普通小麥穎殼蠟質(zhì)缺失突變體glossy1的轉(zhuǎn)錄組分析

李玲紅 張 哲 陳永明 尤明山 倪中福 邢界文

普通小麥穎殼蠟質(zhì)缺失突變體的轉(zhuǎn)錄組分析

李玲紅 張 哲 陳永明 尤明山 倪中福 邢界文*

中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 北京 100193

為了明確突變體穎殼蠟質(zhì)含量顯著變化的分子機(jī)制, 本研究對(duì)源自濟(jì)麥22穎殼蠟質(zhì)缺失突變體與野生型進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析。結(jié)果表明, 在突變體中, 共篩選到12,230個(gè)差異表達(dá)基因, 其中5811個(gè)基因在突變體中上調(diào)表達(dá), 6419個(gè)下調(diào)表達(dá)。GO (gene ontology)功能富集分析發(fā)現(xiàn), 差異基因主要富集在蠟質(zhì)合成和轉(zhuǎn)運(yùn)途徑, 具體分布在酰基轉(zhuǎn)移酶活性、脂質(zhì)結(jié)合和水解酶活性等條目, 由此推測(cè)這些途徑與小麥穗部蠟質(zhì)缺失性狀是緊密相關(guān)的。我們還利用RT-qPCR檢測(cè)了參與蠟質(zhì)代謝途徑部分基因的表達(dá), 結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果是一致的。本研究為今后探究小麥蠟質(zhì)代謝的分子機(jī)制和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了數(shù)據(jù)支持, 同時(shí)也為抗逆小麥育種奠定了理論基礎(chǔ)。

小麥; 表皮蠟質(zhì);突變體; 轉(zhuǎn)錄組分析; 分子機(jī)制

小麥?zhǔn)侨蚍秶鷥?nèi)廣泛種植的重要糧食作物,總產(chǎn)量?jī)H次于玉米。表皮蠟質(zhì)(Epicuticular wax)是指覆蓋在植物地上部分表面的一層脂質(zhì)有機(jī)混合物, 主要由烷烴類、醇類、醛類、酮類和脂肪酸等化合物組成[1]。表皮蠟質(zhì)是植物與環(huán)境之間的保護(hù)屏障, 能夠保護(hù)植物免受干旱、紫外線、病原菌和昆蟲(chóng)等的侵害[2]。因此, 研究表皮蠟質(zhì)相關(guān)基因及調(diào)控機(jī)制對(duì)培育抗逆性作物品種, 提高糧食產(chǎn)量具有重要意義。

植物中蠟質(zhì)化合物的合成發(fā)生在表皮細(xì)胞內(nèi), 主要分為3個(gè)階段。第一, 在質(zhì)體(Plastid)中合成C16和C18脂肪酸: 以乙酰輔酶A為底物, 通過(guò)脂肪酸合酶(FAS)復(fù)合物對(duì)C2的連續(xù)縮合而伸長(zhǎng)[3-4]; 第二, 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum)中通過(guò)脂肪酸延伸酶復(fù)合物(FAE)進(jìn)一步延伸為長(zhǎng)鏈脂肪酸化合物(VLCFAs): 利用質(zhì)體生成的C16或C18脂肪酸和丙二酰輔酶A (CoA)作為底物, 通過(guò)脂肪酸延伸酶(FAE)復(fù)合物, 在KCS、KCR、HCD和ECR四種酶的催化下循環(huán)反應(yīng)生成C20～C34化合物[5]; 第三, 生成的VLCFAs經(jīng)過(guò)不同的蠟質(zhì)合成途徑生成不同的化合物。

植物中普遍存在兩條蠟質(zhì)生物合成途徑, 包括烷烴合成途徑(也叫脫羰途徑)和醇合成途徑(也叫酰基還原途徑)。前者通過(guò)CER1、CER3和CYTB5復(fù)合物催化由醛生成烷烴, 繼而通過(guò)中鏈烷烴羥化酶1 (MAH1)生成仲醇和酮[6]; 后者通過(guò)脂肪酸?；o酶A還原酶(CER4/FAR3)和蠟合酶/二酰基甘油?；D(zhuǎn)移酶(WSD1)分別產(chǎn)生初級(jí)醇和蠟酯[7-8]。小麥不同于其他植物, 在生殖生長(zhǎng)階段有一條獨(dú)特的蠟質(zhì)生物合成途徑: β-二酮途徑[9]。β-二酮主要為正十三烷-14,16-二酮, 由于β-二酮的存在, 絕大多數(shù)現(xiàn)代小麥(L.)品種表現(xiàn)出白霜狀蠟質(zhì)外觀[10-11]。近期研究證實(shí)小麥中負(fù)責(zé)β-二酮的生物合成的位點(diǎn)是一個(gè)合成基因簇, 分別編碼III型的聚酮合成酶、一個(gè)細(xì)胞色素P450和一個(gè)水解酶/羧化酯酶[12]。不同蠟質(zhì)化合物從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成以后轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜(PM), 然后由ABCG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白穿過(guò)PM, 最后脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(LTP)參與穿過(guò)外周細(xì)胞壁轉(zhuǎn)移到角質(zhì)層表面, 自我組裝成肉眼可見(jiàn)的白霜狀表皮蠟質(zhì)層[13-14]。

前期我們利用甲基磺酸乙酯(EMS)誘變小麥品種濟(jì)麥22獲得一個(gè)穎殼蠟質(zhì)缺失突變體, 命名為突變體, 并對(duì)其進(jìn)行了表型鑒定、遺傳分析和精細(xì)定位。GC-MS測(cè)定結(jié)果顯示, 與野生型相比, 突變體的總蠟質(zhì)含量和單個(gè)蠟組分含量均發(fā)生顯著變化, 特別是突變體中β-二酮含量顯著高于野生型[15]。為了闡明潛在的分子機(jī)制, 本文對(duì)濟(jì)麥22和抽穗期的穎殼進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組比較分析。研究結(jié)果揭示了基因調(diào)控小麥蠟質(zhì)合成代謝相關(guān)基因的可能的分子機(jī)制, 為構(gòu)建蠟質(zhì)代謝表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供理論依據(jù), 同時(shí)也為進(jìn)一步選育抗逆小麥品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

小麥突變體是由小麥優(yōu)質(zhì)栽培品種濟(jì)麥22經(jīng)EMS誘變所得, 經(jīng)連續(xù)自交, 已純合一致, 能穩(wěn)定遺傳。相較于野生型,突變體的穗部穎殼明顯表現(xiàn)為光滑無(wú)蠟(圖1)。2017年秋季, 在北京上莊(116°E, 40°N)分別種植濟(jì)麥22和突變體, 并設(shè)置3個(gè)重復(fù)(3行/重復(fù))。播種時(shí)行長(zhǎng)1.5 m, 間距0.3 m, 籽粒均勻分布, 每行播種率為20粒。

圖1 濟(jì)麥22和glossy1突變體的表型比較

A: 濟(jì)麥22和突變體的整株表型, 標(biāo)尺為1 cm; B: 穗子放大圖, 標(biāo)尺為1 cm。

A: The whole plant of Jimai 22 and.Bar: 10 cm; B: Enlarged view of spikes of Jimai 22 and.Bar: 1 cm.

1.2 總RNA提取和測(cè)序

2018年夏季, 于小麥開(kāi)花期(GS65)收集野生型和突變體小麥穎殼組織, 并迅速置于液氮罐中, 作為后續(xù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的樣品。本研究對(duì)6個(gè)樣品進(jìn)行分析, 分別是突變體的3個(gè)生物學(xué)重復(fù)(命名為Rep1、Rep2和Rep3), 野生型濟(jì)麥22的3個(gè)生物學(xué)重復(fù)(Jimai 22 Rep1、Rep2和Rep3)。液氮研磨樣品, 利用TRIzol試劑(Invitrogen)提取穎殼總RNA, 具體方法參照說(shuō)明書(shū)。完成總RNA提取后, 組織樣品送至北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司利用HiSeq2000儀器完成文庫(kù)構(gòu)建、質(zhì)量控制及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.3 差異表達(dá)基因的鑒定

測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)(Raw data), 去除接頭序列和低質(zhì)量測(cè)序片段之后, 獲得高質(zhì)量的序列(Clean data)。將Clean data與小麥參考基因組(Chinese Spring, RefSeq v.1.1)進(jìn)行比對(duì), 獲取基因組位置信息。使用RSEM軟件包評(píng)估基因表達(dá)水平。使用FPKM (Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments)方法標(biāo)準(zhǔn)化基因的表達(dá)水平[16]。使用DESeq R package[17], 使用調(diào)整后的值(FDR < 0.05)和Fold Change (FC)比值(|log2FC|≥1)來(lái)確定突變體和野生型之間的差異表達(dá)基因(DEGs)。

1.4 RT-qPCR驗(yàn)證差異表達(dá)基因

根據(jù)樣品基因表達(dá)量差異, 本實(shí)驗(yàn)隨機(jī)挑選9個(gè)基因(;;;;;;;;)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR (RT-qPCR)驗(yàn)證。吸取1 μg總RNA使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript II RT SuperMixqPCR (Vazyme)試劑盒合成cDNA第1鏈。以(TraesCS5D02G132200)作為內(nèi)源性對(duì)照校準(zhǔn)基因表達(dá)水平。RT-qPCR的引物對(duì)列于表1。qPCR使用SYBR Green PCR Master Mix (Vazyme Biotech, Ltd., China)和CFX96 Real-time PCR檢測(cè)系統(tǒng)(Bio-Rad Laboratories, Inc., USA)進(jìn)行。RT-qPCR反應(yīng)條件為: 95℃預(yù)變性3 min, 95℃變性15 s、60℃退火15 s、72℃延伸30 s設(shè)置40個(gè)循環(huán), 在72℃延伸30 s階段采集熒光, 并添加溶解曲線, 結(jié)果用2–ΔΔCt計(jì)算基因表達(dá)差異[18]。本實(shí)驗(yàn)包含3次生物學(xué)重復(fù), 每個(gè)生物學(xué)重復(fù)進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。

1.5 差異表達(dá)基因的注釋

為進(jìn)一步了解差異表達(dá)基因(DEGs)的生物學(xué)意義, 本研究使用FDR<0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)對(duì)DEGs進(jìn)行基因本體論(GO)富集分析[19]。具體分析流程使用中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究中心生信分析平臺(tái)中小麥族同源基因注釋數(shù)據(jù)庫(kù)Triticeae-Gene Tribe板塊中的GoEnrichment功能模塊進(jìn)行分析[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)控

為了闡明濟(jì)麥22背景的突變體穗部蠟質(zhì)缺失性狀的分子基礎(chǔ), 我們選取兩親本開(kāi)花期的穎殼為材料提取總RNA, 進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)。每個(gè)基因型設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù), 剔除低質(zhì)量的測(cè)序reads后, 將每個(gè)樣本的高質(zhì)量reads比對(duì)到小麥中國(guó)春參考基因組(RefSeq v.1.1)上。結(jié)果顯示, 每個(gè)樣本的測(cè)序原始數(shù)據(jù)分別從73.17 M到91.29 M不等。經(jīng)過(guò)質(zhì)量過(guò)濾后, 每個(gè)樣本產(chǎn)生52.12 M到64.66 M干凈讀長(zhǎng), 這些讀長(zhǎng)在參考基因組的比對(duì)率均達(dá)70.80%以上(表2)。同組樣品基因表達(dá)模式趨于一致且Pearson相關(guān)系數(shù)均大于0.80 (圖2-A)?？偟膩?lái)說(shuō), 這些結(jié)果均驗(yàn)證了RNA和測(cè)序數(shù)據(jù)的高質(zhì)量, 可以進(jìn)行后續(xù)分析。

表1 RT-qPCR所用引物

表2 樣品測(cè)序輸出數(shù)據(jù)的質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.2 差異表達(dá)基因分析

為了確定野生型和突變體之間基因表達(dá)的差異,根據(jù)FPKM值對(duì)基因表達(dá)水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。所有的唯一映射讀取被用來(lái)計(jì)算基因FPKM值。根據(jù)DESeq2分析結(jié)果, 以adjusted-value < 0.05且Fold-change value > 2 或者 < 0.5作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選, 共篩選出12,230個(gè)差異表達(dá)基因(DEGs), 占檢測(cè)到基因總數(shù)的26.6%。相較于濟(jì)麥22, 5811個(gè)基因(占總DEGs的47.5%)在突變體中上調(diào)表達(dá), 6419個(gè)基因(占總DEGs的52.5%)在突變體中下調(diào)表達(dá)(圖2-B)。進(jìn)一步對(duì)12,230個(gè)差異表達(dá)基因的染色體分布進(jìn)行了統(tǒng)計(jì), 結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因在A、B和D基因組上的分布基本是均勻的(圖2-C)。

2.3 RT-qPCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證我們轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性, 我們隨機(jī)選擇了9個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)。實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的結(jié)果變化趨勢(shì)比較一致(圖3), 說(shuō)明我們轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)有很高的可靠性。

2.4 差異表達(dá)基因GO富集分析

為了解濟(jì)麥22和差異表達(dá)基因的生物學(xué)意義, 按照錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)這些基因進(jìn)行基因本體論(gene ontology, GO)富集分析。對(duì)12,230個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能注釋和分析發(fā)現(xiàn), 共有5380個(gè)基因獲得注釋, 分布于159個(gè)GO分類條目。根據(jù)基因數(shù)目分別篩選出30條最顯著的條目(圖4-A)。在三類注釋生物學(xué)過(guò)程(biological process)、細(xì)胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)中所占的比例分別為46.5% (74)、8.2% (13)和45.3% (72)。在生物學(xué)過(guò)程中, 以抗氧化過(guò)程(response to oxidative stress)的基因數(shù)最多, 脂肪酸生物合成過(guò)程(fatty acid biosynthetic process)以及脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)(lipid transport)等生物學(xué)過(guò)程的基因數(shù)目占很大比例。分子功能注釋的基因大部分集中在水解酶活性(hydrolase activity)、轉(zhuǎn)移酶活性(transferase activity)、單加氧酶活性(monooxygenase activity)以及脂質(zhì)結(jié)合(lipid binding)等。在細(xì)胞組分中, 質(zhì)膜(plasma membrane)功能組擁有的基因數(shù)最多。

圖2 樣品相關(guān)性及差異表達(dá)基因分析

A: 樣品相關(guān)性分析; B: 差異表達(dá)基因火山圖; C: 差異表達(dá)基因在染色體上的分布。

A: correlation analysis among the samples; B: volcano plot of DEGs; C: the distribution of DEGs on wheat chromosomes.

圖3 RT-qPCR驗(yàn)證隨機(jī)挑選的DEGs

為進(jìn)一步研究小麥穎殼蠟質(zhì)調(diào)控基因的生物學(xué)功能, 分別將上調(diào)和下調(diào)的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析, 根據(jù)基因數(shù)目分別篩選出30條最顯著的條目。結(jié)果表明, 上調(diào)DEGs主要富集在跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性(transmembrane transporter activity)、單加氧酶活性(monooxygenase activity)以及酰基轉(zhuǎn)移酶活性(transferase activity, transferring acyl groups)等條目(圖4-B); 下調(diào)DEGs中分子功能模塊基因數(shù)目最多的條目是水解酶活性(hydrolase activity)、過(guò)氧化物酶活性(peroxidase activity)以及脂質(zhì)結(jié)合(lipid binding) (圖4-C)。

圖4 差異表達(dá)基因的GO功能注釋

A: 差異表達(dá)基因的GO功能注釋分類; B: 上調(diào)DEGs的GO富集; C: 下調(diào)DEGs的GO富集。

A: GO functional annotation classification of DEGs; B: GO enrichment of up-regulated DEGs; C: GO enrichment of down-regulated DEGs.

2.5 表皮蠟質(zhì)合成及轉(zhuǎn)運(yùn)途徑相關(guān)基因的表達(dá)

表皮蠟質(zhì)是由多種蠟質(zhì)化合物組成的, 它的合成需要多步反應(yīng)。為了從轉(zhuǎn)錄組角度分析參與的蠟質(zhì)代謝途徑, 我們結(jié)合前人的報(bào)道繪制了表皮蠟質(zhì)合成和轉(zhuǎn)運(yùn)途徑示意圖(圖5)。從圖中我們發(fā)現(xiàn)以3-酮酯酰-ACP為底物合成β-二酮途徑中涉及的α/β水解酶基因()、查爾酮合酶基因()以及催化羥基β-二酮合成的細(xì)胞色素P450基因()在突變體中都上調(diào)表達(dá), 這可能導(dǎo)致了突變體中β-二酮含量相對(duì)于野生型的顯著增加。在合成VLCFAs過(guò)程中涉及的長(zhǎng)鏈酰基輔酶A合成酶基因()以及脂肪酸延伸酶復(fù)合物中的成員3-酮酰-輔酶A合成酶基因()的表達(dá)水平既有上調(diào)也有下調(diào), 然而β-羥烷基-輔酶A脫水酶基因()在突變體中上調(diào)表達(dá)。?；€原和脫羰途徑共有的脂肪酸?；?輔酶A還原酶基因()在突變體中大部分下調(diào)表達(dá), 少部分基因上調(diào)表達(dá); 復(fù)合物CER1、CER3和CYTB5三者共同作用催化烷烴的合成, 前者涉及的基因在突變體中大部分上調(diào)表達(dá), 而后兩者均下調(diào)表達(dá); 催化初級(jí)醇生成蠟酯的O-?；D(zhuǎn)移酶家族蛋白基因的表達(dá)水平既有上調(diào)也有下調(diào)。長(zhǎng)鏈脂肪酸及衍生物合成后, 從質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外間隙過(guò)程中涉及的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)G家族蛋白基因()的表達(dá)水平在突變體中既有上調(diào)也有下調(diào)表達(dá), 轉(zhuǎn)運(yùn)蠟質(zhì)化合物穿過(guò)細(xì)胞壁到達(dá)角質(zhì)層外面的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白基因()在突變體中均下調(diào)表達(dá)(表3)。這些結(jié)果表明在小麥蠟質(zhì)合成和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中具有非常重要的作用。

為了全面了解調(diào)控小麥蠟質(zhì)代謝的相關(guān)途徑, 我們根據(jù)前人的報(bào)道, 進(jìn)一步在突變體和野生型開(kāi)花期的穎殼中用RT-qPCR方法檢測(cè)了五個(gè)代謝途徑共43個(gè)基因的表達(dá)情況, 其中25個(gè)基因表達(dá)水平發(fā)生了顯著變化, 包括9個(gè)脂肪酸延伸途徑基因、4個(gè)?；€原途徑基因、8個(gè)脫羰途徑基因、2個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑基因以及2個(gè)調(diào)控途徑基因(圖6)。結(jié)果表明脂肪酸延伸途徑、轉(zhuǎn)運(yùn)及調(diào)控途徑的基因幾乎都下調(diào)表達(dá), 而酰基還原及脫羰途徑的基因既有上調(diào)表達(dá)也有下調(diào)表達(dá), 這與本實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)錄組結(jié)果也是一致的。

表3 小麥穎殼中蠟生物合成途徑相關(guān)的差異表達(dá)基因

(續(xù)表3)

(續(xù)表3)

(續(xù)表3)

(續(xù)表3)

(續(xù)表3)

圖5 小麥蠟質(zhì)生物合成示意圖

不同顏色的字體表示已知或推測(cè)的在表皮蠟質(zhì)生物合成步驟中起作用的基因表達(dá)水平的變化, 其中紅色代表突變體相對(duì)野生型基因表達(dá)上調(diào), 橘色代表這類基因表達(dá)水平既有上調(diào)也有下調(diào), 藍(lán)色代表下調(diào)。

The colored fonts indicate transcriptional changes of the genes known or predicated to be central for epicuticular wax biosynthesis.Compared with the wild-type, the relative expression of the genes in red is up-regulated, the expression of the genes in orange is up-regulated and down-regulated, and the expression of the genes in blue is down-regulated.

圖6 突變體glossy1相對(duì)濟(jì)麥22蠟質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄變化

*:< 0.05; **:< 0.01; ***:< 0.001。

3 討論

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-Seq)技術(shù)能夠從整體水平研究基因表達(dá)差異以及基因結(jié)構(gòu), 與其他技術(shù)手段結(jié)合可以解析特定的生物學(xué)過(guò)程, 已被廣泛應(yīng)用于植物候選基因發(fā)掘、功能鑒定及遺傳改良等領(lǐng)域。2017年, Huang等利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等手段揭示了小麥表皮蠟質(zhì)合成抑制基因的本質(zhì)是長(zhǎng)鏈非編碼RNA, 并驗(yàn)證了它作為顯性抑制因子對(duì)蠟質(zhì)合成基因的調(diào)控功能[21]。2021年1月,期刊發(fā)文揭示了水稻適應(yīng)土壤低氮的機(jī)制, 研究人員通過(guò)多個(gè)轉(zhuǎn)錄組的交叉比較分析, 從數(shù)百個(gè)候選基因中發(fā)現(xiàn)15個(gè)可能受OsTCP19直接調(diào)控且與N響應(yīng)相關(guān)的基因, 這為研究的突破性進(jìn)展指定了正確的方向[22]。

植物表皮蠟質(zhì)對(duì)抵抗外界環(huán)境中生物(病原菌、昆蟲(chóng)等)和非生物(干旱、紫外線等)脅迫具有非常重要的作用。目前在小麥中已定位的表皮蠟質(zhì)基因比較少, 主要包括控制蠟質(zhì)合成位點(diǎn)～, 抑制蠟質(zhì)合成位點(diǎn)～, 其中已經(jīng)克隆的只有兩個(gè):和[12,21,23]。因此, 挖掘新的表皮蠟質(zhì)基因?qū)ε嘤碌男←溈鼓嫫贩N是非常重要的。本研究在已定位的穎殼蠟質(zhì)缺失突變體的基礎(chǔ)上開(kāi)展, 通過(guò)對(duì)濟(jì)麥22和突變體開(kāi)花期的穎殼進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序, 旨在從轉(zhuǎn)錄組水平上揭示突變體中蠟質(zhì)含量變化的分子機(jī)制, 為進(jìn)一步確定和克隆該基因提供依據(jù), 同時(shí)也有助于從全基因組水平上發(fā)掘?qū)π←溝炠|(zhì)代謝有重要作用的功能基因, 為抗逆小麥育種奠定理論基礎(chǔ)。

β-二酮是大麥和小麥等小麥族作物表皮蠟質(zhì)特有的成分, 在擬南芥和其他作物中檢測(cè)不到, 它的產(chǎn)生決定了普通小麥植株表面呈現(xiàn)白霜狀的外觀[24-25]。前人已經(jīng)報(bào)道了穗部蠟質(zhì)合成抑制位點(diǎn)是由于β-二酮的缺失導(dǎo)致穎殼光滑無(wú)蠟表型[11]。而本研究通過(guò)GO富集分析發(fā)現(xiàn)與β-二酮合成相關(guān)的基因、和在突變體中均上調(diào)表達(dá), 這雖然解釋了突變體中穎殼的β-二酮含量相較野生型顯著增加的結(jié)果, 但是與前人報(bào)道的由于β-二酮的缺失導(dǎo)致穎殼光滑無(wú)蠟的表型是相悖的。因此深入研究調(diào)控機(jī)制對(duì)于完善小麥蠟質(zhì)合成代謝機(jī)制是很有幫助的。

植物表面白霜狀表層是由表皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成的各種脂質(zhì)化合物轉(zhuǎn)運(yùn)到質(zhì)膜, 再穿過(guò)外周細(xì)胞壁轉(zhuǎn)運(yùn)到角質(zhì)層后自我組裝形成的蠟質(zhì)層。2011年, 陳國(guó)雄等克隆了編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G亞家族的一個(gè)全轉(zhuǎn)運(yùn)子HvABCG31的角質(zhì)層基因, 該基因的功能缺失會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)成分在葉片表皮細(xì)胞的大量積累, 導(dǎo)致葉片表面角質(zhì)層變薄, 角質(zhì)含量減少[26]。擬南芥中的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白LTPG參與角質(zhì)的合成, 該基因突變導(dǎo)致莖表皮細(xì)胞角質(zhì)層蠟質(zhì)組成發(fā)生變化以及蠟質(zhì)積累減少[14]。此外, 煙草中基因表達(dá)量上升, 可使葉片的角質(zhì)層蠟質(zhì)積累增加[27]。本研究中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)G家族蛋白基因()和脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白基因()的表達(dá)水平在突變體中大部分呈下調(diào)表達(dá), 這很可能造成脂質(zhì)化合物在表皮細(xì)胞中積累, 從而導(dǎo)致突變體穎殼蠟質(zhì)減少。因此, 進(jìn)一步對(duì)蠟質(zhì)合成及轉(zhuǎn)運(yùn)途徑基因的研究將有助于明確突變體穎殼蠟質(zhì)缺失的產(chǎn)生原因及潛在的分子機(jī)制。

4 結(jié)論

本研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)系統(tǒng)分析了小麥突變體和野生型穎殼的轉(zhuǎn)錄組。通過(guò)比較突變體和野生型間的表達(dá)水平, 發(fā)現(xiàn)了12,230個(gè)差異表達(dá)基因, 其中5811個(gè)基因在突變體中上調(diào)表達(dá), 6419個(gè)下調(diào)表達(dá)。通過(guò)功能注釋分析發(fā)現(xiàn), 這些差異基因主要涉及?；D(zhuǎn)移和脂質(zhì)結(jié)合等途徑, 這些關(guān)鍵基因的表達(dá)水平變化可以解釋突變體相較于野生型穎殼蠟質(zhì)含量的顯著變化。本文通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方法揭示了突變體蠟質(zhì)代謝調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄圖譜, 為深入了解基因功能和小麥蠟質(zhì)代謝的分子機(jī)制及基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了數(shù)據(jù)信息。

[1] Sturaro M, Motto M, Hemantaranjan A.Plant cuticular waxes: biosynthesis and functions, 2006, 9: 229–251.

[2] Yeats T H, Rose J K C.The formation and function of plant cuticles, 2013, 163: 5–20.

[3] Dehesh K, Tai H, Edwards P, Byrne J, Jaworski J G.Overexpression of 3-ketoacyl-acyl-carrier protein synthase IIIs in plants reduces the rate of lipid synthesis, 2001, 125: 1103–1114.

[4] Leibundgut M, Jenni S, Frick C, Ban N.Structural basis for substrate delivery by acyl carrier protein in the yeast fatty acid synthase, 2007, 316: 288–290.

[5] LiBeisson Y, Shorrosh B, Beisson F, Andersson M X, Arondel V, Bates P D, Baud S, Bird D, DeBono A, Durrett T P.Acyl-lipid metabolism, 2010, 8: e0133.

[6] Bernard A, Domergue F, Pascal S, Jetter R, Renne C, Faure J D, Haslam R P, Napier J A, Lessire R, Joubès J.Reconstitution of plant alkane biosynthesis in yeast demonstrates thatECERIFERUM1 and ECERIFERUM3 are core components of a very-long-chain alkane synthesis complex, 2012, 24: 3106–3118.

[7] Owen R, Huanquan Z, Hepworth S R, Patricia L, Reinhard J, Ljerka K.encodes an alcohol-forming fatty acyl-coenzyme A reductase involved in cuticular wax production in, 2006, 142: 866–877.

[8] Wang M, Wang Y, Wu H, Xu J, Li T, Hegebarth D, Jetter R, Chen L, Wang Z.Three TaFAR genes function in the biosynthesis of primary alcohols and the response to abiotic stresses in, 2016, 6: 25008.

[9] Tulloch A P.Composition of leaf surface waxes ofspecies: variation with age and tissue, 1973, 12: 2225–2232.

[10] Wettstein-Knowles P V, S?gaard B.Theregion in barley: gene cluster or multifunctional gene, 1980, 45: 125–141.

[11] Zhang Z, Wang W, Li W.Genetic interactions underlying the biosynthesis and inhibition of beta-diketones in wheat and their impact on glaucousness and cuticle permeability, 2013, 8: e54129.

[12] Hen-Avivi S, Savin O, Racovita R C, Lee W S, Adamski N M, Malitsky S, Almekias-Siegl E, Levy M, Vautrin S, Berges H, Friedlander G, Kartvelishvily E, Ben-Zvi G, Alkan N, Uauy C, Kanyuka K, Jetter R, Distelfeld A, Aharoni A.A metabolic gene cluster in the wheatand the barleyloci determines beta-diketone biosynthesis and glaucousness, 2016, 28: 1440–1460.

[13] Pighin J A, Huanquan Z, Balakshin L J, Goodman I P, Western T L, Reinhard J, Ljerka K, A Lacey S.Plant cuticular lipid export requires an ABC transporter, 2004, 306: 702–704.

[14] Debono A, Yeats T H, Rose J K C, Bird D, Jetter R, Kunst L, Samuels L.LTPG is a glycosylphosphatidylinositol-anchored lipid transfer protein required for export of lipids to the plant surface, 2009, 21: 1230–1238.

[15] Li L, Chai L, Xu H, Zhai H, Wang T, Zhang M, You M, Peng H, Yao Y, Hu Z, Xin M, Guo W, Sun Q, Chen X, Ni Z.Phenotypic characterization of themutant and fine mapping ofin common wheat (L.), 2021, 134: 835–847.

[16] Marioni J C, Mason C E, Mane S M, Stephens M, Gilad Y.RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays, 2008, 18: 1509–1517.

[17] Love M I, Huber W, Anders S.Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2, 2014, 15: 550.

[18] Livak K J, Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2?ΔΔCTmethod, 2001, 25: 402–408.

[19] Young M D, Wakefield M J, Smyth G K, Oshlack A.Gene ontology analysis for RNA-seq: accounting for selection bias, 2010, 11: R14.

[20] Chen Y, Song W, Xie X, Wang Z, Guan P, Peng H, Jiao Y, Ni Z, Sun Q, Guo W.A collinearity-incorporating homology inference strategy for connecting emerging assemblies in triticeae tribe as a pilot practice in the plant pangenomic era, 2020, 13: 1694–1708.

[21] Huang D, Feurtado J A, Smith M A, Flatman L K, Koh C, Cutler A J.Long noncoding miRNA gene represses wheat beta- diketone waxes, 2017, 114: E3149–E3158.

[22] Liu Y, Wang H, Jiang Z, Wang W, Xu R, Wang Q, Zhang Z, Li A, Liang Y, Ou S, Liu X, Cao S, Tong H, Wang Y, Zhou F, Liao H, Hu B, Chu C.Genomic basis of geographical adaptation to soil nitrogen in rice, 2021, 590: 600–605.

[23] Li L, Qi Z, Chai L, Chen Z, Wang T, Zhang M, You M, Peng H, Yao Y, Hu Z, Xin M, Guo W, Sun Q, Ni Z.The semidominant mutationimpairs epicuticular wax deposition in common wheat (L.), 2020, 133: 1213–1225.

[24] Adamski N M, Bush M S, Simmonds J, Turner A S, Mugford S G, Jones A, Findlay K, Pedentchouk N, von Wettstein-Knowles P, Uauy C.The inhibitor oflocus () prevents formation of beta- and OH-beta-diketones in wheat cuticular waxes and maps to a sub-cM interval on chromosome arm 2BS, 2013, 74: 989–1002.

[25] Bianchi G, Figini M L.Epicuticular waxes of glaucous and nonglaucous durum wheat lines, 1986, 34: 429–433.

[26] Chen G, Komatsuda T, Ma J F, Nawrath C, Pourkheirandish M, Tagiri A, Hu Y G, Sameri M, Li X, Zhao X, Liu Y, Li C, Ma X, Wang A, Nair S, Wang N, Miyao A, Sakuma S, Yamaji N, Zheng X, Nevo E.An ATP-binding cassette subfamily G full transporter is essential for the retention of leaf water in both wild barley and rice, 2011, 108: 12354–12359.

[27] Cameron K D, Teece M A, Smart L B.Increased accumulation of cuticular wax and expression of lipid transfer protein in response to periodic drying events in leaves of tree tobacco, 2006, 140: 176–183.

Transcriptome profiling ofmutant with glossy glume in common wheat (L.)

LI Ling-Hong, ZHANG Zhe, CHEN Yong-Ming, YOU Ming-Shan, NI Zhong-Fu, and XING Jie-Wen*

College of Agronomy, China Agricultural University, Beijing 100193, China

In order to clarify the molecular mechanism of the significant change in glume wax content, transcriptome profiling was performed on glossy glume mutantand its wild-type Jimai 22.The results showed that a total of 12,230 differentially expressed genes were screened in themutant, among which 5811 genes were up-regulated and 6419 were down-regulated.GO functional enrichment revealed that the differentially expressed genes were mainly enriched in the wax synthesis and transport pathway, specifically distributed in acyltransferase activity, lipid binding, hydrolase activity.The findings suggested that these pathways were closely related to the glume-wax-deficient trait in wheat.We also detected the relative expression levels of some genes involved in the wax metabolic pathway by RT-qPCR, and the results were consistent with the transcriptome data.This study not only provides data support for the further study of the molecular mechanism of wax metabolism and gene regulation network but also lays a theoretical foundation for the breeding of stress-resistant variety in wheat.

wheat; epicuticular wax;mutant; transcriptome analysis; molecular mechanism

2021-01-12;

2021-04-14;

2021-05-21.

10.3724/SP.J.1006.2022.11006

通信作者(Corresponding author): 邢界文, E-mail: Jiewen.Xing@cau.edu.cn

E-mail: lilinghong00en@163.com

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31991214)和國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2017YFD0101004)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31991214) and the National Key Research and Development Program of China (2017YFD0101004).

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20210521.1245.002.html