Rosai-Dorfman病12例臨床病理及分子特征

王清揚(yáng)，王曉偉，鐘定榮

Rosai-Dorfman病(Rosai-Dorfman disease, RDD)又稱(chēng)為伴巨大淋巴結(jié)病的竇性組織細(xì)胞增多癥，是一種罕見(jiàn)的、原因不明的非朗格漢斯細(xì)胞組織細(xì)胞增多癥。RDD曾被認(rèn)為是一種反應(yīng)性、非腫瘤性疾病，近年來(lái)部分支持RDD克隆性的證據(jù)已被發(fā)現(xiàn)，但由于RDD較為罕見(jiàn)，伴有基因改變的RDD常為個(gè)案報(bào)道。二代測(cè)序技術(shù)(next-generation sequencing, NGS)實(shí)現(xiàn)了全基因組高通量、低成本和快速化檢測(cè)，已在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。因此，本文回顧性分析12例RDD的臨床病理資料及隨訪材料，行免疫組化染色及分子檢測(cè)，并結(jié)合文獻(xiàn)復(fù)習(xí)以提高對(duì)該病的認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集中日友好醫(yī)院病理科2012年6月～2020年12月會(huì)診及收治的RDD共12例，對(duì)其臨床病理資料進(jìn)行分析，并通過(guò)門(mén)診復(fù)查、病案查詢(xún)及電話形式進(jìn)行隨訪。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 將手術(shù)切除及穿刺活檢標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，HE染色，鏡下觀察。免疫組化染色采用EnVision法，一抗包括S-100、CD68、CD138、CD38、CD3、CD5、CD20、Ki-67、CD1a、Cyclin D1(所用試劑盒購(gòu)自羅氏公司)，選用組織壞死性淋巴結(jié)炎2例及朗格漢斯組織細(xì)胞增生癥(Langerhans cell histiocytosis, LCH)2例作為對(duì)照。

1.2.2分子檢測(cè) 采用基于雜交捕獲的高通量測(cè)序法(Hybridization Capture-based NGS)。測(cè)序流程包括，(1)DNA提?。菏灠窠M織10 μm厚連續(xù)切片8張，放入1.5 mL離心管，二甲苯脫蠟后使用艾德生物公司FFPE DNA試劑盒按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行標(biāo)本DNA提取，溶解于30～100 μL DTE緩沖液中，取適量樣品，對(duì)DNA質(zhì)量濃度進(jìn)行測(cè)定。(2)文庫(kù)構(gòu)建：片段化處理、末端修復(fù)、接頭連接、PCR擴(kuò)增、雜交捕獲。使用Illumina Nextseq 500進(jìn)行基因檢測(cè)，采用艾德生物公司人類(lèi)癌癥多基因突變聯(lián)合檢測(cè)數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，覆蓋116個(gè)基因的外顯子、剪切區(qū)域、融合相關(guān)內(nèi)含子。判斷陽(yáng)性條件：平均有效測(cè)序深度>500×，基因突變比例≥0.4%，突變絕對(duì)拷貝數(shù)≥2，鏈平衡性0.1～10。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征12例RDD中，男性8例，女性4例，男女比為2∶1，平均年齡40歲(8～80歲)。2例淋巴結(jié)型，9例結(jié)外型(中樞神經(jīng)系統(tǒng)2例、皮膚2例、鼻部2例、氣管1例、上縱隔1例、乳腺1例)，1例混合型(累及下頜、腹部皮膚及腋下淋巴結(jié))。12例患者均接受手術(shù)治療，7例術(shù)后接受激素沖擊治療。9例患者獲得隨訪資料，中位隨訪時(shí)間37個(gè)月(7～109個(gè)月)，4例患者術(shù)后6～36個(gè)月復(fù)發(fā)，1例活檢病例緩解，3例無(wú)復(fù)發(fā)，1例不典型病例4年后死亡(表1)。

表1 12例RDD的臨床資料

2.2 病理檢查眼觀：12例中2例為穿刺活檢標(biāo)本，1例送檢灰白色破碎組織，余腫物均呈結(jié)節(jié)狀，無(wú)包膜，大小1.5 cm×0.8 cm×0.1 cm～4.0 cm×3.0 cm×2.0 cm，切面灰白或灰黃色，實(shí)性、質(zhì)中。鏡檢：低倍鏡下淋巴結(jié)型RDD淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)破壞，皮膚RDD病變位于真皮中，淋巴結(jié)外病變常伴有纖維組織增生。中高倍鏡下病變部位可見(jiàn)大量漿細(xì)胞、較多淋巴細(xì)胞及組織細(xì)胞一起呈現(xiàn)出交替的“暗區(qū)”和“亮區(qū)”(圖1)?！傲羺^(qū)”由病變組織細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，胞質(zhì)豐富、嗜酸性，部分組織細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)吞噬淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞(即“伸入現(xiàn)象”)(圖2)，其中1例可見(jiàn)吞噬紅細(xì)胞和炎細(xì)胞的現(xiàn)象；“暗區(qū)”主要為增生成片的漿細(xì)胞和淋巴細(xì)胞構(gòu)成。淋巴結(jié)內(nèi)病變吞噬現(xiàn)象比結(jié)外病變常見(jiàn)。

圖1 慢性炎細(xì)胞及組織細(xì)胞呈現(xiàn)出交替的“暗區(qū)”和“亮區(qū)” 圖2 組織細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞“伸入現(xiàn)象” 圖3 病變組織細(xì)胞CD68陽(yáng)性，EnVision法 圖4 病變組織細(xì)胞S-100強(qiáng)陽(yáng)性，EnVision法 圖5 Cyclin D1在RDD中呈特征性陽(yáng)性，EnVision法：A.Cyclin D1在RDD病組織細(xì)胞胞核及胞質(zhì)中～強(qiáng)陽(yáng)性；B.Cyclin D1在RDD組織細(xì)胞胞核中等強(qiáng)度陽(yáng)性；C.Cyclin D1在LCH表現(xiàn)為核強(qiáng)陽(yáng)性；D.壞死性淋巴結(jié)炎增生組織細(xì)胞Cyclin D1陰性，僅散在血管內(nèi)皮細(xì)胞陽(yáng)性

2.3 免疫表型病變組織細(xì)胞單核/巨噬細(xì)胞相關(guān)抗原CD68陽(yáng)性(圖3)，S-100呈強(qiáng)陽(yáng)性(胞核+胞質(zhì))(圖4)，CD1a陰性；漿細(xì)胞CD38、CD138陽(yáng)性；伸入的淋巴細(xì)胞CD3、CD5、CD20陽(yáng)性；Ki-67增殖指數(shù)5%～30%，大部分為炎細(xì)胞陽(yáng)性，病變組織細(xì)胞增殖指數(shù)均低于10%。RDD組織細(xì)胞Cyclin D1均陽(yáng)性(Cyclin D1均中～強(qiáng)核陽(yáng)性，個(gè)別病例組織細(xì)胞胞質(zhì)弱陽(yáng)性)，對(duì)照組2例LCH表現(xiàn)為Cyclin D1核強(qiáng)陽(yáng)性，2例組織壞死性淋巴結(jié)炎中增生組織細(xì)胞呈陰性，僅散在血管內(nèi)皮細(xì)胞陽(yáng)性(圖5)。

2.4 分子檢測(cè)對(duì)3例RDD的6個(gè)樣本進(jìn)行了基因檢測(cè)。使用的參考基因組版本為hg19，報(bào)告中的變異命名遵從HGVS指南中的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行命名。共發(fā)現(xiàn)7種基因突變，包括MAP2K1、NTRK1、KRAS、FGFR3、TSC1、TSC2、NF2(表2)。

表2 3例RDD 6個(gè)樣本分子檢測(cè)結(jié)果

3 討論

RDD是一種罕見(jiàn)的組織細(xì)胞性疾病，1969年Rosai和Dorfman對(duì)4例RDD進(jìn)行了詳細(xì)描述，并將其命名為“竇組織細(xì)胞增多癥伴巨大淋巴結(jié)病”[1]。根據(jù)RDD病變累及范圍可分為結(jié)內(nèi)型、結(jié)外型及混合型[2]。

RDD主要影響兒童和年輕人，平均發(fā)病年齡20.6歲，男性略多于女性[3]。大多數(shù)患者以局部淋巴結(jié)無(wú)痛性腫大為主要或唯一表現(xiàn)而就診，可伴發(fā)熱、體重下降和盜汗等癥狀，病程長(zhǎng)，病情進(jìn)展緩慢，患者一般情況好[4]。40%患者可出現(xiàn)結(jié)外組織或器官受累[5]。本組12例男女比為2∶1，男性明顯多于女性；患者平均年齡38.9歲，大于文獻(xiàn)報(bào)道。本組66.7%出現(xiàn)結(jié)外受累(8/12)，50%表現(xiàn)為單一結(jié)外受累(6/12)，50%以發(fā)現(xiàn)腫塊為主要癥狀就診，50%以相應(yīng)結(jié)外器官受累癥狀就診?？v隔是RDD較為罕見(jiàn)的發(fā)病部位，既往僅見(jiàn)個(gè)例報(bào)道[6-8]；本組1例上縱隔病例為39歲男性，伴有頸部淋巴結(jié)累及，該患者伴有反復(fù)發(fā)熱癥狀，4年內(nèi)住院治療12次，最后一次入院才明確診斷，治療效果差，明確診斷后半年去世。4例累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病例，1例合并有顱底骨質(zhì)破壞伴鼻咽部累及，活檢明確診斷后治療緩解，隨診87個(gè)月無(wú)癥狀，1例患者切除后無(wú)復(fù)發(fā)，1例患者術(shù)后7個(gè)月后復(fù)發(fā)再次手術(shù)，術(shù)后1年無(wú)異常，1例會(huì)診病例失訪。文獻(xiàn)報(bào)道皮膚型RDD更常見(jiàn)于老年婦女，平均發(fā)病年齡43.5歲[9]；本組3例皮膚型RDD中2例為男性，平均年齡54.3歲。

RDD主要的病理形態(tài)學(xué)特征是低倍鏡下“亮區(qū)”與“暗區(qū)”交替分布，高倍鏡下病變組織細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞及紅細(xì)胞“伸入現(xiàn)象”。在免疫表型上，病變組織細(xì)胞除表達(dá)單核/巨噬細(xì)胞相關(guān)抗原(CD68、CD163)外，胞核及胞質(zhì)S-100陽(yáng)性是RDD的重要診斷線索，淋巴結(jié)型RDD皮質(zhì)內(nèi)漿細(xì)胞可被漿細(xì)胞標(biāo)志物(CD38、CD138和MUM1)染色，淋巴細(xì)胞表達(dá)CD3、CD5及CD20。

在鑒別診斷上，RDD一方面需與富于漿細(xì)胞的疾病鑒別。(1)與IgG4相關(guān)性疾病鑒別：后者纖維化更明顯，且可出現(xiàn)閉塞性血管炎。(2)與漿細(xì)胞瘤鑒別：后者漿細(xì)胞呈膨脹性腫瘤性增生，漿細(xì)胞群體中淋巴細(xì)胞稀少，且不存在成片增生的組織細(xì)胞。(3)與漿細(xì)胞型Castleman病鑒別：后者淋巴濾泡反應(yīng)性增生，濾泡周出現(xiàn)漿細(xì)胞，無(wú)組織細(xì)胞聚集成片的現(xiàn)象。另一方面需與富于組織細(xì)胞的疾病鑒別。(1)與LCH鑒別：LCH病變主要位于淋巴結(jié)的副皮質(zhì)區(qū)，腫瘤細(xì)胞中等大小，細(xì)胞核可呈咖啡豆樣外觀，可見(jiàn)核溝，胞質(zhì)較RDD少，且無(wú)炎細(xì)胞“伸入現(xiàn)象”，CD1a、CD207(Langerin)和S-100陽(yáng)性提示克隆性增殖[10]，無(wú)漿細(xì)胞顯著增多現(xiàn)象。(2)與早期的組織細(xì)胞壞死性淋巴結(jié)炎鑒別：后者常壞死不明顯，增生的組織細(xì)胞中可見(jiàn)少量吞噬現(xiàn)象，但組織細(xì)胞胞質(zhì)不如RDD多，吞噬的為核碎裂成分，不是完整的淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞或紅細(xì)胞，伴隨的T淋巴細(xì)胞多，而漿細(xì)胞極少，但存在漿樣樹(shù)突細(xì)胞，CD123陽(yáng)性，而CD38、CD138陰性等。(3)與Erdheim-Chester病鑒別：后者為黃瘤樣組織細(xì)胞，胞質(zhì)中常見(jiàn)脂質(zhì)，并可見(jiàn)杜頓氏多核巨細(xì)胞，合并梭形細(xì)胞，且梭形細(xì)胞表達(dá)組織細(xì)胞抗原，可見(jiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，漿細(xì)胞極少見(jiàn)，且約60%病變出現(xiàn)BRAF V600E基因突變。(4)與黃色纖維組織細(xì)胞瘤鑒別：后者無(wú)成片增生的漿細(xì)胞，組織細(xì)胞胞質(zhì)中常見(jiàn)脂質(zhì)空泡。(5)與黏液變的神經(jīng)鞘瘤鑒別：后者無(wú)漿細(xì)胞聚集現(xiàn)象，黏液變區(qū)域與RDD的組織細(xì)胞區(qū)域在高倍鏡下明顯不一樣，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)極少。(6)與肉芽腫性疾病鑒別：后者組織細(xì)胞聚集呈團(tuán)，黏附性強(qiáng)，細(xì)胞胞質(zhì)相對(duì)RDD細(xì)胞胞質(zhì)少，且無(wú)“伸入現(xiàn)象”。除梅毒等特殊肉芽腫外，漿細(xì)胞聚集現(xiàn)象非常少見(jiàn)。

RAS-RAF-MEK-ERK細(xì)胞信號(hào)通路在實(shí)體腫瘤和血液系統(tǒng)惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用。該通路能影響幾種不同的細(xì)胞功能，包括增殖、凋亡、血管生成、遷移和存活[11]。既往在對(duì)LCH發(fā)病機(jī)制的分子研究中發(fā)現(xiàn)了與MAPK/ERK途徑相關(guān)的互斥復(fù)發(fā)性體細(xì)胞突變，包括BRAF V600E和MAP2K1[12]，在Erdheim-Chester病中也有報(bào)道[13]。RDD的病因尚不明確，長(zhǎng)期以來(lái)被認(rèn)為是非克隆疾病，但近年來(lái)部分支持RDD克隆性的證據(jù)已被發(fā)現(xiàn)。Garces等[14]的研究顯示：高達(dá)33%的RDD病例顯示KRAS或MAP2K1突變，這表明部分病例可能是克隆性的。Durham等[15]對(duì)17例RDD進(jìn)行靶向DNA/RNA測(cè)序和全外顯子測(cè)序并發(fā)現(xiàn)了KRAS、MAP2K1、NRAS及CSF1R突變。本文對(duì)3例RDD進(jìn)行NGS檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了MAP2K1、NTRK1、KRAS、FGFR3、TSC1、TSC2、NF2突變。例1為56歲男性，皮膚RDD，MAP2K1基因3號(hào)外顯子錯(cuò)義突變，c.371C>A(p.P124Q)以及NTRK1基因9號(hào)外顯子突變，c.1024G>T(p.A342S)。MAP2K1基因的c.371C>A(p.P124Q)導(dǎo)致基因編碼蛋白第124位氨基酸由脯氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝滨０?，在一?xiàng)臨床研究中[16]，1例攜帶MAP2K1 P124Q突變的Erdheim-Chester病患者使用cobimetinib治療后療效為完全緩解。NTRK1基因的c.1024G>T p.A342S導(dǎo)致基因編碼蛋白第342位氨基酸由丙氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榻z氨酸，其與腫瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性暫不明確。例2為19歲男性，中樞神經(jīng)系統(tǒng)RDD，KRAS基因4號(hào)外顯子錯(cuò)義突變，c.351A>C(p.K117N)。KRAS基因是人體內(nèi)最為常見(jiàn)的原癌基因，其負(fù)責(zé)編碼的RAS蛋白在細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路中起著信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，KRAS突變?cè)诙喾N腫瘤中均有發(fā)生，在肺癌中占15%～25%[17]，在結(jié)直腸癌中高達(dá)40%[18]，在胰腺癌中甚至高達(dá)70%[19]。KRAS p.K117N屬于明確的致病性突變，該突變的發(fā)生可導(dǎo)致KRAS蛋白及其下游MAPK信號(hào)通路持續(xù)激活，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。例3為66歲女性，皮膚及腋下淋巴結(jié)RDD，發(fā)現(xiàn)多個(gè)基因突變：FGFR3基因13號(hào)外顯子錯(cuò)義突變，c.1949A>C(p.K650T)；TSC1基因15號(hào)外顯子錯(cuò)義突變，c.1460C>G(p.S487C)；TSC2基因34號(hào)外顯子錯(cuò)義突變，c.4270G>C(p.D1424H)；NF2基因13號(hào)外顯子錯(cuò)義突變，c.1439C>T(p.T480M)。FGFR3隸屬FGFR酪氨酸激酶家族，參與細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)、遷移與分化。FGFR3突變?cè)诙喾N腫瘤中均有報(bào)道，包括乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、胰腺癌、腎細(xì)胞癌、膀胱癌等。多篇文獻(xiàn)報(bào)道顯示[20-22]，胚系FGFR3 K650T突變與家族性軟骨發(fā)育低下和黑棘皮癥相關(guān)，OncoKB數(shù)據(jù)庫(kù)記錄該突變?yōu)橐伤浦虏⌒酝蛔儭１纠龑儆谑状卧赗DD中發(fā)現(xiàn)FGFR3 K650T突變。TSC1、TSC2、NF2突變?cè)诩韧鵕DD中未見(jiàn)報(bào)道，它們對(duì)臨床用藥意義尚不明確。

Cyclin D1是MAPK通路的下游標(biāo)記之一。92.3%～100%的LCH病例發(fā)現(xiàn)了Cyclin D1陽(yáng)性，與MAPK普遍激活保持一致[23-24]。多篇文獻(xiàn)報(bào)道[25-27]Cyclin D1在幾乎所有RDD中均陽(yáng)性，且顯著高于反應(yīng)性組織細(xì)胞增生和IgG4相關(guān)性疾病。本組9例RDD行Cyclin D1免疫組化染色，8例出現(xiàn)病變組織細(xì)胞核中～強(qiáng)陽(yáng)性，部分病例組織細(xì)胞胞質(zhì)亦陽(yáng)性。Cyclin D1在RDD中特征性陽(yáng)性，加強(qiáng)了RDD是腫瘤性病變的證據(jù)，不僅提示MAPK通路激活可能參與RDD的發(fā)病機(jī)制，也能作為診斷RDD的一個(gè)重要輔助標(biāo)記。

RDD通常具有自限性且預(yù)后良好，但局部切除后容易復(fù)發(fā)[28]。本組有隨診資料的9例患者中4例復(fù)發(fā)。文獻(xiàn)報(bào)道部分患者可能死于并發(fā)癥或感染[3]，特殊部位反復(fù)復(fù)發(fā)也容易致命。對(duì)于沒(méi)有并發(fā)癥和無(wú)癥狀的皮膚RDD可觀察隨訪，手術(shù)治療是單灶結(jié)外RDD和有癥狀RDD的首選治療方式，手術(shù)不能完全切除的多灶RDD需輔以系統(tǒng)治療[4-5]。RDD克隆性證據(jù)的發(fā)現(xiàn)為使用靶向藥物治療提供了理論依據(jù)，目前共識(shí)建議伴MAPK通路相關(guān)基因突變的嚴(yán)重或難治性RDD可考慮行靶向治療[4]。

總之，RDD是一種有具有獨(dú)特病理形態(tài)學(xué)特征，通常具有自限性且預(yù)后良好的組織細(xì)胞疾病。組織細(xì)胞標(biāo)記(CD68、CD163)與S-100在組織細(xì)胞中聯(lián)合表達(dá)，Cyclin D1陽(yáng)性也可作為RDD輔助診斷的有用標(biāo)記，伴發(fā)的漿細(xì)胞增多雖然目前意義不明，但具有重要的鑒別診斷意義。目前RDD尚未被歸類(lèi)為腫瘤性疾病，但一些支持克隆性證據(jù)改變了我們對(duì)這類(lèi)疾病的理解。激素治療往往有效，難治性病例和特殊部位病例也存在致命性可能。