基于近、中紅外光譜的熱毒寧注射液制劑過(guò)程投料和二次熱處理工序快速檢測(cè)方法研究

童 楓，徐芳芳，張 欣，李執(zhí)棟，吳 云，章晨峰，王振中

基于近、中紅外光譜的熱毒寧注射液制劑過(guò)程投料和二次熱處理工序快速檢測(cè)方法研究

童 楓1，徐芳芳2, 3*，張 欣2, 3，李執(zhí)棟2, 3，吳 云2, 3，章晨峰2, 3，王振中2, 3*

1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023 2. 江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001 3. 中藥制藥過(guò)程新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222001

應(yīng)用近紅外光譜（near-infrared reflectance spectroscopy，NIRS）與中紅外光譜（mid-infrared reflectance spectroscopy，MIRS）技術(shù)，對(duì)熱毒寧注射液（Reduning Injection，RI）制劑過(guò)程的投料和二次熱處理工序中6種質(zhì)控指標(biāo)進(jìn)行快速檢測(cè)，提高制劑過(guò)程的質(zhì)量控制水平。利用NIRS透射技術(shù)與MIRS衰減全反射技術(shù)，結(jié)合偏最小二乘法（partial least squares，PLS），經(jīng)過(guò)光譜預(yù)處理方法的優(yōu)選以及波段篩選，分別建立綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、梔子苷、斷氧化馬錢子苷和固含量的快速預(yù)測(cè)模型，以校正集相關(guān)系數(shù)（cal）、驗(yàn)證集相關(guān)系數(shù)（pre）、校正均方根誤差（root mean square error of calibration，RMSEC）、交叉驗(yàn)證均方根誤差（root mean square error of cross validation，RMSECV）、預(yù)測(cè)相對(duì)誤差（relative standard error of prediction，RSEP）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，評(píng)價(jià)模型性能。NIRS預(yù)測(cè)模型的6個(gè)質(zhì)控指標(biāo)的RMSEC和RMSECV均小于0.3，RSEP小于4.0%；MIRS預(yù)測(cè)模型的6個(gè)質(zhì)控指標(biāo)的RMSEC和RMSECV均小于0.4，RSEP均小于5.0%，建立的PLS模型具有模型性能好、預(yù)測(cè)精度高的優(yōu)點(diǎn)。NIRS及MIRS分析技術(shù)，均可用于RI投料和二次熱處理工序中6種質(zhì)控指標(biāo)的快速檢測(cè)，模型RSEP在5%以內(nèi)，方法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果可靠。

近紅外光譜；中紅外光譜；熱毒寧注射液；制劑過(guò)程；光譜預(yù)處理；波段篩選；偏最小二乘法；綠原酸；新綠原酸；隱綠原酸；梔子苷；斷氧化馬錢子苷；固含量

熱毒寧注射液（Reduning Injection，RI）是江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司的獨(dú)家品種，由青蒿、金銀花、梔子3味藥材制得，具有清熱、疏風(fēng)、解毒的功效，常用于上呼吸道感染所致的高熱、微惡風(fēng)寒、頭身痛、咳嗽、痰黃等癥狀及抑制流感病毒[1-2]。在中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第九版）》中，針對(duì)重型、危重型新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）患者推薦的中成藥中，RI也名列其中[3]。

RI的生產(chǎn)過(guò)程可以分為提取、精制和制劑過(guò)程，目前，利用近紅外光譜（near-infrared reflectance spectroscopy，NIRS）或中紅外光譜（mid-infrared reflectance spectroscopy，MIRS）技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)，針對(duì)RI提取、精制過(guò)程的快速檢測(cè)已較為成熟，并取得一定的應(yīng)用效果[4-8]。但是，基于NIRS和MIRS的RI制劑過(guò)程的快速檢測(cè)研究尚未見報(bào)道。因此，基于RI的制劑過(guò)程，研究合適的快速檢測(cè)方法，可為RI制劑過(guò)程的質(zhì)量控制水平的提升提供技術(shù)支撐。NIRS以及MIRS作為過(guò)程分析技術(shù)的典型代表，近年來(lái)發(fā)展迅速。與傳統(tǒng)的化學(xué)分析方法相比，這2種光譜分析方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）可同時(shí)用于定性和定量分析；（2）分析速度快，只需掃描得出光譜即可測(cè)定樣品中的各種成分；（3）不使用化學(xué)試劑，不損害樣品，對(duì)環(huán)境友好；（4）分析成本低，操作簡(jiǎn)單[9-11]。

投料和二次熱處理工序指的是投料和二次熱處理2個(gè)連續(xù)工序，即在一定的溫濕度以及壓力下，依次將梔子提取物以及青金提取物投入到合并一定比例的注射用水和鹽酸的配液罐中，待冷卻后轉(zhuǎn)移至冷藏罐；冷藏罐內(nèi)藥液通過(guò)板框過(guò)濾器濾過(guò)至熱配間熱配罐中，調(diào)節(jié)蒸氣壓力以及藥液溫度，一段時(shí)間后對(duì)藥液進(jìn)行冷卻。

投料和二次熱處理工序作為RI制劑過(guò)程的初始工序，在實(shí)際生產(chǎn)中，會(huì)出現(xiàn)提取物溶解不充分等情況，導(dǎo)致有效成分的損失，直接影響最后的成品質(zhì)量，因此，亟需引入1種快速檢測(cè)方法，降低生產(chǎn)過(guò)程控制風(fēng)險(xiǎn)。本實(shí)驗(yàn)將NIRS和MIRS技術(shù)與化學(xué)計(jì)量學(xué)結(jié)合，首次應(yīng)用于RI制劑過(guò)程，建立投料和二次熱處理工序6種關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)的偏最小二乘（partial least squares，PLS）定量校正模型，實(shí)現(xiàn)對(duì)綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、梔子苷、斷氧化馬錢子苷及固含量的快速測(cè)定。

1 材料與儀器

1.1 材料

59批次的投料工序樣本（批號(hào)Z220123～Z2201240、Z220201～Z220232、Z220301～Z220309）及對(duì)應(yīng)批次的59批次的二次熱處理工序樣本，共118批次樣品，由江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司水針車間提供。對(duì)照品綠原酸（批號(hào)110753-202018，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.1%）、梔子苷（批號(hào)110749-201919，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.1%）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；對(duì)照品新綠原酸（批號(hào)DSTDX001503，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.58%）、斷氧化馬錢子苷（批號(hào)DST211224-111，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.87%）購(gòu)自成都樂美天醫(yī)藥-德思特生物技術(shù)有限公司；隱綠原酸對(duì)照品（批號(hào)ST07850120，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.04%）購(gòu)自上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 儀器

UltiMate 3000型高效液相色譜儀、Antaris II型傅立葉變換NIRS儀，配有透射檢測(cè)器、采樣軟件以及Result、CAMO等數(shù)據(jù)處理軟件，（賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司）；React IR 702L型MIRS儀、XP6型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；BSA 224S-CW型萬(wàn)分之一電子天平，德國(guó)Sartorius公司；KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；Milli-Q Academic型純水機(jī)，美國(guó)Millipore公司。

1.3 數(shù)據(jù)處理軟件

采用Unscramble X 10.4（挪威Camo Analytics公司）軟件進(jìn)行光譜預(yù)處理；采用GraphPad Prism 8.0（美國(guó)GraphPad Software）繪圖；采用Matlab R2018a（美國(guó)MathWorks公司）軟件進(jìn)行樣本劃分、波段篩選及模型構(gòu)建。

2 方法與結(jié)果

2.1 NIRS的采集

以空氣為掃描背景，采用NIRS技術(shù)于室溫下采集光譜，選擇1 mm比色皿，光譜掃描范圍4000～10 000 cm?1，掃描次數(shù)為64次，分辨率4 cm?1，衰減器選擇B模塊，1倍增益，每個(gè)樣品采集3次，取平均光譜，得到59批投料工序樣本及59批二次熱處理工序樣本，共計(jì)118個(gè)樣本。NIRS結(jié)果見圖1。

2.2 MIRS的采集

在室溫條件下，使用光纖探頭掃描樣品，以空氣為掃描背景；光譜掃描范圍3000～650 cm?1；掃描次數(shù)32次；分辨率8 cm?1；增益選擇“l(fā)ow”，每個(gè)樣品掃描2次，取其一作為樣本光譜，得到59批投料工序樣本及59批二次熱處理工序樣本，共計(jì)118個(gè)樣本。MIRS結(jié)果見圖2。

圖1 118批樣本的NIRS平均光譜圖

圖2 118批樣本的MIRS圖

2.3 5種質(zhì)控指標(biāo)含量的測(cè)定

2.3.1 HPLC分析色譜條件 參照崔小弟等[12]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，色譜條件設(shè)為Kromasil C18（150 mm×4.6 mm，6 μm）色譜柱；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～5 min，15%～18%乙腈；5～15 min，18%乙腈；15～38 min，18%～31%乙腈；38～38.5 min，31%～90%乙腈；38.5～40 min，90%乙腈；體積流量0.7 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫20 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)238、327 nm。

2.3.2 供試品溶液的制備 精密吸取1 mL樣品置于20 mL量瓶中，用50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.3.3 樣品測(cè)定 取118批次樣品，按照“2.3.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按照“2.3.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，每份樣品平行2次測(cè)定，取平均值，作為建模的質(zhì)控指標(biāo)含量實(shí)測(cè)值。6種質(zhì)控指標(biāo)的含量測(cè)定結(jié)果見表1。

2.4 固含量的測(cè)定

參照文獻(xiàn)方法[13-14]，稱取約5 g樣品至已烘干至恒定質(zhì)量的稱量瓶（0）中，稱定質(zhì)量（1），置烘箱105 ℃條件下烘干5 h至恒定質(zhì)量，計(jì)為2。

表1 樣本中6種質(zhì)控指標(biāo)統(tǒng)計(jì)值(n = 2)

Table 1 Statistical values of six quality control indicators in samples (n = 2)

質(zhì)控指標(biāo)質(zhì)量濃度/(mg·mL?1)固含量/% 綠原酸新綠原酸隱綠原酸梔子苷斷氧化馬錢子苷 最小值8.768 82.066 82.304 312.285 41.116 27.295 3 下四分位數(shù)9.405 62.349 42.601 212.791 31.178 77.765 5 上四分位數(shù)10.279 12.619 42.898 014.254 11.432 78.221 8 最大值10.606 12.809 43.052 015.311 11.506 98.725 7 均值9.851 82.478 32.740 813.633 51.302 37.995 1

固含量＝(2－0)/(1－0)

2.5 校正集與驗(yàn)證集的劃分

采用Kennard-Stone（K-S）劃分法[15]，將收集的59批投料工序樣品以及對(duì)應(yīng)批次的59批二次熱處理工序樣品，共計(jì)118批樣品，以4∶1的比例劃分為校正集和驗(yàn)證集，最終得到校正集樣本94個(gè)，驗(yàn)證集樣本24個(gè)。

2.6 光譜預(yù)處理

采集光譜時(shí)，由于受到環(huán)境溫度、濕度、儀器狀態(tài)、雜散光和隨機(jī)噪聲等因素的影響，紅外光譜會(huì)出現(xiàn)基線漂移和噪聲干擾等問題，因此，在建模前對(duì)光譜進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理是有必要的，可以有效地減少噪聲，凈化無(wú)用信息，提高模型的精度和預(yù)測(cè)效果。常見的預(yù)處理方式有：移動(dòng)平均法（moving average，MA）、Savitzky-Golay（S-G）平滑法、導(dǎo)數(shù)法（一階導(dǎo)數(shù)、二階導(dǎo)數(shù)）、矢量歸一化法、基線校正、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換（standard normal transformation，SNV）、多元散射校正（multivariate scattering correction，MSC）以及上述方法的結(jié)合。MA和S-G平滑法可以消除光譜信息中的隨機(jī)噪聲，提高信噪比；一階導(dǎo)數(shù)可以消除背景的常數(shù)平移，二階導(dǎo)數(shù)可以消除背景的線性平移，消除背景漂移造成的影響；矢量歸一化法通過(guò)增強(qiáng)光譜數(shù)據(jù)間的差異，校正由光程變化或者樣品濃度改變引起的光譜變化；基線校正可以消除儀器背景漂移對(duì)信號(hào)的影響；SNV和MSC可以消除由于樣品分布不均勻?qū)庾V造成的影響[16]。

本研究采用MA、S-G平滑、S-G 1st、基線校正、歸一化法以及SNV分別對(duì)NIRS和MIRS進(jìn)行預(yù)處理，并分別建立投料和二次熱處理工序的6種質(zhì)控指標(biāo)的PLS定量校正模型。根據(jù)模型評(píng)價(jià)指標(biāo)篩選出最佳的光譜預(yù)處理方法，使用留一交叉驗(yàn)證法確定校正模型中的最佳的潛變量數(shù)（latent variables，LVs），以預(yù)測(cè)相對(duì)誤差（relative standard error of prediction，RSEP）為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，RSEP值越小越好。一般而言，性能優(yōu)異的預(yù)測(cè)模型應(yīng)具有較高的校正集相關(guān)系數(shù)（cal）及驗(yàn)證集相關(guān)系數(shù)（pre）、較小且接近的校正均方根誤差（root mean square error of calibration，RMSEC）和交叉驗(yàn)證均方根誤差（root mean square error of cross validation，RMSECV）及較低的RSEP[17]。上述評(píng)價(jià)指標(biāo)的相關(guān)公式為式（1）～（4）。

cal＝[1－∑(－y)2/∑(－y)2]1/2（1）

pre＝[1－∑(－y)2/∑(－y)2]1/2（2）

RMSEC＝[∑(－y)2/]1/2（3）

RSEP＝[∑(－y)2/∑2]1/2（4）

、為校正集、驗(yàn)證集樣本數(shù)，為實(shí)測(cè)值，y為預(yù)測(cè)值，y、y分別為校正集和驗(yàn)證集實(shí)測(cè)值的平均值

NIRS和MIRS預(yù)處理結(jié)果見表2、3，可以發(fā)現(xiàn)：基于NIRS，當(dāng)綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、梔子苷、斷氧化馬錢子苷及固含量分別以SNV、MA、MA、無(wú)預(yù)處理、SNV和歸一化法為預(yù)處理方法時(shí)，RSEP最小，且都在4.0%以下，此時(shí)，cal與pre值較大，RMSEC與RMSECV值較小且接近；基于MIRS，當(dāng)綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、梔子苷、斷氧化馬錢子苷及固含量的預(yù)處理方法分別為無(wú)預(yù)處理、MA、MA、MA、SNV和無(wú)預(yù)處理時(shí)，模型具有較低的RSEP，均小于5%，較大的cal與pre值以及較小且接近的RMSEC與RMSECV值，從預(yù)處理方法的比較中可以猜測(cè)，在MIRS中，MA適合多數(shù)質(zhì)控指標(biāo)，可能是由于其減輕了光譜信息自身攜帶的隨機(jī)誤差，提高信噪比。

2.7 光譜波段的篩選

全光譜模型的準(zhǔn)確性和穩(wěn)健性可能會(huì)因?yàn)橐恍o(wú)關(guān)信息的存在而減弱，篩選光譜波段可以剔除無(wú)用信息，提高模型的預(yù)測(cè)精度和穩(wěn)定性。本研究在上述篩選出的最佳預(yù)處理方法的基礎(chǔ)上，對(duì)比全光譜、間隔PLS（interval PLS，iPLS）、組合間隔PLS（synergy interval PLS，siPLS）及移動(dòng)窗口PLS（moving windows PLS，mwPLS）建模的效果。

2.7.1 iPLS篩選最優(yōu)波段 iPLS是由N?rgaard等[18]提出的一種光譜區(qū)間篩選方法，通過(guò)將全光譜平均分為若干子區(qū)間，在各子區(qū)間內(nèi)以不同的潛變量數(shù)建立獨(dú)立的PLS回歸模型[19]。本研究將光譜區(qū)間均分為20個(gè)子區(qū)間，并以RMSECV作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選出最優(yōu)建模波段。

2.7.2 siPLS篩選最優(yōu)波段 siPLS是在iPLS的基礎(chǔ)上，對(duì)不同子區(qū)間進(jìn)行任意組合，建立所有可能的2、3或4個(gè)區(qū)間的PLS回歸模型[20]。本研究將光譜區(qū)間均分為20個(gè)子區(qū)間，以子區(qū)間組合數(shù)為3建立模型，以RMSECV作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選出最優(yōu)建模波段。

2.7.3 mwPLS篩選最優(yōu)波段 mwPLS的基本思想是將1個(gè)窗口沿著光譜軸連續(xù)移動(dòng)，每移動(dòng)1個(gè)波長(zhǎng)點(diǎn)，采用交叉驗(yàn)證法確定最佳潛變量數(shù)并建立相應(yīng)的PLS最優(yōu)模型[21]。本研究以全光譜波數(shù)的10%作為窗口寬度，以RMSECV作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選出最優(yōu)建模波段。

表2 NIRS不同預(yù)處理方法建模結(jié)果分析

Table 2 Analysis of modeling results of different NIRS pretreatment methods

質(zhì)控指標(biāo)預(yù)處理方法rcalRMSECRMSECVrpreRESP/%LVs質(zhì)控指標(biāo)預(yù)處理方法rcalRMSECRMSECVrpreRESP/%LVs 綠原酸無(wú)預(yù)處理0.979 80.088 10.158 50.933 31.717 515梔子苷無(wú)預(yù)處理0.975 40.187 40.257 10.974 61.100 912 MA0.976 00.096 00.164 50.924 01.828 116 MA0.979 00.203 50.276 30.972 81.168 512 S-G平滑0.975 70.096 60.159 70.926 41.788 715 S-G平滑0.972 50.197 90.269 60.974 41.120 012 S-G 1st0.982 50.082 20.186 00.922 21.818 210 S-G 1st0.998 80.041 40.290 10.948 21.551 116 基線校正0.980 00.087 80.176 40.932 01.709 315 基線校正0.974 70.189 90.274 40.975 01.132 612 歸一化法0.971 30.104 70.153 80.945 51.544 112 歸一化法0.998 90.039 80.177 00.975 51.077 620 SNV0.969 90.107 20.152 50.951 91.473 412 SNV0.999 00.038 70.175 40.974 71.086 620 新綠原酸無(wú)預(yù)處理0.834 30.096 80.127 00.829 93.934 610斷氧化馬無(wú)預(yù)處理0.973 00.030 2 0.049 1 0.960 22.573 814 MA0.811 00.101 50.130 30.846 63.777 010錢子苷MA0.984 70.023 0 0.048 7 0.947 52.860 518 S-G平滑0.818 50.099 60.128 80.843 13.820 910 S-G平滑0.984 80.023 0 0.050 2 0.956 52.708 017 S-G 1st0.957 10.050 20.118 10.686 45.084 410 S-G 1st0.993 80.014 7 0.046 8 0.965 92.546 312 基線校正0.799 00.104 30.134 50.846 93.807 19 基線校正0.993 70.014 8 0.045 5 0.963 12.556 418 歸一化法0.849 10.094 30.123 90.837 43.847 010 歸一化法0.974 40.029 7 0.047 3 0.963 82.533 114 SNV0.838 30.103 10.130 80.840 13.850 69 SNV0.973 00.030 5 0.047 1 0.968 22.294 614 隱綠原酸無(wú)預(yù)處理0.872 40.085 10.111 60.942 42.591 110固含量無(wú)預(yù)處理0.973 40.077 70.131 60.941 21.378 415 MA0.865 50.087 00.111 50.951 12.507 310 MA0.970 50.081 80.133 20.936 11.423 917 S-G平滑0.868 00.086 50.111 60.950 22.527 310 S-G平滑0.967 70.085 50.128 80.943 91.388 215 S-G 1st0.978 00.036 30.098 50.922 23.170 511 S-G 1st0.995 50.031 90.151 70.906 21.704 714 基線校正0.882 10.082 10.110 80.941 22.725 010 基線校正0.975 10.075 30.138 60.927 71.488 515 歸一化法0.881 60.082 10.108 10.949 82.548 210 歸一化法0.978 20.070 40.120 60.952 91.259 115 SNV0.885 40.080 80.106 40.945 32.551 610 SNV0.978 50.069 90.119 90.948 61.309 915

除固含量的RMSEC與RMSECV的單位為“%”外，其余5種指標(biāo)的RMSEC與RMSECV的單位均為“mg?mL?1”，下表同

except the unit of RMSEC and RMSECV of solid content is “%”, the units of RMSEC and RMSECV of the other five indicators are all “mg?mL?1”, same as the following table

表3 MIRS不同預(yù)處理方法建模結(jié)果分析

Table 3 Analysis of modeling results of different MIRS pretreatment methods

質(zhì)控指標(biāo)預(yù)處理方法rcalRMSECRMSECVrpreRESP/%LVs質(zhì)控指標(biāo)預(yù)處理方法rcalRMSECRMSECVrpreRESP/%LVs 綠原酸無(wú)預(yù)處理0.924 50.168 20.267 10.876 42.324 46梔子苷無(wú)預(yù)處理0.911 40.350 00.594 30.723 13.883 16 MA0.916 40.176 60.268 20.870 02.374 89 MA0.968 10.212 90.577 80.822 93.093 019 S-G平滑0.938 20.152 60.280 30.866 62.352 69 S-G平滑0.908 10.356 20.602 90.704 34.062 38 S-G 1st0.929 20.163 10.313 20.849 62.529 38 S-G 1st0.963 30.228 10.667 60.745 64.248 716 基線校正0.925 90.166 40.293 30.861 02.390 27 基線校正0.912 70.347 40.608 10.720 03.761 06 歸一化法0.900 10.191 90.308 80.841 82.623 86 歸一化法0.922 00.329 10.657 60.696 94.207 28 SNV0.909 90.182 70.312 60.836 82.639 76 SNV0.897 60.374 70.655 20.652 64.355 56 新綠原酸無(wú)預(yù)處理0.802 10.103 50.150 10.738 54.691 85斷氧化馬無(wú)預(yù)處理0.870 70.0650 0.1133 0.780 15.630 66 MA0.806 40.107 10.160 40.765 14.447 58錢子苷MA0.836 70.0724 0.0972 0.736 46.110 47 S-G平滑0.744 80.115 70.156 40.701 74.935 95 S-G平滑0.869 90.0652 0.1112 0.739 86.084 88 S-G 1st0.798 30.104 40.163 10.774 14.728 16 S-G 1st0.967 30.0335 0.0977 0.727 37.128 516 基線校正0.815 60.100 40.154 90.721 84.877 85 基線校正0.900 60.0576 0.1121 0.802 85.308 27 歸一化法0.812 90.100 90.144 10.750 74.566 55 歸一化法0.883 00.0620 0.1080 0.787 85.455 56 SNV0.808 90.101 90.146 20.743 34.634 85 SNV0.897 00.0584 0.1085 0.806 85.247 96 隱綠原酸無(wú)預(yù)處理0.893 60.087 80.134 20.799 64.848 55固含量無(wú)預(yù)處理0.914 60.138 50.230 20.784 22.547 06 MA0.830 80.096 90.145 00.870 24.172 68 MA0.959 30.095 70.221 90.796 62.822 916 S-G平滑0.863 50.087 70.148 10.802 04.798 07 S-G平滑0.882 00.159 90.239 10.718 92.882 66 S-G 1st0.821 60.099 10.151 40.831 94.441 3 5 S-G 1st0.922 70.121 30.265 90.775 12.748 010 基線校正0.842 70.093 70.145 10.801 74.770 05 基線校正0.901 30.147 00.241 60.765 82.596 66 歸一化法0.852 30.091 00.134 10.813 24.855 35 歸一化法0.908 80.141 40.256 20.725 12.931 17 SNV0.847 00.092 40.137 80.822 94.587 05 SNV0.910 80.139 90.253 80.707 83.010 77

2.7.4 最優(yōu)波段篩選結(jié)果 由3種波段篩選方法建立的模型與全光譜模型的性能參數(shù)對(duì)比結(jié)果見表4，以RMSEC、RMSECV和RSEP作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，綜合評(píng)價(jià)，篩選出最優(yōu)建模波段。結(jié)果表明，基于NIRS，綠原酸和斷氧化馬錢子苷的預(yù)測(cè)模型經(jīng)3種方法篩選波段后，雖然建模變量數(shù)減少，但RMSEC、RMSECV普遍增大，且RSEP均增大，模型預(yù)測(cè)性能下降，故選擇全光譜區(qū)間（3 999.64～9 999.10 cm?1）建模；新綠原酸、隱綠原酸及梔子苷預(yù)測(cè)模型，采用siPLS篩選波段后，建模變量數(shù)降為465個(gè)，cal、pre均增大，RMSEC、RMSECV均減小，且RSEP均減小，模型預(yù)測(cè)性能提升，故新綠原酸、隱綠原酸及梔子苷分別選擇4 601.32～4 900.23、 5 503.84～5 802.76、7 609.73～7 906.71 cm?1， 5 503.84～5 802.76、5 804.69～6 103.60、7 308.89～7 607.80 cm?1及4 300.48～4 599.39、5 203.00～5 501.92、5 804.69～6 103.60 cm?1作為最優(yōu)建模波段；固含量預(yù)測(cè)模型采用siPLS篩選波段后，雖然cal、pre略微減小，RSEP略微增大，但是RMSEC、RMSECV減小且接近，故固含量選擇4 300.48～ 4 599.39、5 503.84～5 802.76、7 008.05～7 306.96 cm?1作為最優(yōu)建模波段。

表4 不同波段篩選方法對(duì)NIRS及MIRS的影響

Table 4 Influences of different band screening methods on NIRS and MIRS spectra

質(zhì)控指標(biāo)光譜篩選方法ν/cm?1rcalRMSECRMSECVrpreRESP/%LVs 綠原酸NIRS全光譜3 999.64～9 999.100.969 90.107 20.152 50.951 91.473 412 siPLS4 300.48～4 599.39, 7 008.05～7 306.96,0.978 40.091 10.138 90.940 81.606 213 7 609.73～7 906.71 iPLS4 300.48～4 599.390.974 10.099 60.162 80.903 72.014 610 mwPLS4 387.26～4 987.020.922 70.169 70.194 30.923 91.865 78 MIRS全光譜3 000.00～648.000.924 50.168 20.267 10.876 42.324 46 siPLS1 572.00～1 460.00, 1 224.00～1 112.00,0.940 60.149 60.194 30.902 42.093 712 1 108.00～996.00 iPLS1 224.00～1 112.000.886 30.205 90.244 90.826 22.743 910 mwPLS1 176.00～944.000.865 50.220 60.296 30.863 32.453 411 新綠原酸NIRS全光譜3 999.64～9 999.100.811 00.101 50.130 30.846 63.777 010 siPLS4 601.32～4 900.23, 5 503.84～5 802.76,0.877 30.083 30.108 90.870 53.431 812 7 609.73～7 906.71 iPLS4 601.32～4 900.230.767 20.111 90.147 50.890 03.192 06 mwPLS6 067.60～6 676.350.673 00.128 30.145 60.762 14.545 66 MIRS全光譜3 000.00～648.000.806 40.107 10.160 40.765 14.447 58 siPLS1 456.00～1 344.00, 1 340.00～1 228.00,0.800 80.103 80.121 90.738 54.661 210 1 108.00～996.00 iPLS1 224.00～1 112.000.645 40.132 70.146 70.717 24.811 18 mwPLS1 401.00～1 172.000.767 60.129 90.147 90.790 34.317 99 隱綠原酸NIRS全光譜3 999.64～9 999.100.865 50.087 00.111 50.951 12.507 310 siPLS5 503.84～5 802.76, 5 804.69～6 103.60,0.900 60.075 70.099 30.952 62.589 510 7 308.89～7 607.80 iPLS4 601.32～4 900.230.844 40.094 40.121 10.921 73.433 07 mwPLS4 697.75～5 297.500.872 40.085 60.169 70.855 74.340 07 MIRS全光譜3 000.00～648.000.830 80.096 90.145 00.870 24.172 68 siPLS1 340.00～1 228.00, 1 108.00～996.00,0.763 80.112 30.135 10.829 44.464 46 992.00～880.00 iPLS1 224.00～1 112.000.777 90.109 50.129 80.834 24.453 09 mwPLS1 412.00～1 180.000.828 70.097 20.115 20.848 44.283 211

續(xù)表4

基于MIRS，隱綠原酸預(yù)測(cè)模型經(jīng)3種方法篩選波段后，雖然建模變量數(shù)減少，但cal、pre減小，RMSEC、RMSECV普遍增大，且RSEP增大，模型預(yù)測(cè)性能下降，故選擇全光譜區(qū)間（3 000.00～648.00 cm?1）建模；綠原酸、梔子苷、斷氧化馬錢子苷和固含量的預(yù)測(cè)模型經(jīng)采用siPLS篩選最優(yōu)波段后，建模變量數(shù)降為87個(gè)，cal、pre普遍增大，RMSEC、RMSECV較小且接近，RSEP均增大，模型預(yù)測(cè)性能提升，故綠原酸、梔子苷、斷氧化馬錢子苷和固含量分別選擇1 572.00～1 460.00、 1 224.00～1 112.00、1 108.00～996.00 cm?1， 1 572.00～1 460.00、1 340.00～1 228.00、1 108.00～996.00 cm?1，1 688.00～1 576.00、1 224.00～ 1 112.00、1 108.00～996.00 cm?1及1 456.00～ 1 344.00、1 224.00～1 112.00、1 108.00～996.00 cm?1作為最優(yōu)建模波段；新綠原酸預(yù)測(cè)模型采用mwPLS篩選最優(yōu)波段后，建模變量數(shù)降為59個(gè)，RMSEC、RMSECV較小且接近，且RSEP略微減小，模型預(yù)測(cè)性能提升，故新綠原酸選擇1 401.00～1 172.00 cm?1作為最優(yōu)建模波段。

2.8 PLS模型的建立

模型經(jīng)過(guò)光譜預(yù)處理方法的選擇、最佳的潛變量數(shù)的確定及最優(yōu)建模波段的確定后，運(yùn)用PLS分別建立了6個(gè)質(zhì)控指標(biāo)的NIRS和MIRS最佳定量校正模型，6個(gè)質(zhì)控指標(biāo)的NIRS模型預(yù)測(cè)效果均強(qiáng)于MIRS模型，故選擇6個(gè)質(zhì)控指標(biāo)的NIRS預(yù)測(cè)模型作為最優(yōu)模型，結(jié)果見表5。圖3為對(duì)應(yīng)的6種質(zhì)控指標(biāo)的最佳模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的相關(guān)性。從表5可見，對(duì)于RI制劑過(guò)程的投料和二次熱處理工序的6種質(zhì)控指標(biāo)綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、梔子苷、斷氧化馬錢子苷及固含量，利用NIRS建模，其RSEP分別為1.473 4%、3.431 8%、2.589 5%、1.070 6%、2.294 6%、1.329 8%，均小于4%。而利用MIRS建模，其RSEP分別為2.093 7%、4.317 9%、4.172 6%、2.320 5%、3.816 4%、1.720 3%，均小于5%。鑒于NIRS及MIRS模型的RMSEC及RMSECV也均令人滿意，可以認(rèn)為NIRS及MIRS模型均滿足實(shí)際運(yùn)用的需要，可以快速有效地預(yù)測(cè)投料和二次熱處理工序的6種質(zhì)控指標(biāo)的含量預(yù)測(cè)。

表5 6種質(zhì)控指標(biāo)的最優(yōu)模型性能參數(shù)

Table 5 Optimal model performance parameters of six quality control indexes

質(zhì)控指標(biāo)光譜預(yù)處理方法波段篩選LVsrcalRMSECRMSECVrpreRSEP/% 綠原酸NIRSSNV全光譜120.969 90.107 20.152 50.951 91.473 4 MIRS無(wú)預(yù)處理siPLS60.940 60.149 60.194 30.902 42.093 7 新綠原酸NIRSMAsiPLS120.877 30.083 30.108 90.870 53.431 8 MIRSMAmwPLS90.767 60.129 90.147 90.790 34.317 9 隱綠原酸NIRSMAsiPLS100.900 60.075 70.099 30.952 62.589 5 MIRSMA全光譜80.830 80.096 90.145 00.870 24.172 6 梔子苷NIRS無(wú)預(yù)處理siPLS150.989 70.125 60.252 40.975 71.070 6 MIRSMAsiPLS170.966 50.218 30.324 50.888 32.320 5 斷氧化馬錢子苷NIRSSNV全光譜140.973 00.030 5 0.047 1 0.968 22.294 6 MIRSSNVsiPLS110.930 00.048 6 0.069 1 0.892 73.816 4 固含量NIRS歸一化法siPLS130.970 20.082 20.108 10.948 31.329 8 MIRS無(wú)預(yù)處理siPLS80.903 10.145 60.166 70.899 21.720 3

圖3 最佳模型中預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的的相關(guān)性

將驗(yàn)證集的光譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入用已建立的最佳模型中，即NIRS預(yù)測(cè)模型。根據(jù)樣品的實(shí)測(cè)值和模型預(yù)測(cè)值，計(jì)算其相對(duì)誤差。綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、梔子苷、斷氧化馬錢子苷和固含量的模型預(yù)測(cè)值與樣本實(shí)測(cè)值的平均絕對(duì)偏差（mean absolute，MAD）及平均相對(duì)偏差（mean relative bais，MRB）見表6，結(jié)果顯示這6種質(zhì)控指標(biāo)的MRB均小于3.00%。

表6 驗(yàn)證集樣本在NIRS預(yù)測(cè)模型中的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的對(duì)比

Table 6 Comparison of predicted and measured values in validation set samples

質(zhì)控指標(biāo)平均絕對(duì)偏差/(mg·mL?1)平均相對(duì)偏差/% 綠原酸0.114 11.20 新綠原酸0.070 82.90 隱綠原酸0.055 32.11 梔子苷0.118 10.89 斷氧化馬錢子苷0.024 81.85 固含量0.080 21.00

3 討論

本研究首次以RI制劑過(guò)程為研究對(duì)象，采用NIRS和MIRS技術(shù)，結(jié)合PLS法，經(jīng)過(guò)光譜預(yù)處理方法及建模波段篩選，建立了投料和二次熱處理工序的綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、梔子苷、斷氧化馬錢子苷和固含量的定量預(yù)測(cè)模型。對(duì)比NIRS和MIRS模型對(duì)6種質(zhì)控指標(biāo)的預(yù)測(cè)效果，可以發(fā)現(xiàn)，NIRS模型均優(yōu)于MIRS模型，這可能與質(zhì)控指標(biāo)的質(zhì)量濃度有關(guān)系。5種質(zhì)控指標(biāo)成分的平均質(zhì)量濃度分別為9.851 8、2.478 3、2.740 8、13.633 5、1.302 3 mg/mL，均高于1 mg/mL，可以認(rèn)為均為高質(zhì)量濃度分析物，平均固含量7.995 1%亦屬于高質(zhì)量分?jǐn)?shù)。這與Tao等[22]的研究結(jié)果相符合，即對(duì)于高質(zhì)量濃度的分析物，NIRS表現(xiàn)出比MIRS更好的預(yù)測(cè)性能。

根據(jù)平均質(zhì)量濃度對(duì)6種質(zhì)控指標(biāo)進(jìn)一步分組，將新綠原酸、隱綠原酸及斷氧化馬錢子苷分為高質(zhì)量濃度組，綠原酸、梔子苷及固含量分為超高質(zhì)量濃度組，以預(yù)測(cè)模型的RSEP作為決定評(píng)價(jià)指標(biāo)，可以發(fā)現(xiàn)，超高質(zhì)量濃度組預(yù)測(cè)模型的RSEP均小于較高質(zhì)量濃度組，可以猜測(cè)，NIRS模型對(duì)高質(zhì)量濃度樣品具有優(yōu)異的預(yù)測(cè)效果，并且質(zhì)量濃度越高，預(yù)測(cè)效果越好，后續(xù)可以通過(guò)增大樣本量來(lái)驗(yàn)證。NIRS模型與MIRS模型預(yù)測(cè)效果存在差異，也有可能是由于NIRS相較于MIRS，其波數(shù)更多，建模變量數(shù)更多，數(shù)據(jù)中包含的信息更加豐富，使得其最終模型預(yù)測(cè)效果更佳，這也需要后續(xù)的研究證明。

本研究表明，NIRS與MIRS模型都適用于這6種質(zhì)控指標(biāo)的預(yù)測(cè)，2種光譜技術(shù)在離線或者在線檢測(cè)方面各有所長(zhǎng)，NIRS模型預(yù)測(cè)精度高、檢測(cè)速度快、穩(wěn)定性好[23]；MIRS建模參數(shù)少、儀器小巧便攜，而且可以適用于混懸體系樣品的檢測(cè)，減少了樣品的預(yù)處理過(guò)程，擴(kuò)大了紅外光譜的應(yīng)用范圍[24]，但同時(shí)MIRS對(duì)環(huán)境的要求更高，儀器位置的改變、溫濕度及壓力的變化、光纖的彎折程度等都會(huì)對(duì)光譜產(chǎn)生影響。與傳統(tǒng)化學(xué)分析方法相比，這2種光譜分析技術(shù)更環(huán)保，耗時(shí)更少，均可以對(duì)RI投料和二次熱處理工序的質(zhì)控指標(biāo)進(jìn)行快速檢測(cè)，也為后續(xù)的RI制劑過(guò)程的全工序快速檢測(cè)研究奠定了基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Research on fast detection method of feeding and secondary heat treatment process of Reduning Injection preparation process by near-infrared and mid-infrared reflectance spectroscopy

TONG Feng1, XU Fang-fang2, 3, ZHANG Xin2, 3, LI Zhi-dong2, 3, WU Yun2, 3, ZHANG Chen-feng2, 3, WANG Zhen-zhong2, 3

1. Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. Jiangsu Kangyuan Pharmaceutical Co., Ltd., Lianyungang 222001, China 3. State Key Laboratory of New Technology for Pharmaceutical Process of Traditional Chinese Medicine, Lianyungang 222001, China

The near-infrared reflectance spectroscopy (NIRS) and mid-infrared reflectance spectroscopy (MIRS) techniques were used to detect six quality control indexes in the feeding and secondary heat treatment process of Reduning Injection (熱毒寧注射液, RI) preparation process, so as to improve the quality control level of preparation process.The quantitative correction models of chlorogenic acid, neochlorogenic acid, cryptochlorogenic acid, gardenoside, secoxyloganin and solid content were established by using NIRS technology and attenuated total MIRS technology, combined with partial least squares (PLS) method, after spectral pretreatment method selection and band selection respectively. Calibration set correlation coefficient (cal), validation set correlation coefficient (pre), root mean square error of calibration (RMSEC), root mean square error of cross validation (RMSECV) and relative standard error of prediction (RSEP) were used as evaluation indexes to evaluate the model performance.The RMSEC and RMSECV of the six quality control indexes of the NIRS prediction model were both less than 0.3 and close to each other, and the RSEP value were all less than 4.0%. The RMSEC and RMSECV of the six quality control indexes of the MIRS prediction model were all less than 0.4 and close to each other, and the RSEP value were all less than 5.0%. These PLS models had the advantages of good model performance and high prediction accuracy.Both NIRS and MIRS technology can be used for rapid detection of six quality control indexes in RI feeding-secondary heat treatment process, and the RSEP value is within 5%, and the method is simple and reliable.

near-infrared reflectance spectroscopy; mid-infrared reflectance spectrum; Reduning Injection; preparation process; spectral pretreatment; band screening; partial least squares; chlorogenic acid; neochlorogenic acid; cryptochlorogenic acid; gardenoside;secoxyloganin; solid content

R283.6

A

0253 - 2670(2022)21 - 6706 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.21.007

2022-05-16

2022年中央財(cái)政轉(zhuǎn)移支付地方項(xiàng)目：基于重點(diǎn)研究室研究領(lǐng)域的中醫(yī)藥多學(xué)科研究能力提升項(xiàng)目——中藥提取精制新技術(shù)

童 楓（1998—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幹扑庍^(guò)程新技術(shù)。Tel: 18851193208 E-mail: tongfeng5324@126.com

王振中，研究員級(jí)高級(jí)工程師，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幹扑庍^(guò)程新技術(shù)。E-mail: kanionlunwen@163.com

徐芳芳，女，博士，主管藥師，研究方向?yàn)橹兴幹扑庍^(guò)程新技術(shù)。E-mail: 879164331@qq.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]