相比，計(jì)算SR，SR越接近100%，表明制得制劑與基準(zhǔn)物質(zhì)越接近，說明該工藝參數(shù)下制得制劑與基準(zhǔn)物質(zhì)最相符[10]。同時(shí)利用AHP-熵權(quán)法將中醫(yī)用藥的君臣佐使原則與各指標(biāo)含量對(duì)制劑質(zhì)量的影響程度相結(jié)合。根據(jù)處方中不同藥味的重要程度選擇測(cè)量指標(biāo)，對(duì)其進(jìn)行主觀賦權(quán)，然后再對(duì)主觀賦權(quán)確定的各指標(biāo)測(cè)量結(jié)果進(jìn)行分析，根據(jù)各指標(biāo)對(duì)制劑質(zhì)量的影響程度進(jìn)行客觀賦權(quán)。該方法在常規(guī)客觀比較含量高低的維度之上，從經(jīng)典名方中醫(yī)用藥的角度出發(fā)，對(duì)方中的君藥、臣藥、使藥分別主觀賦權(quán)，從2個(gè)維度確定測(cè)定指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)，以獲得更為真實(shí)可靠的測(cè)定結(jié)果，最終確定最佳工藝。這一思路既考慮了經(jīng)典名方開發(fā)中需保持與基準(zhǔn)物質(zhì)一致的要求，又體現(xiàn)了中醫(yī)用藥整體性的特點(diǎn)，對(duì)方中不同藥味的作用以權(quán)重側(cè)重，為經(jīng)典名方類制劑的開發(fā)提供了思路。

1 儀器與材料

1.1 儀器

JM-B100002型電子天平，萬分之一，余姚市紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司；賽多利斯BSA224S型電子分析天平，千分之一，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；華美冠藥煲，江西省華冠瓷業(yè)有限公司；HH6-型電熱恒溫水浴鍋、MH-2000型可調(diào)式電熱套2000 mL、MH-3000可調(diào)式電熱套3000 mL、MH-5000可調(diào)式電熱套5000 mL北京科偉永興儀器有限公司；H22-X3型九陽電陶爐，杭州九陽生活電器有限公司；屹立QE-200型高速萬能離心機(jī)、DZF-6051型真空干燥器，北京利康達(dá)圣科技有限公司；QE-100型高速粉碎機(jī)，浙江屹立工貿(mào)有限公司；BY-400C-1型醫(yī)用離心機(jī)、SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；KQ5200DA型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；Thermo Fisher U3000型高效液相色譜儀，DAD檢測(cè)器，CM7.2色譜工作站，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。

1.2 試藥

對(duì)照品黃芩苷（批號(hào)110715-202122，質(zhì)量分?jǐn)?shù)94.2%）、鹽酸小檗堿（批號(hào)110713-202015，質(zhì)量分?jǐn)?shù)85.9%）、甘草酸銨（批號(hào)110731-202021，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.2%）均購(gòu)自于中國(guó)食品藥品檢定研究院。乙腈、甲醇、磷酸和三乙胺均為色譜純，購(gòu)自Thermo Scientific服務(wù)科學(xué)-賽默飛世爾中國(guó)公司；無水甲醇和無水乙醇均為分析級(jí)，購(gòu)自北京化工廠；純凈水，購(gòu)自杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。

炒甘草（批號(hào)1-20200804）購(gòu)自寧夏昊翔有限公司，清半夏（批號(hào)1-20011403）、黃芩（批號(hào)1-19030403）、干姜（批號(hào)19022826）、人參（批號(hào)1-19112601）、黃連（批號(hào)1-19031910）、大棗（批號(hào)20030908）均由河北萬歲藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)趙婷講師鑒定，清半夏為天南星科半夏屬植物半夏Breit.的干燥塊莖、黃芩為唇形科黃芩屬植物黃芩Georgi的干燥根、干姜為姜科姜屬植物姜Rosc.的干燥根莖、人參為五加科人參屬植物人參C. A. Mey.的干燥根和根莖、炒甘草為豆科甘草屬植物甘草Fisch.的干燥根和根莖、黃連為毛茛科黃連屬植物黃連Franch.的干燥根莖、大棗為鼠李科棗屬植物棗Mill.的干燥成熟果實(shí)，均符合《中國(guó)藥典》2020年版[11]飲片標(biāo)準(zhǔn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 BXD基準(zhǔn)物質(zhì)的制備

稱取清半夏55.2 g，黃芩41.4 g，干姜41.4 g，人參41.4 g，炒甘草41. 4 g，黃連13.8 g，大棗36.0 g于陶瓷鍋中，加水2000 mL，武火加熱至沸騰后，文火煎煮至藥液為1200 mL，趁熱濾過，濾液用文火煎煮至藥液體積至600 mL，得BXD水煎液。

根據(jù)《原則》[8]中的要求，基準(zhǔn)樣品一般為濃縮浸膏或干燥品，可考慮采用低溫濃縮、冷凍干燥等方法制備。故選用冷凍干燥法制備BXD基準(zhǔn)物質(zhì)。精密移取制得BXD水煎液5 mL于25 mL的西林瓶中，于?20 ℃預(yù)冷凍12 h，迅速轉(zhuǎn)移至?80 ℃的真空冷凍干燥機(jī)（提前預(yù)冷2 h）中，設(shè)置凍干溫度?80 ℃，真空度（3±1）Pa，干燥72 h后取出，即得BXD基準(zhǔn)物質(zhì)。

2.2 出膏率的測(cè)定

量取制得BXD提取液200 mL，置于恒定質(zhì)量的250 mL干燥蒸發(fā)皿中，水浴濃縮至稠膏，置于真空干燥箱中，60 ℃真空干燥72 h，稱定干膏質(zhì)量，經(jīng)公式（1）計(jì)算后，即得半夏瀉心湯的實(shí)際出膏率。

全方出膏率＝/(200) （1）

為200 mL提取液中干膏質(zhì)量，為提取液總體積；為投料飲片質(zhì)量

2.3 指紋圖譜的測(cè)定

2.3.1 色譜條件 參考課題組前期研究結(jié)果[12]。色譜柱為Thermo Hypersil Glod C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-0.05%三乙胺水溶液（磷酸調(diào)pH 2.2），梯度洗脫：0～8 min，3%甲醇；8～15 min，3%～10%甲醇；15～28 min，10%～23%甲醇；28～53 min，23%甲醇；53～73 min，23%～29%甲醇；73～80 min，29%～38%甲醇；80～85 min，38%甲醇；85～107 min，38%～53%甲醇；107～120 min，53%～71%甲醇；120～130 min，71%甲醇；體積流量為1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為345 nm；進(jìn)樣量為5 μL；柱溫30 ℃。

2.3.2 供試品溶液的制備

（1）BXD基準(zhǔn)物質(zhì)供試品溶液：取制得的BXD基準(zhǔn)物質(zhì)，精密加入5 mL去離子水于西林瓶中，密封，超聲（250 W、40 kHz）15 min，使其充分溶解，取出，放冷，搖勻后，取4 mL于10 mL離心管中10 000 r/min離心10 min，取上清液，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得BXD基準(zhǔn)物質(zhì)供試品溶液。

（2）BXD水煎液供試品溶液：精密量取制得的水煎液5 mL于10 mL離心管中，10 000 r/min離心10 min，取上清液，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得水煎液供試品溶液。

2.3.3 指紋圖譜的建立及相似度分析 分別取“2.3.2”項(xiàng)下制得基準(zhǔn)物質(zhì)供試品溶液及水煎液供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定指紋圖譜。將色譜結(jié)果以cdf.的格式導(dǎo)入2012年版《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》進(jìn)行評(píng)價(jià)，因黃芩苷色譜峰峰面積較大，在特征圖譜里貢獻(xiàn)度較高，使得整個(gè)特征圖譜因黃芩苷的貢獻(xiàn)度大而相似度高，難以反映特征圖譜的真實(shí)情況。因此首先對(duì)黃芩苷峰進(jìn)行Mark峰匹配，比較黃芩苷峰的差異性，若無明顯差異，再剔除黃芩苷，以中位數(shù)法，時(shí)間窗寬度為0.1 s的模式進(jìn)行全譜峰匹配，計(jì)算指紋圖譜的相似度。

2.4 黃芩苷和小檗堿含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件 同“2.3.1”項(xiàng)下。

2.4.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取黃芩苷對(duì)照品18.65 mg于50 mL量瓶中，加70%乙醇溶解并定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為351.366 μg/mL的黃芩苷對(duì)照品溶液。精密稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品10.48 mg于100 mL量瓶中，加入70%乙醇溶解并定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為90.023 2 μg/mL的鹽酸小檗堿母液；再精密移取5 mL至50 mL量瓶中，加入70%乙醇溶解并定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為9.00 μg/mL的鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備 同“2.3.2（2）”項(xiàng)下。

2.4.4 樣品測(cè)定取“2.4.2”項(xiàng)下制得對(duì)照品溶液及“2.4.3”項(xiàng)下制得供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定黃芩苷及小檗堿含量。

2.5 甘草酸含量測(cè)定

2.5.1 色譜條件 參照《中國(guó)藥典》2020年版[11]一部甘草項(xiàng)下含量測(cè)定色譜條件。色譜柱為Thermo Hypersil Glod C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.05%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～8 min，19%乙腈；8～35 min，19%～50%乙腈；35～36 min，50%～100%乙腈；36～40 min，100%～19%乙腈；體積流量為1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為237 nm；進(jìn)樣量為5 μL；柱溫30 ℃。

2.5.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取甘草酸銨對(duì)照品10.20 mg于100 mL量瓶中，加70%乙醇溶解并定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為102.00 μg/mL的甘草酸對(duì)照品溶液。

2.5.3 供試品溶液的制備 同“2.3.2（2）”項(xiàng)下。

2.5.4 樣品測(cè)定 取“2.5.2”項(xiàng)下制得對(duì)照品溶液及“2.5.3”項(xiàng)下制得供試品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定甘草酸含量。

2.6 BXD基準(zhǔn)物質(zhì)的測(cè)定

取制得基準(zhǔn)物質(zhì)，按“2.2”～“2.5”項(xiàng)下方法測(cè)定BXD基準(zhǔn)物質(zhì)的出膏率及各指標(biāo)成分含量，課題組前期建立基準(zhǔn)物質(zhì)出膏率及指標(biāo)性成分含量范圍及本實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果見表1，其中含量范圍的上下限參考《原則》[8]中相關(guān)要求：干膏率的波動(dòng)范圍一般不超過均值的±10%，指標(biāo)成分的含量波動(dòng)范圍一般不超過均值的±30%。高效液相色譜圖如圖1所示。

2.7 單因素考察提取時(shí)間、加水倍量對(duì)BXD提前效果的影響

2.7.1 提取時(shí)間 依次稱取處方量的飲片于5 L圓底燒瓶中，加入10倍處方量的去離子水進(jìn)行回流提取，分別提取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，測(cè)定提取液中黃芩苷、小檗堿、甘草酸含量及出膏率，確定提取時(shí)間的低水平及高水平，結(jié)果如表2所示。黃芩苷和甘草酸含量均呈先上升后下降趨勢(shì)，黃芩苷含量在1.5 h時(shí)達(dá)到峰值，甘草酸在1.0 h時(shí)達(dá)到峰值；小檗堿含量呈上升趨勢(shì)。出膏率在0.5 h時(shí)較低，1.0～2.5 h無明顯區(qū)別，3.0 h時(shí)較高。結(jié)合不同指標(biāo)成分在基準(zhǔn)物質(zhì)中的含量，最終確定提取時(shí)間的高低水平分別為1.5、0.5 h。

表1 BXD基準(zhǔn)物質(zhì)中指標(biāo)成分含量及出膏率

Table 1 Index component content and paste rate of standard reference of BXD

基準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)/(mg?g?1)出膏率/% 小檗堿黃芩苷甘草酸 前期實(shí)驗(yàn)均值0.3509.2832.33816.06 下限0.2017.5791.71014.32 上限0.37214.0753.17617.50 本實(shí)驗(yàn) 0.28710.8272.44315.91

圖1 本實(shí)驗(yàn)(S)和前期實(shí)驗(yàn)(R)制備的BXD基準(zhǔn)物質(zhì)的HPLC圖

表2 提取時(shí)間考察結(jié)果

Table 2 Results of extraction time

提取時(shí)間/h質(zhì)量分?jǐn)?shù)/(mg?g?1)出膏率/% 黃芩苷小檗堿甘草酸 0.511.609±0.1060.052±0.0013.245±0.00616.580±0.028 1.013.194±0.0640.544±0.0043.558±0.00420.370±0.042 1.513.471±0.0080.769±0.0033.458±0.00220.010±0.035 2.013.305±0.0040.896±0.0083.346±0.00520.130±0.035 2.512.241±0.0040.930±0.0023.266±0.00520.270±0.057 3.012.421±0.0031.107±0.0043.169±0.00922.530±0.092

2.7.2 料液比 依次稱取處方量的飲片于圓底燒瓶中，分別以料液比為1∶5、1∶7、1∶9、1∶11、1∶13、1∶15加水提取，提取1.5 h，測(cè)定提取液中黃芩苷、小檗堿、甘草酸含量及出膏率，確定料液比的低水平及高水平，結(jié)果如表3所示。隨著料液比的增加，各指標(biāo)成分及出膏率呈上升趨勢(shì)，未見峰值出現(xiàn)，參考不同指標(biāo)成分在基準(zhǔn)物質(zhì)中的含量，最終確定料液比的高低水平分別為1∶9及1∶5。

表3 不同料液比條件下指標(biāo)性成分含量及出膏率

Table 3 Index component content and paste rate under different solid-liquid ratio

料液比質(zhì)量分?jǐn)?shù)/(mg?g?1)出膏率/% 黃芩苷小檗堿甘草酸 1∶58.668±0.0040.461±0.0021.768±0.00314.090±0.028 1∶710.926±0.0050.613±0.0062.554±0.00516.910±0.028 1∶911.784±0.0010.635±0.0027.826±7.07519.670±0.035 1∶1113.054±0.0040.698±0.0013.066±0.00421.370±0.028 1∶1313.323±0.0030.694±0.0033.388±0.00221.790±0.021 1∶1514.211±0.0020.794±0.0043.647±0.00422.880±0.035

2.8 BXD提取工藝參數(shù)的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）關(guān)鍵質(zhì)量屬性（critical quality attributes，CQAs）和關(guān)鍵工藝參數(shù)（critical process parameters，CPPs）的確定：結(jié)合BXD的臨床應(yīng)用及實(shí)際操作性，選擇3個(gè)指標(biāo)成分含量（黃芩苷、小檗堿、甘草酸）、出膏率及指紋圖譜相似度作為BXD制劑工藝的CQAs。選擇料液比（1）、提取時(shí)間（2）、提取次數(shù)（3）作為BXD制劑提取工藝的CPPs[13]。

（2）Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)：根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)考察結(jié)果，確定料液比及提取時(shí)間的范圍，提取次數(shù)根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)需求及經(jīng)驗(yàn)分別設(shè)計(jì)為1、2、3次。依次稱取處方量的飲片進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)，選取料液比、提取時(shí)間和提取次數(shù)3個(gè)影響因素，設(shè)置3個(gè)水平17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析，其中12個(gè)析因點(diǎn)，5個(gè)中心點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及結(jié)果見表4。

2.9 SR的原理方法

2.9.1 確定評(píng)價(jià)對(duì)象 SR可用于評(píng)價(jià)樣品與基準(zhǔn)物質(zhì)相似度的關(guān)鍵參數(shù)，需首先確定樣品評(píng)價(jià)的指標(biāo)數(shù)目與樣品數(shù)目[10]，基本研究路線如圖2所示。本研究將Box-Behnken設(shè)計(jì)生成的17個(gè)樣品和基準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行對(duì)比，以黃芩苷、小檗堿、甘草酸的含量、出膏率及指紋圖譜相似度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以X、S為評(píng)價(jià)對(duì)象，X表示Box-Behnken設(shè)計(jì)的第（＝1，2，…，）個(gè)樣本的第（＝1，2，…，）個(gè)指標(biāo)下的測(cè)量值，S表示基準(zhǔn)物質(zhì)的第（＝1，2，…，）個(gè)指標(biāo)下的測(cè)量值。

2.9.2 計(jì)算相對(duì)偏差（relative deviation，RD）值 RD表示第（＝1，2，…，）個(gè)樣本的第（＝1，2，…，）個(gè)指標(biāo)下的RD，RD越小則表明代表X相對(duì)于S的偏差越小，即該條件下制得樣品質(zhì)量與基準(zhǔn)物質(zhì)相似度更高。

計(jì)算公式如公式（2）所示，計(jì)算結(jié)果表明，當(dāng)以小檗堿、甘草酸和出膏率為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，與基準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)量最為接近的是試驗(yàn)12；當(dāng)以黃芩苷為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，與基準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)量最為接近的是試驗(yàn)9；當(dāng)以指紋圖譜相似度為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，與基準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)量最為接近的是試驗(yàn)2。由此可得，當(dāng)以單一因素為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，試驗(yàn)所得最優(yōu)結(jié)果會(huì)根據(jù)評(píng)價(jià)指標(biāo)的變化而變化，因此需進(jìn)行綜合評(píng)分后才能確定最佳提取工藝參數(shù)（表5）。

RD＝|－|/（2）

2.9.3 計(jì)算SR由于經(jīng)計(jì)算RD獲得的最優(yōu)工藝會(huì)根據(jù)評(píng)價(jià)指標(biāo)的變化而變化，無法進(jìn)行綜合評(píng)分，因此在RD的基礎(chǔ)上引入SR。SR表示第（＝1，2，…，）個(gè)樣本的第（＝1，2，…，）個(gè)指標(biāo)下的基準(zhǔn)關(guān)聯(lián)度。即以基準(zhǔn)物質(zhì)為標(biāo)準(zhǔn)值（），以Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)下的各樣品為測(cè)得值（），以不同的指標(biāo)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，按公式（3）計(jì)算得到SR，SR越接近1，在該指標(biāo)下的工藝參數(shù)制得的樣品與基準(zhǔn)物質(zhì)相似度越高，結(jié)果如表6所示。下一步即可采用AHP-熵權(quán)法確定各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)，進(jìn)行綜合評(píng)分。

表4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

Table 4 Box-Behnken experimental design and results

編號(hào)因素質(zhì)量分?jǐn)?shù)/(mg?g?1)出膏率/%指紋圖譜相似度綜合評(píng)分 x1x2/hx3/次小檗堿黃芩苷甘草酸 11∶5 (?1)0.5 (?1)2 (0)0.48214.1022.96324.08 0.93663.35 21∶51.0 (0)1 (?1)0.496 9.663 1.913 16.47 0.98367.09 31∶51.5 (+1)20.607 13.893 3.101 27.47 0.92643.51 41∶51.03 (+1)0.629 15.295 3.536 30.57 0.93137.75 51∶9 (+1)1.030.937 15.928 4.324 31.91 0.909?10.21 61∶91.521.037 16.395 4.150 30.76 0.902?24.46 71∶91.010.573 12.693 3.067 19.88 0.92451.72 81∶90.520.483 17.495 3.587 26.10 0.93759.31 91∶7 (0)1.510.536 10.874 2.646 19.42 0.29632.96 101∶70.530.751 16.150 3.870 28.42 0.92219.28 111∶71.531.177 16.066 3.978 33.91 0.881?46.12 121∶70.510.395 10.217 2.360 16.49 0.92880.66 131∶71.020.830 16.034 3.548 25.79 0.97711.81 141∶71.020.891 15.868 3.769 26.43 0.9772.39 151∶71.020.849 16.766 3.650 26.89 0.9828.26 161∶71.020.922 16.256 3.868 26.73 0.975?2.71 171∶71.020.943 16.853 3.649 27.86 0.977?5.93

圖2 方法流程圖

SR＝1－RD（3）

2.10 AHP-熵權(quán)法組合權(quán)重的計(jì)算

2.10.1 AHP主觀賦權(quán)

（1）構(gòu)建判斷矩陣：根據(jù)君臣佐使原則[14]，并結(jié)合各成分實(shí)際測(cè)得性及穩(wěn)定性對(duì)評(píng)價(jià)指標(biāo)的重要性進(jìn)行排序。半夏瀉心湯方中半夏辛溫，散結(jié)消痞，降逆止嘔，為君藥。干姜辛熱以溫中祛寒；黃芩、黃連苦寒以清熱燥濕，均為臣藥。君臣相伍，辛開苦降，平調(diào)寒熱。人參、大棗、炒甘草益氣健脾，為佐藥。炒甘草兼調(diào)藥性，為使藥。諸藥合用，寒熱除，升降復(fù)，氣機(jī)暢，則痞滿消[15-16]。根據(jù)《原則》要求[8]，根據(jù)BXD中的處方組成，結(jié)合各味藥中指標(biāo)性成分的實(shí)際測(cè)得性和穩(wěn)定性，因君藥半夏的成分多為氨基酸類成分，進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析的難度較大，故選擇臣藥黃芩中的黃芩苷、黃連中的小檗堿，及使藥中的甘草酸為指標(biāo)性成分，同時(shí)兼顧出膏率和指紋圖譜。通過出膏率反映提取工藝的穩(wěn)定性，指紋圖譜體現(xiàn)制劑過程中小分子成分的輪廓及定性特征。根據(jù)不同指標(biāo)中所包含的質(zhì)量信息，根據(jù)AHP理論判斷矩陣1～9標(biāo)度，對(duì)同一層次內(nèi)個(gè)指標(biāo)的相對(duì)重要程度進(jìn)行打分，見表7。因方中君藥半夏、臣藥干姜及人參大棗均未選擇指標(biāo)性成分，故通過出膏率綜合反映藥效成分的提取程度，其重要程度最高。小檗堿為臣藥黃連中的有效成分，且含量易受藥材差異的影響，需引起重點(diǎn)關(guān)注。黃芩苷為臣藥黃芩中的有效成分，較甘草酸明顯重要。但考慮到指紋圖譜可全面反映處方中所有藥味的綜合特征，故將其重要程度等同于甘草酸，因此各指標(biāo)的重要程度排序?yàn)槌龈嗦剩拘￠迚A＞黃芩苷＞甘草酸≈指紋圖譜相似度。故將出膏率相對(duì)小檗堿標(biāo)為4，相對(duì)黃芩苷標(biāo)為5，相對(duì)甘草酸及指紋圖譜相似度標(biāo)為6，以此類推。根據(jù)公式（4）構(gòu)建判斷矩陣，數(shù)據(jù)見表8，用a表示因素相對(duì)于因素的比較結(jié)果。

表5 Box-Behnken設(shè)計(jì)RDij值

Table 5 RDij value of Box-Behnken design

試驗(yàn)號(hào)RDij 小檗堿黃芩苷甘草酸出膏率指紋圖譜相似度 10.680.300.210.510.06 20.730.110.220.040.02 31.110.280.270.730.07 41.190.410.450.920.07 52.260.470.771.010.09 62.610.510.700.930.10 71.000.170.260.250.08 80.680.620.470.640.06 90.870.000.080.220.70 101.620.490.580.790.08 113.100.480.631.130.12 120.380.060.030.040.07 131.890.480.450.620.02 142.100.470.540.660.02 151.960.550.490.690.02 162.210.500.580.680.03 172.290.560.490.750.02

表6 Box-Behnken設(shè)計(jì)SRij值

Table 6 SRij value of Box-Behnken design

試驗(yàn)號(hào)SRij 小檗堿黃芩苷甘草酸銨出膏率指紋圖譜相似度 132.0669.7578.7148.6593.60 227.1889.2578.3196.4898.30 3?11.5071.6873.0727.3492.60 4?19.1658.7355.267.8693.10 5?126.4852.8923.00?0.5790.90 6?161.3248.5730.136.6690.20 70.3582.7774.4675.0592.40 831.7138.4153.1735.9593.70 913.2499.5791.6977.9429.60 10?61.6750.8441.5921.3792.20 11?210.1051.6137.17?13.1488.10 1262.3794.3796.6096.3592.80 13?89.2051.9154.7737.9097.70 14?110.4553.4445.7233.8897.70 15?95.8245.1550.5930.9998.20 16?121.2549.8641.6731.9997.50 17?128.5744.3450.6324.8997.70

表7 AHP構(gòu)建判斷矩陣標(biāo)準(zhǔn)

Table7 Criterion of constructing judgment matrix of AHP

標(biāo)度含義 1表示2個(gè)因素相比，具有相同重要性 3表示2個(gè)因素相比，前者比后者稍重要 5表示2個(gè)因素相比，前者比后者明顯重要 7表示2個(gè)因素相比，前者比后者強(qiáng)烈重要 9表示2個(gè)因素相比，前者比后者極端重要 2、4、6、8表示上述相鄰判斷的中間值 倒數(shù)若因素e與因素f的重要性之比為aef，那么因素f與因素e重要性之比為afe＝1/aef

（2）計(jì)算主觀權(quán)重系數(shù)（WS）：首先對(duì)判斷矩陣進(jìn)行幾何平均（方根法），按公式（5）計(jì)算得到初始權(quán)重系數(shù)（W′），a表示第（＝1，2，…，）個(gè)指標(biāo)因素對(duì)第（＝1，2，…，）個(gè)指標(biāo)因素的比較結(jié)果，然后按照公式（6）計(jì)算歸一化WS，得到5個(gè)指標(biāo)的WS，結(jié)果見表9。

W′＝(a1a2…a)1/n（5）

表8 指標(biāo)成對(duì)比較的判斷優(yōu)先矩陣

Table8 Decision matrix of paired comparison on indexes

評(píng)價(jià)指標(biāo)出膏率小檗堿黃芩苷甘草酸指紋圖譜相似度 出膏率14566 小檗堿1/41344 黃芩苷1/51/3122 甘草酸1/61/41/211 指紋圖譜相似度1/61/41/211

表9 組合權(quán)重

Table 9 Weight value of indices

評(píng)價(jià)指標(biāo)WjSWjOWj 出膏率0.530.170.417 小檗堿0.230.390.415 黃芩苷0.110.120.061 甘草酸銨0.070.160.052 指紋圖譜相似度0.070.170.055

（3）一致性檢驗(yàn)：對(duì)矩陣進(jìn)行一致性檢驗(yàn)。首先根據(jù)公式（7）計(jì)算最大特征根（max），再根據(jù)公式（8）計(jì)算一致性指標(biāo)（consistency index，CI），得到CI為0.04，一致性比例（consistency ratio，CR）（CR＝CI/RI，RI為自由度指標(biāo)）為0.03，均小于0.1，表明該矩陣具有一致性[10]。

CI＝(max－)/(－1) （8）

2.10.2 信息熵客觀賦權(quán)

（1）建立Box-Behnken試驗(yàn)原始數(shù)據(jù)矩陣：現(xiàn)有個(gè)樣本，個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)，原始數(shù)據(jù)矩陣＝(X)×n，以出膏率、小檗堿、黃芩苷、甘草酸含量及指紋圖譜相似度5個(gè)指標(biāo)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，建立原始數(shù)據(jù)矩陣（）。

（2）將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為概率矩陣：根據(jù)公式（9）將原始數(shù)據(jù)矩陣轉(zhuǎn)化為概率矩陣（），P表示第個(gè)指標(biāo)下第個(gè)樣本的概率。

（3）計(jì)算各個(gè)指標(biāo)的信息熵（H）和客觀權(quán)重系數(shù)（WO）：按公式（10）計(jì)算各指標(biāo)的H依次為0.993 1、0.983 7、0.994 1、0.993 5、0.993 2。H越小表示指標(biāo)下的數(shù)據(jù)離散程度越高，則其提供的信息量就越大[10]。再按公式（11）計(jì)算各指標(biāo)WO，結(jié)果見表9。

2.10.3 組合權(quán)重系數(shù)（W）的確定 采用AHP得到WS，熵權(quán)法得到WO，根據(jù)公式（12）計(jì)算各個(gè)指標(biāo)的W，結(jié)果見表9。

2.11 綜合評(píng)分

由AHP-熵權(quán)法算得綜合權(quán)重系數(shù)可知，出膏率占比41.7%，指標(biāo)性成分小檗堿含量占比41.5%，黃芩苷含量占比6.1%，甘草酸銨含量占比5.2%，指紋圖譜相似度占比5.5%，因此，得出綜合評(píng)分計(jì)算公式，見公式（13）。計(jì)算結(jié)果見表4綜合評(píng)分項(xiàng)，綜合評(píng)分越接近100，則表明對(duì)應(yīng)工藝參數(shù)下所得樣品質(zhì)量與基準(zhǔn)物質(zhì)更為接近，Box-Behnken試驗(yàn)中得分最高的試驗(yàn)組為第12組，試驗(yàn)條件為加入7倍處方量的水，提取1次，提取0.5 h，得分80.66。

綜合評(píng)分＝SR出膏率×41.7%＋SR小檗堿×41.5%＋SR黃芩苷×6.1%＋SR甘草酸×5.2%＋SR指紋圖譜相似度×5.5% （13）

2.12 提取工藝的優(yōu)化與驗(yàn)證

將綜合評(píng)分結(jié)果輸入Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)表進(jìn)行模型擬合，方差分析結(jié)果見表10。根據(jù)方差分析結(jié)果，2次多項(xiàng)式模型極顯著，失擬項(xiàng)不顯著，說明該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可用于表示各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系。其中，1和3的＜0.001，2的＜0.05，表明提取次數(shù)、提取時(shí)間和料液比對(duì)綜合評(píng)分的影響均顯著。影響順序?yàn)樘崛〈螖?shù)＞提取時(shí)間＞料液比。23的＜0.05，表明料液比與提取時(shí)間有顯著交互作用。建立的多元線性回歸方程為＝2.76－28.971－16.922－27.093－8.1512－4.4313－15.9823＋10.0512＋23.7822＋8.8932，2＝0.973 2。生成綜合評(píng)分的等高線及響應(yīng)面分析見圖3。

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)生成模型進(jìn)行預(yù)測(cè)，得出最佳工藝為加水7倍量，提取0.5 h，提取1次，預(yù)測(cè)工藝與實(shí)際試驗(yàn)結(jié)果相符。為評(píng)價(jià)該提取方法的普遍適用性，對(duì)優(yōu)化后的工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。通過平行3次試驗(yàn)，測(cè)定小檗堿、黃芩苷、甘草酸含量，出膏率及指紋圖譜相似度，計(jì)算綜合評(píng)分，結(jié)果見表11。經(jīng)驗(yàn)證，所得樣品綜合評(píng)分均值為87.37，較Box-Behnken試驗(yàn)中同等實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)得綜合評(píng)分值高，與基準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)量接近，且符合《原則》[8]中對(duì)制劑生產(chǎn)研究的要求。綜合評(píng)分的RSD值為2.09%，說明該方法確定的提取工藝穩(wěn)定可靠且重復(fù)性較好。

表10 Box-Behnken設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果

Table 10 Results of Box-Behnken design analysis of variance

誤差來源偏差平方和自由度F值P值顯著性 模型19 648.42928.260.000 1極顯著 x16 712.50186.88＜0.000 1極顯著 x22 289.44129.630.001 0極顯著 x35 870.50175.98＜0.000 1極顯著 x1x2265.4213.440.106 2 x1x378.4011.010.347 3 x2x31 021.66113.220.008 3極顯著 x12424.9215.500.051 5 x222 380.71130.810.000 9極顯著 x32332.5314.300.076 7 失擬項(xiàng)323.1931.980.259 2不顯著

圖3 各因素x1、x1、x1對(duì)綜合評(píng)分影響的響應(yīng)面及等高線圖

表11 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

Table 11 Results of verification experiments

序號(hào)質(zhì)量分?jǐn)?shù)/(mg?g?1)出膏率/%指紋圖譜相似度綜合評(píng)分RSD/% 小檗堿黃芩苷甘草酸銨 10.29110.3301.99916.610.92585.272.09 20.31110.0291.98916.250.92388.30 30.29910.4012.05915.500.92788.54

3 討論

BXD作為平調(diào)寒熱、散結(jié)消痞這一治法的代表方劑，在防治胃癌、急性腸胃炎、慢性胃炎等消化系統(tǒng)疾病方面具有顯著療效[17-19]，極具開發(fā)價(jià)值。因此在前期確定BXD的處方、用法及制法等關(guān)鍵信息的研究基礎(chǔ)上，課題組按照古法記載傳統(tǒng)工藝制備標(biāo)準(zhǔn)湯液，并按國(guó)家相關(guān)規(guī)定制備基準(zhǔn)物質(zhì)，建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

但在BXD的實(shí)際開發(fā)和工業(yè)生產(chǎn)中，無法按照古法進(jìn)行提取制備，而且因?yàn)樘崛∪萜鳌⑻崛》绞降淖兓?，?huì)導(dǎo)致處方中成分煎出的變化，無法保證與基準(zhǔn)物質(zhì)的一致性。因此為了經(jīng)典名方的開發(fā)利用，急需建立1種與古法制得制劑質(zhì)量一致的制備方法。

本研究以BXD為研究對(duì)象，嚴(yán)格遵循《原則》的要求[8]，堅(jiān)持QbD的理念，通過Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案。為實(shí)現(xiàn)現(xiàn)代制劑與古法制備的一致性，運(yùn)用AHP-熵權(quán)法綜合評(píng)價(jià)制得制劑，將客觀賦權(quán)與主觀賦權(quán)相結(jié)合，綜合考慮中藥組方君臣佐使的原理及提取工藝對(duì)不同指標(biāo)的影響后確定指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)，建立評(píng)分函數(shù)，該函數(shù)兼具全面性和系統(tǒng)性。同時(shí)結(jié)合Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，建立函數(shù)預(yù)測(cè)模型，優(yōu)化提取工藝，并對(duì)預(yù)測(cè)工藝進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果良好，且具有普遍適用性。最終確定BXD的現(xiàn)代提取工藝為加水7倍處方量，加熱回流提取0.5 h，提取1次。該提取工藝是與古法最為接近的現(xiàn)代提取工藝，由此確定BXD的現(xiàn)代工藝生產(chǎn)參數(shù)。

基于QbD理念結(jié)合基準(zhǔn)關(guān)聯(lián)度和AHP-熵權(quán)法確定權(quán)重，通過Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與建模優(yōu)選出的提取工藝參數(shù)穩(wěn)定可靠，且對(duì)不同批次的飲片具有適用性，符合經(jīng)典名方“傳承精華、古為今用、古今銜接”的基本研究原則[20]，完成了BXD由古法制備到現(xiàn)代化工業(yè)生產(chǎn)的關(guān)鍵一步，為BXD的開發(fā)利用提供了有力支持，同時(shí)也為其他經(jīng)典名方的開發(fā)利用提供參考。

志謝：研究用藥材及飲片除炒甘草外均由河北外歲藥業(yè)有限公司提供。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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[20] 國(guó)家中醫(yī)藥管理局. 關(guān)于發(fā)布《古代經(jīng)典名方關(guān)鍵信息考證原則》《古代經(jīng)典名方關(guān)鍵信息表(7首方劑)》的通知 [EB/OL]. (2020-11-10) [2021-11-04]. http://kjs. satcm.gov.cn/zhengcewenjian/2020-11-10/18132.html.

Optimization of extraction process for classical prescription Banxia Xiexin Decoction based on Box-Behnkendesign-response surface, standard relation and analytic hierarchy process combined with entropy method

FAN Xiao-yu, YANG Kai-li, LI Hua-hua, YANG Qi-lin, YANG Tian-zi, BAI Jie, DU Shou-ying

School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China

To evaluate the consistency of the quality of preparations manufactured by modern technology and traditional methods, starting from the concept that quality by design, the extraction process parameters of the classic famous prescription Banxia Xiexin Decoction (半夏瀉心湯, BXD) were determined by using Box-Behnken design-response surface method combined with standard relation and analytic hierarchy process (AHP) - entropy method.The content of berberine, baicalin and glycyrrhizic acid, extraction rate and the similarity of fingerprints were taken as the key evaluation indexes, the solid-liquid ratio, the extraction time and the extraction times were taken as the experimental factors, the different levels of each factor were determined by single factor test. Box-Behnken design-response surface method, standard relation and AHP entropy method were used to determine the weight and conduct comprehensive scoring. According to the comprehensive score, a functional model was established to reflect the relationship between each factor and comprehensive score, and the extraction process parameters were optimized and verified.A process evaluation function model was established by using Box-Behnken experimental design combined with standard relation and AHP - entropy method as follow: comprehensive score = SRpaste yield× 41.7% + SRberberine× 41.5% + SRbaicalin× 6.1% + SRglycyrrhizinic acid× 5.2% + SRfingerprint similarity× 5.5%. The function model was stable and reliable. The optimal extraction process was to add seven times of water to the whole decoction pieces, extract for 0.5 h and once. The average score of the validation test was 87.37, and the RSD was 2.09%, which met the requirements of the reference material standard, and the method was applicable.The modern extraction parameters of BXD screened by this method were feasible, wich provided a theoretical basis for the development and utilization of other classic prescriptions.

Banxia Xiexin Decoction; quality by design; extraction process; standard relation; analytic hierarchy process; information entropy method; Box-Behnken design-response surface method; berberine; baicalin; glycyrrhizic acid

R283.6

A

0253 - 2670(2022)21 - 6716 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.21.008

2022-05-17

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2021YFE0201000）

樊簫雨，女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幮聞┬团c新技術(shù)。E-mail: xfanxiaoyu@163.com

白 潔，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥新劑型與新技術(shù)研究。Tel: (010)84738657 E-mail: baijie22811@163.com

杜守穎，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥新劑型與新技術(shù)研究。Tel: (010)84738615 E-mail: Dushouying@263.net

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]