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    MPN法在注射用利福平中間體需氧菌總數(shù)檢測中的研究

    2022-11-04 11:21:56王連國易大為周少彤馬輝
    品牌與標(biāo)準(zhǔn)化 2022年4期

    王連國 易大為 周少彤 馬輝

    【關(guān)鍵詞】利福平;中間體;需氧菌總數(shù);MPN

    利福平(Rifampicin)是利福霉素B的一種衍生物,具有抗菌力強,抗菌譜廣的特性。其低濃度抑菌,高濃度殺菌,對結(jié)核桿菌、多數(shù)革蘭氏陽性菌有強大快速的抗菌作用,同時對麻風(fēng)桿菌、某些革蘭氏陰性菌有抑制作用[1]。通常利福平被制成膠囊或片劑等口服劑型,與其他抗結(jié)核藥合用協(xié)同殺菌,而注射用利福平作為利福平口服制劑的替代劑型,在病人不耐受口服治療時使用[2]。

    目前國內(nèi)尚無用于利福平無菌制劑直接分裝的原料藥。注射用利福平的一般工藝是在利福平非無菌原料藥中加入適當(dāng)助溶劑,經(jīng)濃配、稀釋、除菌過濾、冷凍干燥而成。有文獻(xiàn)指出,非無菌物料除菌過濾前的生物負(fù)載應(yīng)盡量最小化,以防止對過濾介質(zhì)的挑戰(zhàn),降低最終產(chǎn)品的品質(zhì),有必要設(shè)定預(yù)過濾中間體的微生物限度[3]。通常建議最終過濾除菌前,料液的微生物負(fù)荷不超過10 cfu/100 mL[4]??梢姡唇?jīng)過濾除菌的料液的生物負(fù)載,即注射用利福平中間體的微生物污染水平是注射用利福平無菌工藝過程的關(guān)鍵指標(biāo),關(guān)乎注射劑成品的無菌水平。因此,建立注射用利福平中間體微生物限度的檢查方法具有一定的現(xiàn)實意義,具體研究如下。

    1 試驗材料

    1.1 供試樣品

    注射用利福平中間體,批號:20201204、20201210,沈陽某藥廠生產(chǎn)。

    1.2 儀器

    HFSAFE-1500 生物安全柜(上海力申科學(xué)儀器有限公司);KB240 培養(yǎng)箱(Binder corporation Germany);SX-700 高壓滅菌器(TOMY. KOGYO. Japan);SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);GN-6 Metricel Grid 濾膜及濾器(Pall corporation USA);MaxQ 4000 恒溫?fù)u床(賽默飛世爾科技有限公司);HTY-2000A集菌儀(杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司);EVS3 全封閉式濾器(杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司)。

    1.3 菌種

    枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63501]、金黃色葡萄球菌(StapHylococcus aureus)[CMCC(B)26003]、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B)10104]、大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]、白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]、黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F)98003]均由中國食品藥品檢定研究院提供。上述試驗菌經(jīng)復(fù)蘇、傳代,用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋制成含菌數(shù)約為10~102 cfu/ml的溶液,臨用新制。

    1.4 試劑

    丙三醇(國藥集團化學(xué)試劑有限公司,批號20160203);氯化鈉(國藥集團化學(xué)試劑有限公司,批號2019318)。

    1.5 培養(yǎng)基

    胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB,北京三藥科技開發(fā)公司,批號20200918);胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(TSA,北京三藥科技開發(fā)公司,批號20201015);沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA,北京三藥科技開發(fā)公司,批號20201015);SCDLP 液體培養(yǎng)基(北京三藥科技開發(fā)公司,批號20200921)。上述培養(yǎng)基均為即用型成品培養(yǎng)基,使用前進(jìn)行培養(yǎng)基適用性檢查,均符合規(guī)定。

    2 試驗方法

    2.1 薄膜過濾法測定需氧菌總數(shù)的驗證試驗

    由于利福平抗細(xì)菌力很強,驗證試驗中每張濾膜的載藥量均設(shè)置為10 mL的注射用利福平中間體,污染微生物的限度擬設(shè)定≤1 cfu/10mL。取10 mL的注射用利福平中間體,用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至200 mL,作為供試品溶液,臨用新制。

    取供試品溶液200 mL 經(jīng)薄膜過濾,用保溫至44 ℃的含5%丙三醇的SCDLP液體培養(yǎng)基1000 mL沖洗濾膜濾器,每次沖洗量為100 mL,在最后一次沖洗液中加入小于100 cfu 金黃色葡萄球菌,過濾,轉(zhuǎn)移濾膜,菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上。

    按上述處理方法,分別在最后一次沖洗液中加入小于100 cfu 的銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉,過濾,轉(zhuǎn)移濾膜,菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上。同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數(shù)、陰性對照。上述平板于30~35 ℃倒置培養(yǎng)3~5 天,觀察,計數(shù)。

    2.2 MPN法結(jié)合薄膜過濾法測定需氧菌總數(shù)的驗證試驗

    本試驗主要考察擬定方法去除抗菌活性成分的效果。取注射用利福平中間體30 mL,用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至400 mL,作為供試品溶液①;取中間體3 mL,用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至40 mL,作為供試品溶液②;取中間體0.3 mL,用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至10 mL,作為供試品溶液③,備用。

    取三聯(lián)集菌器,用0.9%無菌氯化鈉溶液潤濕濾器及濾膜。取供試品溶液①400 mL,全部通過三聯(lián)集菌器過濾。用2700 mL的含5%丙三醇的無菌SCDLP液體培養(yǎng)基沖洗濾器,每次每膜沖洗100 mL,在最后一次沖洗液中分別于每個濾筒中加入小于100 cfu 的金黃色葡萄球菌,過濾,每個濾筒中各加入100 mL 的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基。在30~35 ℃培養(yǎng)3天,觀察結(jié)果。

    又取MPN法供試品溶液①,按上述方法操作,分別于每個濾筒中加入小于100 cfu 的大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉,過濾,每個濾筒中各加入100 mL的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基。在30~35 ℃培養(yǎng)3 天,觀察結(jié)果。

    2.3 MPN法結(jié)合薄膜過濾法測定需氧菌總數(shù)的適用性試驗

    取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、白色念珠菌菌液(10~102 cfu/mL)作為第一稀釋級的試驗菌液;繼續(xù)10 倍稀釋和100 倍稀釋,作為第二稀釋級和第三稀釋級的試驗菌液。

    取MPN法供試品溶液①400 mL全部通過三聯(lián)集菌器過濾,用2700 mL的44 ℃含5%丙三醇的無菌SCDLP 液體培養(yǎng)基沖洗濾器,每次每膜沖洗100 mL,各管中加100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基,各管中接種第一稀釋級的金黃色葡萄球菌菌液;取MPN法供試品溶液②40 mL全部通過三聯(lián)集菌器過濾,用2700 mL的44 ℃含5%丙三醇的無菌SCDLP 液體培養(yǎng)基沖洗濾器,每次每膜沖洗100 mL,各管中加100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基,各管中接種第二稀釋級的金黃色葡萄球菌菌液;取MPN法供試品溶液③10 mL全部通過三聯(lián)集菌器過濾,用2700 mL的44 ℃含5%丙三醇的無菌SCDLP 液體培養(yǎng)基沖洗濾器,每次每膜沖洗100 mL,各管中加100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基,各管中接種第三稀釋級的金黃色葡萄球菌菌液。

    上述9 管于30~35 ℃培養(yǎng)3 天,觀察,計數(shù)。根據(jù)微生物生長的管數(shù),從《中國藥典》2020 版“1105 非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查:微生物計數(shù)法”表3 試驗組中查金黃色葡萄球菌的最可能數(shù)[5]。另取三套三聯(lián)集菌器,各管中加100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基,每一稀釋級金黃色葡萄球菌菌液取3 份1 mL分別接種至100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,于30~35 ℃培養(yǎng)3 天,觀察,計數(shù)。根據(jù)微生物生長的管數(shù)從表3 中查菌液對照組中金黃色葡萄球菌的最可能數(shù)及對照組菌數(shù)的95%置信限。其他試驗菌(大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌)的計數(shù)方法同金黃色葡萄球菌。

    2.4 含中和劑沖洗液無毒性的證實試驗

    取三聯(lián)集菌器,用1000 mL的含5%丙三醇的無菌SCDLP液體培養(yǎng)基沖洗濾器,每次每膜沖洗100 mL,在最后一次沖洗液中分別加入小于100 cfu 的試驗菌,各管中加100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基,在30~35 ℃培養(yǎng)3天,觀察結(jié)果。

    3 結(jié)果

    3.1 薄膜過濾法的驗證試驗結(jié)果

    試驗結(jié)果見表1。金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌試驗組菌回收率均低于0.5,銅綠假單胞菌、白色念珠菌和黑曲霉試驗組菌回收率在0.5~2 范圍內(nèi),按照《中國藥典》2020 版“1105 非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查:微生物計數(shù)法”供試品中微生物回收的判定原則,上述方法不適于需氧菌總數(shù)測定。

    3.2 MPN法結(jié)合薄膜過濾法的驗證試驗結(jié)果

    試驗結(jié)果見表2。用2700 mL的44 ℃含5%丙三醇的無菌SCDLP液體培養(yǎng)基沖洗濾器9 次,各試驗菌在72 h 內(nèi)生長良好,可以按此方法去除抗菌活性。

    3.3 MPN法結(jié)合薄膜過濾法計數(shù)方法適用性試驗結(jié)果

    試驗結(jié)果見表3。采用MPN法結(jié)合薄膜過濾法,各試驗菌的菌數(shù)均在各菌液對照組菌數(shù)的95%置信限內(nèi),可作為此品種的需氧菌總數(shù)的計數(shù)方法。

    3.4 含中和劑沖洗液無毒性證實試驗結(jié)果

    試驗結(jié)果見表4,各試驗菌在規(guī)定時間內(nèi)均生長良好,含5%丙三醇的無菌SCDLP液體培養(yǎng)基對各試驗菌無毒性。

    4 結(jié)果

    4.1 經(jīng)驗證,注射用利福平中間體需氧菌總數(shù)可采用MPN法結(jié)合薄膜過濾法測定

    在規(guī)定培養(yǎng)條件下,若供試品各濃度的試驗管均無菌生長,即生長管數(shù)為0、0、0,則每100 mL中間體中污染的需氧菌總數(shù)報告值<3 cfu,該計數(shù)方法的檢出限低于本品預(yù)設(shè)微生物污染最大允許值10 cfu/100 mL,可用于本品需氧菌總數(shù)測定。

    4.2 注射用利福平(中間體)-微生物限度檢查法正文表述

    分別取本品30 mL(相當(dāng)于3 份10 mL)、3 mL(相當(dāng)于3 份1 mL)和0.3 mL(相當(dāng)于3 份0.1 mL),分別溶于0.9%無菌氯化鈉溶液400 mL、40 mL 和10 mL 中,作為供試品溶液①、②和③。

    取全封閉濾器3 組,分別用0.9%無菌氯化鈉溶液潤濕濾器及濾膜。取供試品溶液①,經(jīng)薄膜過濾法處理,用44 ℃含5%丙三醇的無菌SCDLP液體培養(yǎng)基2700 mL分次沖洗,每次每膜沖洗100 mL,沖洗9 次,各管中加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100 mL;同法處理供試品溶液②和③。按《中國藥典》2020 版中規(guī)定的MPN法進(jìn)行培養(yǎng),記錄每一稀釋級微生物生長的管數(shù),從表3 中查每100 mL 供試品中需氧菌總數(shù)的最可能數(shù)。每100 mL供試品中需氧菌總數(shù)不得過10 cfu。

    5 討論

    雖然MPN 法(Most-Probable-Number Method)用于微生物計數(shù)時精確度較差,但對微生物污染量很小的供試品,MPN法可能是最適合的方法[6],比較適合本品種的限度要求。利福平對多種病原微生物均有較強抗菌活性,本品設(shè)定的微生物污染允許限又相對苛刻,這種情況下MPN法更適宜注射用利福平中間體需氧菌總數(shù)測定。

    SCDLP 液體培養(yǎng)基中含有一定量的中和劑和表面活性劑,每1000 mL培養(yǎng)基中含蛋白胨20 g,氯化鈉5 g,磷酸氫二鉀2.5 g,葡萄糖2.5 g,卵磷脂1 g,吐溫-80 7 g。沖洗液使用44 ℃含5%丙三醇的無菌SCDLP液體培養(yǎng)基,丙三醇有一定的助溶作用,溫?zé)岬臎_洗液可提高沖洗效果。

    《中國藥典》指出MPN法不適于霉菌計數(shù),考慮利福平的抗菌譜中不包括霉菌,故本品仍存在霉菌污染的風(fēng)險,宜參考有關(guān)研究[7],增加霉菌數(shù)檢測。

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