NRTUAs感染對(duì)小鼠的組織荷蟲量及脾臟細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平的影響

任 超 王超越 盧春霞 王 思 段春慧 劉賢勇 索 勛*

(1.天津農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院/天津市農(nóng)業(yè)動(dòng)物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京100193)

非增殖型尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型弓形蟲(Nonreplicating toxoplasma uracil auxotrophs，NRTUAs)是敲除弓形蟲的乳清酸核苷-5’-單磷酸脫羧酶(Orotidine-5’-monophosphate decarboxylase，ompdc)和尿嘧啶核苷磷酸化酶(Uridine phosphorylase，up)基因的蟲體[1-2]。NRTUAs體外必須在含有尿嘧啶的培養(yǎng)基中才能增殖，而在動(dòng)物體內(nèi)只能入侵宿主細(xì)胞卻不能增殖，進(jìn)而降低蟲體的毒力和致病性[1]。NRTUAs感染免疫缺陷的動(dòng)物，如IFN-γ敲除的小鼠或NOD/scid/gamma小鼠，NRTUAs表現(xiàn)為無(wú)致病性，而且感染小鼠能安全耐受，為NRTUAs能夠應(yīng)用于腫瘤的治療提供安全保障[2-4]。NRTUAs能夠調(diào)節(jié)宿主的免疫系統(tǒng)，改善腫瘤的免疫抑制微環(huán)境。針對(duì)黑色素瘤、卵巢癌和胰腺癌，NRTUAs刺激機(jī)體迅速產(chǎn)生Th1型細(xì)胞因子，如IL-12和IFN-γ，并激活腫瘤相關(guān)區(qū)域和脾臟CD8+和CD4+T細(xì)胞，進(jìn)而調(diào)節(jié)荷瘤小鼠的免疫機(jī)能，活化腫瘤抗原特異性CD8+T細(xì)胞，激發(fā)荷瘤小鼠產(chǎn)生顯著的抗腫瘤反應(yīng)；NRTUAs還能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分泌趨化因子CXCL9和CXCL10，招募T細(xì)胞，并影響腫瘤細(xì)胞的抗原呈遞和對(duì)T細(xì)胞分泌的IFN-γ的響應(yīng)能力，從而調(diào)節(jié)T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷[4-7]。

NRTUAs抗腫瘤效應(yīng)基于弓形蟲自身抗原和蟲體的分泌抗原能夠調(diào)節(jié)宿主的免疫反應(yīng)。弓形蟲profilin蛋白能夠激活單核巨噬細(xì)胞的TLR11與TLR12，活化MyD88并啟動(dòng)下游信號(hào)通路，產(chǎn)生IL-12，激活先天性免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)[8-9]。TLR7識(shí)別弓形蟲的單鏈RNA，TLR9識(shí)別弓形蟲基因組中非甲基化CpGDNA和寡核苷酸，當(dāng)TLR11缺乏時(shí)，TLR7和TLR9能誘導(dǎo)MyD88活化發(fā)揮作用[10-11]。研究表明，具有活性的NRTUAs主動(dòng)入侵宿主細(xì)胞并能產(chǎn)生和分泌微線體(MIC)、棒狀體(ROP)和致密顆粒(GRA)，調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄途徑的調(diào)控，才能誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ并激活抗腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞免疫反應(yīng)，而ROP5、ROP18、ROP35、ROP38、GRA2、GRA12和GRA24的缺失顯著降低了NRTUAs的抗腫瘤反應(yīng)[5,12-13]。TLR2能夠識(shí)別弓形蟲MIC，如MIC1和MIC4，也可被弓形蟲表面的糖基磷脂酰肌醇(Glycosyl phosphatidyl inositol，GPI)、弓形蟲熱休克蛋白(Heat shock proteins，HSPs)所激活，進(jìn)而調(diào)節(jié)TNF-α和CCL2的表達(dá)[14-15]。TLR2與TLR1和TLR6形成二聚體表達(dá)于細(xì)胞表面，受抗原刺激后引起細(xì)胞活化，并上調(diào) IL-12 的表達(dá)[16]。MIC1和MIC4通過(guò)TLR4內(nèi)吞作用誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-10，從而抑制宿主的炎癥反應(yīng)，減輕過(guò)度炎癥反應(yīng)造成的病理?yè)p傷[17]。上述研究表明，NRTUAs能夠激發(fā)宿主多種TLRs，通過(guò)刺激先天性免疫與適應(yīng)性免疫，能夠打破腫瘤微環(huán)境的免疫耐受，激活腫瘤抗原特異性CD8+T細(xì)胞群的強(qiáng)效殺傷功能，表現(xiàn)出類似免疫增強(qiáng)劑的功效[1]。

目前，很多NRTUAs均以I型強(qiáng)毒株為背景構(gòu)建[2-3,18-19]，而昆明小鼠對(duì)I型蟲株非常敏感，1個(gè)速殖子感染都可以導(dǎo)致小鼠死亡[20]。因此，將NRTUAs作為畜禽免疫增強(qiáng)劑開展功能性研究之前，都要以小鼠為模型，檢測(cè)NRTUAs對(duì)小鼠的致病性，以初步評(píng)估NRTUAs能否進(jìn)一步應(yīng)用。鄂立林等[18]構(gòu)建NRTUAs，并發(fā)現(xiàn)NRTUAs對(duì)小鼠無(wú)致死性，是一種減毒甚至基本無(wú)毒的弓形蟲活疫苗，具有作為生物免疫治療載體的應(yīng)用潛力。任超等[19]以弓形蟲Δku80RH蟲株為背景蟲株，利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除其ompdc和up基因，構(gòu)建NRTUAs，通過(guò)初步探討NRTUAs對(duì)小鼠的致病性，發(fā)現(xiàn)NRTUAs對(duì)小鼠無(wú)致死性，且感染NRTUAs的小鼠各器官無(wú)病理變化。然而NRTUAs在小鼠重要器官的組織分布與清除情況，以及NRTUAs激發(fā)宿主先天性免疫相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)情況均未知，這些也是影響NRTUAs實(shí)際應(yīng)用的安全性與有效性。因此，本研究通過(guò)分析NRTUAs感染小鼠的組織荷蟲量與脾臟相關(guān)細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)一步研究NRTUAs對(duì)小鼠的致病性，為NRTUAs作為畜禽免疫增強(qiáng)劑的應(yīng)用奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物

7周齡雌性SPF級(jí)昆明小鼠72只，體重為(20±2) g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼料充足，飲水不限，健康狀況良好。

1.1.2細(xì)胞與蟲株

人包皮成纖維細(xì)胞(HFF)、弓形蟲Δku80RH蟲株和NRTUAs，由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家動(dòng)物原蟲實(shí)驗(yàn)室保存。其中NRTUAs以弓形蟲Δku80RH蟲株為背景蟲株，利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除弓形蟲ompdc和up基因而構(gòu)建，體外培養(yǎng)中，細(xì)胞培養(yǎng)液中需要添加250 μmol/L尿嘧啶維持NRTUAs增殖[19]。

1.1.3精密儀器和試劑

分光光度計(jì)，購(gòu)自ThermoFisher公司；Real-time PCR儀和PCR儀，購(gòu)自美國(guó)ABI公司；基因組提取試劑盒，購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒，購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司；RNA提取試劑盒，購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；相對(duì)定量qPCR SuperMix，購(gòu)自美國(guó)ABI公司；絕對(duì)定量Probe qPCR SuperMix，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1非增殖型尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型弓形蟲感染小鼠的組織荷蟲量檢測(cè)

(1)組織荷蟲量檢測(cè)方法建立

參考NCBI Genebank中B1基因的部分序列(AF179871)，按照基因組提取試劑盒的說(shuō)明書提取Δku80蟲株的基因組，并以此為模板，擴(kuò)增B1序列，引物參考Lin等[21]2000年發(fā)表的文章，檢測(cè)引物和探針見表1。將獲得的B1片段連接到pEASY-T1 Simple克隆載體上構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。將10-1～10-12稀釋倍數(shù)的B1標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，檢測(cè)引物見表1。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果形成的溶解曲線和擴(kuò)增曲線，來(lái)判斷熒光定量引物是否適合，并選擇適宜稀釋倍數(shù)的B1標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(2)組織荷蟲量檢測(cè)

將雌鼠隨機(jī)分成3組，每組24只，在實(shí)驗(yàn)第0天，各組以腹腔注射方式分別感染NRTUAs、Δku80蟲株，速殖子懸液濃度為107個(gè)/mL，感染劑量為0.1 mL/只，同時(shí)腹腔注射等劑量的無(wú)菌PBS為空白對(duì)照。在試驗(yàn)第0～7天，每日各組隨機(jī)剖檢3只小鼠，取脾臟、肝臟、肺臟和腦組織，用于荷蟲量檢測(cè)。按試劑盒要求，每個(gè)待檢組織取適量，稱重并記錄，用組織研磨機(jī)進(jìn)行勻漿處理。11 000 r/min離心2 min，完全棄去上清，后續(xù)步驟詳見基因組提取試劑盒說(shuō)明書。取1 μL待檢組織基因組進(jìn)行絕對(duì)熒光定量PCR，反應(yīng)條件為94 ℃，30 s；94 ℃，5 s；60 ℃，30 s。獲得待檢組織的拷貝數(shù)，根據(jù)B1標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的初始濃度，推算出待檢組織的荷蟲量。

表1 組織荷蟲量qPCR反應(yīng)引物和探針[21]Table 1 qPCR primers and probe of parasite load[21]

1.2.2非增殖型尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型弓形蟲感染小鼠后脾臟細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平分析

(1)RNA提取與純化：采集實(shí)驗(yàn)第1～3天的各組脾臟，分別取5 mg，加入350 μL裂解液 RLT Plus，電動(dòng)勻漿器將組織徹底研磨勻漿，離心13 000 r/min，3 min，后續(xù)按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取脾臟組織的RNA。

(2)反轉(zhuǎn)錄：獲得的RNA通過(guò)分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒實(shí)施反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)，獲得的cDNA保存于-20 ℃。

(3)相對(duì)熒光定量PCR：將cDNA稀釋10倍進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)引物見表2，反應(yīng)條件為 50 ℃，2 min；95 ℃，2 min；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min。

1.2.3數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 非增殖型尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型弓形蟲感染小鼠的組織荷蟲量檢測(cè)

2.1.1組織荷蟲量檢測(cè)方法建立

B1片段的擴(kuò)增大小為98 bp(圖1(a))，構(gòu)建好的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒大小為3 927 bp，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的分子量為2.59×106g/mol，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒質(zhì)量濃度為0.335 g/mL，根據(jù)公式計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的拷貝數(shù)為7.786×1013copies/μL。B1標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒經(jīng)過(guò)逐級(jí)稀釋，選擇其中呈線性較好的5個(gè)數(shù)量級(jí)梯度，每個(gè)梯度的Ct值相差約-3.3，R2>0.99，效率>95%(圖1(b)和(c))，可用于后續(xù)的絕對(duì)熒光定量檢測(cè)。

表2 小鼠細(xì)胞因子qPCR反應(yīng)引物Table 2 Primers for qPCR of mouse cytokines

(a) B1標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒鑒定：1、2：B1標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒鑒定為陽(yáng)性；M：DNA標(biāo)準(zhǔn)AL5000；(b)標(biāo)準(zhǔn)曲線；(c)擴(kuò)增曲線。(a) Identification of B1 standard plasmid:1,2:Identification of B1 standard plasmid was positive;M:AL5000 DNA Marker；(b) Standard curve;(c) Amplification curve。圖1 組織荷蟲量檢測(cè)方法建立Fig.1 Establishment of a method to detect parasite load

2.1.2組織荷蟲量檢測(cè)

試驗(yàn)前各組小鼠組織中未檢出蟲體，試驗(yàn)中每日檢測(cè)脾臟、肝臟、肺臟、腦組織的荷蟲量，NRTUAs組各器官組織荷蟲量的平均水平不高于Δku80組(圖2)。由于Δku80組小鼠在第6天全部死亡，所以Δku80組的組織荷蟲量只檢測(cè)感染后第0～6天。NRTUAs組小鼠一直檢測(cè)到感染后第7天，發(fā)現(xiàn)均無(wú)死亡。

(a)～(d)分別為兩組脾臟、肝臟、肺臟和腦組織的荷蟲量；(e)～(h)分別為NRTUAs組脾臟、肝臟、肺臟和腦組織的荷蟲量。*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001，****代表P<0.000 1，無(wú)標(biāo)記代表P>0.05。(a)-(d) respectively represent parasite load in spleen,liver,lung and brain of two groups.(e)-(h) respectively represent parasite load in spleen,liver,lung and brain of NRTUAs group.* means P<0.05,** means P<0.01,*** means P<0.001,**** means P<0.000 1,no sign means P>0.05.圖2 小鼠脾臟、肝臟、肺臟、腦組織的荷蟲量Fig.2 Parasite load in spleen,liver,lung and brain of mice

脾臟的荷蟲量，僅在感染后第5天，NRTUAs組極顯著低于Δku80組(P<0.001)，其他時(shí)間兩組差異不顯著(P>0.05)。NRTUAs組每日的荷蟲量也是上下浮動(dòng)，變化趨勢(shì)無(wú)規(guī)律，僅在感染后1～4 d有個(gè)別脾臟未檢出蟲體DNA，其他脾臟均能檢出荷蟲量。Δku80組隨時(shí)間的延長(zhǎng)，脾臟的荷蟲量水平不斷提高(圖2(a)和(e))。

肝臟的荷蟲量，在感染后第5天，NRTUAs組極顯著低于Δku80組(P<0.001)，在感染后第6天，NRTUAs組顯著低于Δku80組(P<0.05)，其他時(shí)間兩組差異不顯著(P>0.05)。NRTUAs組幾乎每日出現(xiàn)個(gè)別肝臟未檢出蟲體DNA，其他肝臟均能檢出荷蟲量。Δku80組隨時(shí)間的延長(zhǎng)，肝臟的荷蟲量水平不斷提高(圖2(b)和(f))。

肺臟的荷蟲量，僅在感染后第6天，NRTUAs組極顯著低于Δku80組(P<0.001)，其他時(shí)間兩組差異不顯著(P>0.05)。NRTUAs組僅在感染后1～3 d有個(gè)別肺臟未檢出蟲體DNA，其他肺臟均能檢出荷蟲量。兩組隨時(shí)間的延長(zhǎng)，肺臟的荷蟲量水平不斷提高(圖2(c)和2(g))。

腦組織的荷蟲量，每日兩組差異均不顯著(P>0.05)。NRTUAs組每日都有腦組織未檢出蟲體DNA。Δku80組在感染后第2～6天，腦組織的荷蟲量平均水平高于NRTUAs組(圖2(d)和(h))。

2.2 非增殖型尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型弓形蟲感染小鼠后脾臟細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平分析

在本試驗(yàn)中，研究NRTUAs感染對(duì)小鼠脾臟相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的影響(圖3)。其中，IL-12在感染第1天，NRTUAs組和Δku80組極顯著高于PBS組(P<0.01)(圖3(a))；TNF-α在感染第3天，NRTUAs組極顯著高于PBS組(P<0.01)，Δku80組顯著高于PBS組(P<0.05)(圖3(b))；IFN-γ在感染第2和3天，Δku80組顯著高于PBS組(P<0.05)(圖3(c))；IL-1β在感染第1天，Δku80組顯著高于NRTUAs組(P<0.05)，極顯著高于PBS組(P<0.000 1)，在感染第2天，Δku80組極顯著高于NRTUAs組(P<0.01)和PBS組(P<0.000 1)，在感染第3天，Δku80組顯著高于PBS組(P<0.05)(圖3(d))；IL-6在感染第1天，Δku80組顯著高于PBS組(P<0.05)，在感染第2天，Δku80組極顯著高于NRTUAs組(P<0.001)和PBS組(P<0.000 1)，在感染第3天，Δku80組極顯著高于NRTUAs組(P<0.01)和PBS組(P<0.001)(圖3(e))；IL-10在感染第2天，Δku80組顯著高于PBS組(P<0.05)，在感染第3天，NRTUAs組(P<0.001)和Δku80組(P<0.000 1)極顯著高于PBS組(圖3(f))。

3 討論與結(jié)論

尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型弓形蟲有弓形蟲ΔcpsIIRH蟲株(cps1-1)、弓形蟲ΔompdcΔku80RH 蟲株和弓形蟲ΔompdcΔupΔku80RH蟲株[2-3]。其中cps1-1蟲株和ΔompdcΔku80RH 蟲株阻斷了嘧啶從頭合成途徑，減輕了蟲體的毒力和致病性，但蟲體存在嘧啶補(bǔ)救途徑，在宿主體內(nèi)能夠緩慢增殖，長(zhǎng)期存在動(dòng)物體內(nèi)，蟲體的毒力具有返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)，不能應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖中[2-3]。因此，弓形蟲 ΔompdcΔupΔku80RH蟲株才是真正的NRTUAs[1]。由于嘧啶從頭合成途徑和嘧啶補(bǔ)救途徑均被阻斷，NRTUAs可能沒(méi)有能力去利用宿主細(xì)胞的UP來(lái)完成嘧啶補(bǔ)救途徑進(jìn)而維持蟲體的增殖，或是NRTUAs利用宿主細(xì)胞的UP并獲得宿主細(xì)胞的尿嘧啶，但這條途徑產(chǎn)出的UMP不足以維持NRTUAs的增殖，進(jìn)而不能在宿主細(xì)胞內(nèi)增殖，這就確保了NRTUAs在畜禽養(yǎng)殖中使用的安全性[22]。

研究表明，NRTUAs能夠激發(fā)宿主良好的細(xì)胞免疫應(yīng)答，既是優(yōu)秀的抗弓形蟲疫苗株，又是潛在的抗腫瘤神器[1]。然而蟲體入侵宿主細(xì)胞，在宿主體內(nèi)的存續(xù)時(shí)間亦對(duì)蟲體的使用安全性提出新的挑戰(zhàn)。研究表明，NRTUAs感染小鼠后，5 d左右就能被機(jī)體的免疫系統(tǒng)快速清除[1，23]。然而在本研究中，通過(guò)絕對(duì)熒光定量PCR進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)NRTUAs組小鼠的脾臟、肝臟、肺臟和腦組織，在感染后第7天，仍然能檢出蟲體DNA，這與前人的研究相悖。Dupont等[23]研究NRTUAs在小鼠體內(nèi)的存續(xù)時(shí)間中，只檢測(cè)了脾臟、淋巴結(jié)等免疫系統(tǒng)，對(duì)于其他器官并未進(jìn)行系統(tǒng)檢測(cè)，而且其檢測(cè)手段通過(guò)對(duì)免疫系統(tǒng)的相關(guān)組織分離抗原遞呈細(xì)胞，經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分選蟲體感染的特異性抗原遞呈細(xì)胞。然而受檢測(cè)樣本的廣度和樣本處理方式的影響，這種研究方法并不能全面判斷NRTUAs被機(jī)體徹底清除。因此，未來(lái)還需要延長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)間，擴(kuò)大檢測(cè)器官組織的種類，并結(jié)合其他技術(shù)手段，如免疫組織化學(xué)、可見光活體成像技術(shù)等，進(jìn)一步研究NRTUAs在體內(nèi)的遷移、分布與清除過(guò)程。

弓形蟲刺激機(jī)體分泌的細(xì)胞因子與全身性炎癥反應(yīng)休戚相關(guān)。IL-12刺激T細(xì)胞和NK細(xì)胞分泌IFN-γ，增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞的殺傷功能；促進(jìn)CD4+T細(xì)胞向Th1型分化，有利于提高吞噬細(xì)胞的活性，作為固有免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁有效提高機(jī)體的細(xì)胞免疫功能進(jìn)而對(duì)抗弓形蟲的感染[24-25]。小鼠的CD8α+DC通過(guò)TLR11和TLR12識(shí)別并結(jié)合弓形蟲profilin蛋白，活化MyD88并啟動(dòng)下游信號(hào)通路，產(chǎn)生IL-12，并在急性感染期間，刺激T細(xì)胞和NK細(xì)胞分泌IFN-γ，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬功能[8-9]。NRTUAs刺激小鼠脾臟極顯著上調(diào)IL-12、TNF-α和IL-10的表達(dá)，IL-12和TNF-α能夠促進(jìn)Th1型反應(yīng)。盡管Th1型反應(yīng)有利于弓形蟲的清除，但Th1型反應(yīng)過(guò)度會(huì)加劇炎癥，增強(qiáng)組織損傷。IL-10 是介導(dǎo)免疫抑制的細(xì)胞因子，抑制Th1型反應(yīng)，抑制巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌與抗原遞呈功能，緩解因過(guò)度炎癥反應(yīng)而導(dǎo)致的器官和組織損傷[26-27]。IL-10、IL-12和TNF-α 3種細(xì)胞因子共同作用，以溫和的方式協(xié)調(diào)機(jī)體的炎癥反應(yīng)，避免因過(guò)度的炎癥反應(yīng)而導(dǎo)致器官組織損傷。研究發(fā)現(xiàn)NRTUAs感染小鼠的各器官無(wú)顯著的病理變化[19]，而細(xì)胞因子的變化恰好揭示NRTUAs對(duì)小鼠的致病性低。

*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001，****代表P<0.000 1，無(wú)標(biāo)記代表P>0.05。* means P <0.05,** means P<0.01,*** means P<0.001,**** means P<0.000 1,no sign means P>0.05.圖3 小鼠脾臟細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平分析Fig.3 Analysis of cytokine transcription levels in mice spleen

IL-1能夠促進(jìn)抗原遞呈細(xì)胞上調(diào)MCHII分子、各種黏附分子、IFN-γ受體的表達(dá)水平；直接作用于Th細(xì)胞，輔助其活化，在啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的過(guò)程中發(fā)揮重要作用[28]。Δku80組刺激小鼠脾臟表達(dá)高水平的TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ，其中IL-6與IL-1和TNF協(xié)同刺激T細(xì)胞，促進(jìn)全身性炎癥反應(yīng)，IFN-γ的分泌又進(jìn)一步加重了炎癥反應(yīng)。上述細(xì)胞因子聯(lián)合誘導(dǎo)急性炎癥反應(yīng)，雖然IL-10的分泌也顯著提高，但由于誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)過(guò)于猛烈，加速組織損傷，進(jìn)而影響器官功能的發(fā)揮，最終導(dǎo)致小鼠死亡。研究表明，Δku80蟲株感染主要誘發(fā)小鼠的急性炎癥反應(yīng)進(jìn)而導(dǎo)致全身性組織的變性壞死，典型的病變?nèi)鐗乃佬愿窝?、間質(zhì)性肺炎、急性炎性脾腫、非化膿性腦炎等[19]，而上述細(xì)胞因子的變化也佐證了Δku80蟲株對(duì)小鼠的高致病性。

綜上所述，本研究以NRTUAs和Δku80蟲株分別感染小鼠，檢測(cè)各組小鼠的組織荷蟲量與脾臟相關(guān)細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明，NRTUAs感染的小鼠不能在7 d內(nèi)清除蟲體，刺激小鼠脾臟上調(diào)IL-12、TNF-α和IL-10的表達(dá)，誘導(dǎo)溫和的炎癥反應(yīng)，而Δku80蟲株感染的小鼠在感染后6 d內(nèi)死亡，組織荷蟲量平均水平高于NRTUAs感染的小鼠，刺激小鼠脾臟上調(diào)IL-12、TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ和IL-10的表達(dá)，誘導(dǎo)劇烈的炎癥反應(yīng)而導(dǎo)致小鼠死亡。說(shuō)明NRTUAs對(duì)小鼠的致病性較低，NRTUAs組織荷蟲量平均水平低于Δku80蟲株，誘導(dǎo)機(jī)體的炎癥反應(yīng)顯著輕于Δku80蟲株，本研究為NRTUAs作為畜禽免疫增強(qiáng)劑的開發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。