洗滌血小板制備及相關(guān)質(zhì)量功能指標(biāo)的研究

李曉華 李建民 鮑雪臨 楊寧 郭敏 李玉秋 馬媛媛 孫瑞玲 白蘭蘭

264003 煙臺(tái)市中心血站1，山東煙臺(tái)

050071 河北省血液中心2，河北石家莊

264003 煙臺(tái)山醫(yī)院3，山東煙臺(tái)

隨著血站行業(yè)新標(biāo)準(zhǔn)中“少血漿血小板、洗滌血小板等” 的確定以及貫徹實(shí)施，給血站行業(yè)提出了新的要求與挑戰(zhàn)。因此，洗滌血小板制備及臨床應(yīng)用得到重視，本文在借鑒國內(nèi)外洗滌血小板制備等經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，旨在摸索出以1個(gè)治療量去白細(xì)胞混合濃縮血小板和1個(gè)治療量去白細(xì)胞單采血小板為起始血液，用于制備洗滌血小板的工藝流程，現(xiàn)將兩種起始血小板制備的66 例洗滌血小板的相關(guān)情況報(bào)告如下。

資料與方法

起始血小板來源：400 mL 全血白膜法制備的濃縮血小板，并以滿足1個(gè)治療量要求合并制備的去白細(xì)胞混合濃縮血小板36 例；單采去白細(xì)胞血小板30例；血小板外觀檢查色澤正常，無紅染現(xiàn)象。

設(shè)備及試劑：KUBOTA-9942 離心機(jī)(生產(chǎn)廠家：日本久保田公司)，TSCD-Ⅱ無菌接駁機(jī)(生產(chǎn)廠家：日本泰爾茂公司)，MCS+血細(xì)胞單采機(jī)(生產(chǎn)廠家：美國血液技術(shù)公司)，ABL800FLEX 血?dú)夥治鰞x(生產(chǎn)廠家：雷度米特醫(yī)療設(shè)備有限公司)，ABL800 血?dú)鉀_洗液、ABL800 定標(biāo)液、XS-500i 全自動(dòng)血液分析儀(生產(chǎn)廠家：煙臺(tái)恒泰生物科技有限公司)，XS-500i試劑包、Photometer 4040 半自動(dòng)生化分析儀(生產(chǎn)廠家：北京瑞爾達(dá)生物科技有限公司)，總蛋白測定試劑盒、分漿夾板(生產(chǎn)廠家：蘇州醫(yī)療器械廠)，生理鹽水(生產(chǎn)廠家：石家莊四藥集團(tuán))。

洗滌血小板制備方法：將兩類起始血小板通過無菌連接含2個(gè)空轉(zhuǎn)移袋和1個(gè)含400 mL 生理鹽水的三聯(lián)袋為一體，整體平衡后以3 000 G，10 min，20～24℃，剎車為9 的離心條件置離心機(jī)進(jìn)行離心(離心機(jī)的剎車設(shè)置固化程序中有0～9 檔次選擇，數(shù)字越大剎車時(shí)間越快，反之越慢)。離心完畢，取出起始血小板置分漿夾板，除袋底沉淀物外，將血漿全部轉(zhuǎn)移至一空轉(zhuǎn)移袋中，將100 mL 生理鹽水緩慢加入沉淀袋中，靜態(tài)沖洗1～2 次，清除袋中殘存血漿，然后再將上清液轉(zhuǎn)移至另一空轉(zhuǎn)移袋中，注意避免沉淀物的流失。將余下的200 mL 生理鹽水加入有沉淀物的袋中，分別做熱合處理，視起始血小板的不同，含血漿的袋子可作為普通冰凍血漿(單采者，混合者因無標(biāo)準(zhǔn)可依，按報(bào)廢處理)，含沉淀物的袋子即為制備的洗滌血小板。洗滌血小板置室溫下自然解聚1 h，然后置20～24℃振蕩箱中充分振蕩解聚1～2 h。簡易制備流程如圖1 所示。洗滌前后的血小板分別留樣進(jìn)行檢測。

圖1 洗滌血小板簡易制備流程圖

血細(xì)胞計(jì)數(shù)方法：按全自動(dòng)血液分析儀的要求完成紅細(xì)胞、白細(xì)胞及血小板計(jì)數(shù)。血漿蛋白含量檢測方法：按半自動(dòng)生化分析儀要求完成血漿蛋白含量的測定。pH 及氧分壓檢測：按血?dú)夥治鰞x要求完成氧分壓、二氧化碳(CO2)分壓及pH 值測定。血小板聚集試驗(yàn)檢測方法：采用經(jīng)典比濁法(11.2 μmol/LADP 誘導(dǎo))測定血小板最大聚集率。血小板黏附試驗(yàn)檢測方法：采用經(jīng)典玻球法測定血小板黏附率。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：數(shù)據(jù)均用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件予以處理；計(jì)量資料以(±s)表示，比較采用t檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

兩種起始血液制備的洗滌血小板的質(zhì)量指標(biāo)檢測情況：去白細(xì)胞單采血小板洗滌后血小板容量、血小板計(jì)數(shù)、白細(xì)胞殘留量、紅細(xì)胞混入量、血漿蛋白含量低于洗滌前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；去白細(xì)胞混合濃縮血小板洗滌后血小板容量、血小板計(jì)數(shù)、白細(xì)胞殘留量、紅細(xì)胞混入量、血漿蛋白含量低于洗滌前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

兩種起始血液制備的洗滌血小板功能指標(biāo)檢測情況：去白細(xì)胞單采血小板洗滌后血小板聚集試驗(yàn)、血小板黏附試驗(yàn)、血小板CO2分壓低于洗滌前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；去白細(xì)胞混合濃縮血小板洗滌后血小板聚集試驗(yàn)、血小板黏附試驗(yàn)、血小板CO2分壓低于洗滌前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

討 論

有關(guān)研究顯示，血漿懸浮液血小板存在種種問題，包括對血漿過敏，IgA 缺乏等患者失去血小板治療的機(jī)會(huì)，血漿中的大量補(bǔ)體、凝血酶、纖溶酶等物質(zhì)影響血小板輸注療效，血漿中許多生物反應(yīng)物質(zhì)導(dǎo)致輸血不良反應(yīng)，血漿同種異體蛋白抗原導(dǎo)致同種免疫等問題；血小板儲(chǔ)存期間釋放的生長因子可能影響腫瘤患者的治療，洗滌去除血漿中的生長因子對腫瘤患者的治療很有必要；輸注去白細(xì)胞血小板仍存在非溶血性發(fā)熱的患者，采用生理鹽水洗滌的血小板后，不良反應(yīng)發(fā)生率從20%降到0.6%，據(jù)此認(rèn)為儲(chǔ)存的濃縮血小板懸浮液血漿中存在著引起非溶血性發(fā)熱反應(yīng)的物質(zhì)，應(yīng)該采用洗滌的方法去除；僅濾除濃縮血小板中的白細(xì)胞并不能完全避免輸血發(fā)熱反應(yīng)；在血小板貯存期間，白細(xì)胞抗體、血小板抗體、細(xì)胞因子、補(bǔ)體成分、脂質(zhì)成分等均可引起非溶血性發(fā)熱反應(yīng)[1-3]。血小板儲(chǔ)存期間釋放的生長因子可能影響腫瘤患者的治療等，同時(shí)也指出了離心制備時(shí)的剪切力對血小板影響較大，會(huì)出現(xiàn)血小板數(shù)量減少、回收率下降、解聚困難、體外被激活、聚集力下降等情況；以及采用輕離心先行去除血小板中沉淀的紅細(xì)胞再行洗滌，避免殘存紅細(xì)胞影響洗滌血小板質(zhì)量等問題[4]。

表1 兩種起始血液制備的洗滌血小板的質(zhì)量指標(biāo)檢測情況

表2 兩種起始血液制備的洗滌血小板功能指標(biāo)檢測情況

為提高洗滌效果和洗滌血小板的質(zhì)量，本研究采取的方式：①對起始血小板進(jìn)行外觀檢查，無紅染者用于制備洗滌血小板，旨在規(guī)避紅細(xì)胞混入量過高影響洗滌血小板質(zhì)量，減少不必要的離心去紅細(xì)胞操作過程；②采用一次離心去除全部血漿加2次靜態(tài)沉淀物直接清洗法進(jìn)行制備，旨在降低離心剪切力對血小板功能的影響，達(dá)到充分洗滌、簡化流程、縮短制備時(shí)間以及后期及時(shí)應(yīng)用等目的；③在選擇起始血小板時(shí)有意識(shí)地選擇血小板含量高者用于制備洗滌血小板，旨在規(guī)避洗滌過程受激活、上清液流失等因素導(dǎo)致的血小板含量降低，以滿足臨床治療量的需求；④根據(jù)血站行業(yè)各自條件的不同，建立適合自身的洗滌血小板制備、質(zhì)量保證等相關(guān)制度流程，基于滿足臨床治療量和混合濃縮血小板制備特點(diǎn)而實(shí)施[5]。從試驗(yàn)結(jié)果來看，兩種起始血小板制備的洗滌血小板，在容量、血小板計(jì)數(shù)、白細(xì)胞殘留量、紅細(xì)胞混入量、上清蛋白質(zhì)含量、pH 值質(zhì)量指標(biāo)上均符合國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求；在血小板聚集、血小板黏附、血小板氧分壓、血小板CO2分壓輔助指標(biāo)的表現(xiàn)上，二者大體一致。

綜上所述，在現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)、技術(shù)等框架下，血站行業(yè)制備的洗滌血小板質(zhì)量可靠，可向臨床提供洗滌血小板，在適宜條件下可應(yīng)用于臨床治療。