彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中MYD88、CD79B基因特征與臨床病理及預(yù)后的關(guān)系

吳 燦，張大川，王 輝，雷 婷，史勇強(qiáng)，謝雯瑩，賈晨昊，李 青

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL)是最常見的成人淋巴瘤，占非霍奇金淋巴瘤的30%～40%[1]，國際上標(biāo)準(zhǔn)的治療方案為R-CHOP[2]。盡管R-CHOP方案能夠顯著提高DLBCL患者的總生存期(overall survival, OS)和無進(jìn)展生存期(progress-free survival, PFS)，但約40%患者表現(xiàn)為療效差、易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移或疾病進(jìn)展[3]。因此，深入探討其發(fā)生機(jī)制、尋找新的分子靶點(diǎn)成為亟待解決的問題[4]。本文檢測(cè)89例DLBCL中MYD88、CD79B基因突變，分析其臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，旨在更好地了解基因突變?cè)贒LBCL中的作用。

1 材料與方法

1.1 臨床資料選取2016年10月～2020年7月蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院收治的89例DLBCL，其中男性30例，女性59例，年齡34～82歲，中位年齡65歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)病理明確診斷為DLBCL, 非特指型；(2)術(shù)前未進(jìn)行放療或化療；(3)有完整的臨床信息及隨訪結(jié)果；(4)有足夠的組織樣本用于二代測(cè)序(next generation sequencing, NGS)檢測(cè)。

1.2 方法

1.2.1觀察指標(biāo) 記錄患者入院治療時(shí)的年齡、性別、Ann Arbor臨床分期、國際預(yù)后指數(shù)(international prognostic index, IPI)評(píng)分、原發(fā)部位、血清乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)水平。

1.2.2免疫組化 所有標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，3～4 μm厚連續(xù)切片，行常規(guī)HE和免疫組化SP染色。一抗CD20(L26)、CD79a(MX076)、CD10(MX002)、BCL-6(MX042)、MUM1(MX093)、BCL-2(MX022)、c-MYC(EP121)、Ki-67(MXR002)、Cyclin D1(MX0078)、CD3(MX036)、CD5(MX052)、CD21(MX019)，均購自福州邁新公司。Hans分類將DLBCL分為生發(fā)中心B細(xì)胞(germinal center B-cell-like, GCB)型和非生發(fā)中心B細(xì)胞(non-germinal center B-cell-like, non-GCB)型[5]。c-MYC蛋白≥40%腫瘤細(xì)胞陽性及BCL-2蛋白≥50%腫瘤細(xì)胞陽性者為雙陽性[6]。Ki-67≥80%腫瘤細(xì)胞陽性為高增殖指數(shù)[7]。

1.2.3NGS法 用QIAGEN FFPE樣品DNA分離試劑盒從DLBCL石蠟包埋組織提取基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，然后使用SPB磁珠分離純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。使用源奇生物公司淋巴瘤55基因試劑盒，于MiSeq測(cè)序儀測(cè)序(美國Illumina公司，型號(hào)Novaseq 6000)，使用標(biāo)準(zhǔn)化自動(dòng)樣本管理與數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.2.4療效評(píng)價(jià) 患者采用PET-CT進(jìn)行療效評(píng)估，根據(jù)淋巴瘤國際協(xié)作組的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，療效評(píng)價(jià)包括完全緩解(complete response, CR)、部分緩解(partial response, PR)、疾病穩(wěn)定(stable disease, SD)、復(fù)發(fā)或進(jìn)展(stable disease, PD)[8]。OS是指從確診為DLBCL到因腫瘤死亡或隨訪結(jié)束的時(shí)間；PFS是指從確診為DLBCL到腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或病情惡化的時(shí)間。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)及Fisher精確檢驗(yàn)，OS、PFS采用Log-rank進(jìn)行生存分析。本組統(tǒng)計(jì)學(xué)比較均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫表型及基因突變89例DLBCL中(圖1A、B)，GCB型31例，non-GCB型58例；c-MYC/BCL-2雙陽性24例(圖1C、D)。89例DLBCL中，18例MYD88基因突變，突變率為20.2%(18/89)。最常見的突變位點(diǎn)為L(zhǎng)265P，達(dá)56.5%(13/18)，V147A位點(diǎn)突變率為11.1%(2/18)，S243N、M182T及M33T位點(diǎn)突變率均為5.5%(1/18)。19例CD79B基因突變，突變率為21.3%(19/89)。CD79B Y196H、Y196S位點(diǎn)突變率為15.8%(3/19)，CD79B Y196X、Y196C位點(diǎn)突變率為10.5%(2/19)。CD79B Y196C、Y196N、Y196D、A16V、T509G、G135D、C550-1G>A、Tyr196Cys、Ala205fs位點(diǎn)突變率均為5.3%(1/19)。6例MYD88、CD79B基因雙突變，占6.7%(6/89)。

圖1 A.HE染色顯示：DLBCL腫瘤細(xì)胞體積較大，細(xì)胞核內(nèi)可見2～3個(gè)小核仁，呈中心母細(xì)胞形態(tài)；B.腫瘤細(xì)胞CD20胞膜彌漫陽性，SP法；C.c-MYC陽性，SP法；D.BCL-2陽性，SP法

2.2 MYD88、CD79B基因突變及雙突變與DLBCL臨床病理特征的關(guān)系

2.2.1MYD88基因突變與DLBCL臨床病理特征的關(guān)系 non-GCB型DLBCL中，MYD88突變率(16/58，27.5%)顯著高于GCB型(2/31，6.5%，P=0.018)。不同淋巴結(jié)外部位中MYD88基因突變情況：原發(fā)睪丸100%(5/5)，卵巢100%(2/2)，大腿100%(1/1)，原發(fā)乳腺66.7%(2/3)，骨組織50%(1/2)，鼻咽部33.3%(4/12)，舌根25%(1/4)；未發(fā)現(xiàn)MYD88基因突變部位：胃腸道(0/9)，扁桃體(0/6)，頜下腺(0/3)，腮腺(0/2)，會(huì)厭(0/2)，腹腔(0/2)，胸腔(0/1)，甲狀腺(0/1)，脾臟(0/1)，腭部(0/1)，喉部(0/1)，臀部(0/1)。DLBCL淋巴結(jié)外組(15/59，25.4%)MYD88基因突比率高于結(jié)內(nèi)組(3/30，10%)，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.087)。BCL-2陽性組MYD88突變率(16/55，29.1%)高于BCL-2陰性組(2/34，5.9%)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.008)。c-MYC/BCL-2雙陽性組中MYD88突變率(9/24，37.5%)顯著高于非雙陽性組(9/65，13.8%，P=0.030)。Ki-67增殖指數(shù)高與MYD88基因突變顯著相關(guān)，Ki-67增殖指數(shù)≥80%組中MYD88基因突變率(14/47，29.8%)高于Ki-67增殖指數(shù)<80%組(4/42，9.5%，P=0.018，表1)。

2.2.2CD79B基因突變與DLBCL臨床病理特征的關(guān)系 58例non-GCB型DLBCL中CD79B基因突變16例，占27.6%，31例GCB型DLBCL中CD79B基因突變3例，占9.7%，CD79B基因突變以non-GCB型為主，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.049)。Ki-67增殖指數(shù)高與CD79B基因突變顯著相關(guān)，Ki-67增殖指數(shù)≥80%組中CD79B基因突變率(15/47，40.5%)高于Ki-67增殖指數(shù)<80%組(4/42，9.5%，P=0.010，表1)。

2.2.3MYD88/CD79B基因雙突變與DLBCL臨床病理特征的關(guān)系 c-MYC/BCL-2雙陽性組中MYD88/CD79B基因雙突變率(5/24，20.8%)顯著高于c-MYC/BCL-2非雙陽性組(1/65，1.5%，P=0.006)。Ki-67增殖指數(shù)高與MYD88/CD79B基因雙突變相關(guān)，Ki-67增殖指數(shù)≥80%組中MYD88/CD79B基因突變率(6/47，12.8%)高于Ki-67增殖指數(shù)<80%組(0/42，0，P=0.048，表1)。

表1 MYD88、CD79B、MYD88/CD79B基因突變與DLBCL臨床病理特征的關(guān)系

2.3 療效比較58例患者采用R-CHOP方案治療4周期后初次評(píng)估治療效果，CR率為53.4%，PR率為36.2%，PD率為10.3%。非CR組MYD88基因突變率(12/27，44.4%)顯著高于CR組(3/31，9.7%，P=0.004)。4周期化療結(jié)束后進(jìn)行中期評(píng)估，非CR組MYD88/CD79B基因雙突變率(5/27，18.5%)高于CR組(0/32，0，P=0.042，表2)；提示MYD88基因突變、MYD88/CD79B基因雙突變患者的中期療效評(píng)估時(shí)不易達(dá)到CR。

表2 MYD88、CD79B、MYD88/CD79B基因突變與療效評(píng)估的關(guān)系

2.4 生存分析89例DLBCL患者中位隨訪時(shí)間36個(gè)月(1～60個(gè)月)。2組生存分析結(jié)果顯示，MYD88基因突變組與非突變組患者2年OS分別為77.8%與76.1%，PFS分別為55.6%與70.4%，組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.034、0.021，圖2A、B)。MYD88/CD79B基因雙突變組與非雙突變組患者2年OS分別為42.9%與76.7%，PFS分別為33.3%與69.9%，組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.041、0.004，圖2C、D)。CD79B基因突變組與非突變組患者的2年OS分別為50%與78.3%，PFS分別為45%與71.4%，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.141、0.085)。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析，MYD88基因突變組與MYD88/CD79B基因雙突變組OS和PFS差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.30、0.075，圖2E、F)。

圖2 DLBCL患者生存分析：A.MYD88基因突變組和非突變組OS；B.MYD88基突變組和非突變組PFS；C.MYD88/CD79B基因雙突變組和非雙突變組OS；D.MYD88/CD79B基因雙突變組和非雙突變組PFS；E.MYD88基因突變組和MYD88/CD79B基因雙突變組OS；F.MYD88基突變組和MYD88/CD79B基因雙突變組PFS

3 討論

DLBCL是一組臨床和生物學(xué)上均具有異質(zhì)性的腫瘤[9-10]。雖然大部分患者獲得較好的療效，但30%～40%患者發(fā)生耐藥或復(fù)發(fā)[11]。Schmitz等[12]對(duì)574例DLBCL樣本進(jìn)行外顯子測(cè)序、基于芯片的DNA拷貝數(shù)分析和372個(gè)基因的定向擴(kuò)增重復(fù)測(cè)序，將DLBCL分為MCD、N1、BN2、EZB四個(gè)亞型。近期有學(xué)者提出LymphGen分型，即MCD亞型、BN2亞型、N1亞型、EZB亞型、A53和ST2亞型[13]。其中MCD型以MYD88和CD79B基因突變?yōu)橹饕卣?，提示MYD88、CD79B基因突變?cè)贒LBCL發(fā)生發(fā)展、治療及預(yù)后評(píng)估中可能具有重要作用。

2011年Ngo等[14]首次報(bào)道MYD88基因突變?cè)趎on-GCB型DLBCL中高達(dá)29%，而在其他亞型DLBCL中非常罕見。有研究報(bào)道MYD88基因在non-GCB型DLBCL中突變率為21.6%～31.2%，而在GCB型中突變率6.0%～9.7%[15-16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，non-GCB型DLBCL中MYD88基因突變頻率高于GCB型，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。DLBCL中MYD88基因突變與發(fā)病部位顯著相關(guān)，好發(fā)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、睪丸、皮膚、乳腺部位[17-18]。原發(fā)淋巴結(jié)內(nèi)DLBCL中MYD88基因突變率低(0～38%，中位值10%)[19]。本實(shí)驗(yàn)在排除了特殊類型的DLBCL后，研究顯示睪丸(5/5)、卵巢(2/2)、大腿(1/1)、乳腺(2/3)均顯示較高的MYD88突變率(66.7%～100%)，而淋巴結(jié)內(nèi)MYD88突變率為10%。

Rovira等[20]報(bào)道MYD88突變型DLBCL中c-MYC/BCL-2雙陽性率顯著低于未突變型。Dubois等[21]報(bào)道non-GCB型DLBCL中BCL-2陽性更多見于MYD88突變者中，non-GCB型中c-MYC/BCL-2雙陽性及c-MYC單一蛋白陽性與MYD88突變均無相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)中c-MYC/BCL-2雙陽性組的MYD88突變率(9/24，37.5%)顯著高于非雙陽性組(9/65，13.8%，P=0.030)。c-MYC/BCL-2雙陽性常見于non-GCB型且預(yù)后較差。此外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，單一BCL-2陽性也與MYD88突變顯著相關(guān)，而單一c-MYC陽性與該基因突變無相關(guān)性。

CD79B是B細(xì)胞抗原受體(B-cell receptor, BCR)組成部分，BCR刺激酪氨酸磷酸化的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活BTK(bruton agammaglobulinemia tyrosine kinase)，促進(jìn)Ca2+產(chǎn)生，激活蛋白激酶C。蛋白激酶C使CARD11磷酸化，形成CBM復(fù)合體，參與NF-κB信號(hào)通路[21-23]。CD79B在non-GCB型DLBCL中突變率為21%，而在GCB型中突變率為0.6%～3%[17]。目前，CD79B突變多發(fā)生于non-GCB型。本實(shí)驗(yàn)中non-GCB型CD79B突變率(27.5%)高于GCB型(6.5%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究報(bào)道MCD型多發(fā)生于non-GCB型，non-GCB型DLBCL患者中MYD88/CD79B雙突變率約11.5%，在GCB型中雙突變率約0.6%[24-25]。本實(shí)驗(yàn)中non-GCB型DLBCL中MYD88/CD79B基因雙突變率(6/58，10.3%)，顯著高于GCB型(0/31，0)。

本實(shí)驗(yàn)探討了MYD88、CD79B與MYD88/CD79B基因突變與DLBCL預(yù)后的關(guān)系，生存分析結(jié)果顯示MYD88、MYD88/CD79B基因未突變患者的2年OS和PFS均顯著高于突變患者(P<0.05)；但CD79B基因突變患者2年OS和PFS比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。有文獻(xiàn)報(bào)道MYD88突變可引發(fā)IL-1受體相關(guān)激酶介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)途徑激活，導(dǎo)致腫瘤形成，MYD88基因突變影響患者生存預(yù)后情況[26-27]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)論與之一致。DLBCL的分子分型中MCD型以MYD88和CD79B基因突變?yōu)橹饕卣鳎琈CD型的生存率低于非MCD型患者，提示預(yù)后不良。

綜上所述，MYD88基因突變及MYD88/CD79B基因雙突變與DLBCL患者的治療反應(yīng)相關(guān)。MYD88基因突變以及MYD88/CD79B基因雙突變DLBCL患者的OS、PFS比未突變患者低。本研究未行多因素分析，在未來的實(shí)驗(yàn)中將進(jìn)一步探討MYD88基因突變以及MYD88/CD79B基因雙突變是否為影響患者預(yù)后的獨(dú)立不良因素。