• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    海南天然飼草青貯飼料中乳酸菌分離鑒定及優(yōu)良菌株篩選

    2022-11-04 08:12:06字學(xué)娟
    草地學(xué)報(bào) 2022年10期
    關(guān)鍵詞:產(chǎn)酸青貯飼料乳酸菌

    劉 悅, 字學(xué)娟*, 陳 婷, 孫 蓉, 李 茂, 湯 凱

    (1. 海南大學(xué)林學(xué)院, 海南 儋州 571737; 2. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所, 海南 儋州 571737; 3. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院湛江試驗(yàn)站, 海南 湛江 524000; 4.海南大學(xué)食品學(xué)院, 海南 ???570228)

    微生物活動(dòng)是青貯發(fā)酵的本質(zhì),原料表面附著微生物多樣性、菌種的生理生化特性以及外界環(huán)境等因素均能影響青貯發(fā)酵品質(zhì)[1]。因此,調(diào)控微生物群落結(jié)構(gòu)是保證青貯發(fā)酵品質(zhì)的重要舉措之一。一般來說,乳酸菌作為優(yōu)勢(shì)菌群的青貯發(fā)酵容易成功,通過產(chǎn)生乳酸和一些抗真菌代謝產(chǎn)物,可起到改善青貯飼料品質(zhì)的作用[2]。

    當(dāng)前,研究人員發(fā)現(xiàn)通過篩選并添加不同種類的乳酸菌來可提高青貯成功率[3],韋慶旭等[4](陜西)從構(gòu)樹青貯飼料、玉米青貯飼料中分離出植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)、副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)4種可飼用菌種;張玉琳等[5](新疆)從雜交構(gòu)樹(Broussonetiapapyrifera)青貯飼料中最終分離得到植物乳桿菌、短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)、糞腸球菌和戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus),此外,李榮榮等[6](北京)從紫花苜蓿自然青貯飼料中篩選得到的植物乳桿菌,能夠有效促進(jìn)乳酸發(fā)酵、抑制梭菌生長(zhǎng)、顯著改善高水分苜蓿青貯品質(zhì)。Peng等[7](貴州)收獲包括紫羅蘭、高粱、玉米等12種青貯原料進(jìn)行青貯,篩選得到的優(yōu)勢(shì)菌株布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)添加到青貯飼料中有效地改善了溫暖潮濕氣候區(qū)紫花苜蓿青貯飼料的發(fā)酵質(zhì)量;Wang等[8]從青藏高原普通野豌豆、高羊茅和多年生黑麥草中分離得到的植物乳桿菌和商業(yè)植物乳桿菌MTD—1對(duì)比,發(fā)現(xiàn)在10℃和15℃的低溫環(huán)境下,3種菌均可不同程度的改善意大利黑麥草青貯發(fā)酵品質(zhì)。此外,Liu等[9]研究發(fā)現(xiàn)與商用植物乳桿菌菌株相比,篩選得到的菌株戊糖片球菌在20℃下對(duì)改善柱花草青貯品質(zhì)最為有效。因此,不同區(qū)域不同飼草附著乳酸菌種類和特性差異較大,從不同來源分離鑒定和篩選本土優(yōu)良乳酸菌菌株具有重要意義。

    在全球變暖的背景下,日均最高氣溫≥40℃的天數(shù)也在增加。高溫是熱帶地區(qū)影響青貯品質(zhì)的重要環(huán)境因素,高溫會(huì)增加青貯飼料pH值和干物質(zhì)損失,降低其乳酸含量和有氧穩(wěn)定性,極大的影響飼用價(jià)值[10]。乳酸菌特性在熱帶和溫帶有明顯差異[10],商品化乳酸菌制劑不能很好地適應(yīng)熱帶的氣候,發(fā)揮預(yù)期效果[11]。海南島為熱帶季風(fēng)氣候,夏季長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月(月平均溫度≥30℃)且無冬季,而天然飼草青貯飼料中乳酸菌的分離及鑒定鮮有報(bào)道,因此,本研究以分布廣泛、可用作飼草為標(biāo)準(zhǔn)選取海南島的野生草本植物斑茅(Saccharumarundinaceum)、蔓生莠竹(Microstegiumvagans)和木本植物銀合歡(Leucaenaleucocephala)、構(gòu)樹(Broussonetiapapyrifera)為材料,并在5個(gè)氣候區(qū)東部濕熱區(qū)、西部干旱區(qū)、南部暖潮濕區(qū)、北部半濕熱區(qū)、中部山地潮濕區(qū)采樣對(duì)比,篩選高溫條件下適合熱帶牧草的優(yōu)良乳酸菌菌株,旨在豐富對(duì)我國(guó)熱帶地區(qū)乳酸菌菌群多樣性認(rèn)知和促進(jìn)熱帶飼草青貯添加劑的研發(fā)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料、試劑及儀器

    供青貯的原料為從海口(110°11′E,19°54′N,年均溫24.1℃,年均降水量1 788 mm,海拔160 m)、瓊中(109°34′E,19°1′N,年均溫22.4℃,年均降水量2 350 mm,海拔560 m)、萬寧(110°25′E,18°54′N,年均溫23.9℃,年均降水量2 420 mm,海拔30 m)、三亞(109°34′ E,18°19′ N,年均溫26.9℃,年均降水量1 716 mm,海拔40 m)、昌江(108°58′ E,19°19′ N,年均溫24.6℃,年均降水量1 680 mm,海拔90 m)、儋州(109°30′ E,19°30′ N,年均溫23.8℃,年均降水量1 870 mm,海拔160 m)野外采集的草本植物斑茅、蔓生莠竹和木本植物銀合歡、構(gòu)樹。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、沙門氏菌(Salmonella)、大腸埃希氏菌(Es-cherichiacoli)、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)來自海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室。

    De Man,Rogosa,Sharpe(MRS)瓊脂培養(yǎng)基、De Man,Rogosa,Sharpe(MRS)肉湯培養(yǎng)基:購自杭州百思生物技術(shù)有限責(zé)任公司;細(xì)菌微量生化反應(yīng)管:購自杭州微生物試劑有限公司。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1青貯制備 將采集得到的飼草切碎至2~3 cm,自然晾曬24 h后裝入聚乙烯青貯袋中,每袋200 g,每個(gè)處理重復(fù)3次。用抽真空包裝機(jī)抽真空后密封,于室內(nèi)35℃~40℃環(huán)境下儲(chǔ)存發(fā)酵60 d。

    1.2.2菌體分離及菌種純化 將青貯樣品按草:水=1:10比例浸泡在錐形瓶中,然后進(jìn)行梯度稀釋,選取3個(gè)適宜梯度,各吸100 μL涂布于MRS固體培養(yǎng)基(含1.5% CaCO3)上,于37℃恒溫培養(yǎng)箱下厭氧培養(yǎng)48 h后,觀察菌落形態(tài)[12]等,挑取溶鈣圈明顯且較大的單菌落,于MRS固體培養(yǎng)基劃線3~4次,保存于—80℃超低溫冰箱,同時(shí)進(jìn)行革蘭氏染色、過氧化氫酶檢驗(yàn)。

    1.2.3優(yōu)勢(shì)菌MRS液體培養(yǎng)基初篩 將純化后的乳酸菌菌液濃度調(diào)至108cfu·mL-1搖勻接100 uL至裝有MRS液體培養(yǎng)基的離心管,放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8,16,36 h后測(cè)定發(fā)酵液的pH值。測(cè)600 nm處OD(Optical density,吸光度)值,選取pH≤4且OD≥2[13]的菌株為初篩代表菌株。

    1.2.4高溫條件下MRS液體培養(yǎng)基優(yōu)勢(shì)菌復(fù)篩及耐酸能力測(cè)定 按初篩同樣的方法接100 ul至裝有MRS液體培養(yǎng)基的離心管,分別置于40,45,50℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h,測(cè)發(fā)酵液600 nm處OD值。同上述方法再將乳酸菌接入pH為3.0,3.5,4.0,6.0,8.0,9.0的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天后,測(cè)發(fā)酵液600 nm處OD值。

    1.2.5測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 篩選所得優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行16S rDNA測(cè)序(華大基因),在NCBI數(shù)據(jù)庫搜索并選擇序列同源性較高菌株16S rRNA基因序列,采用MEGA7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,建樹方法為鄰接法(Neighbor-joining,NJ)[14]。

    1.2.6生理生化試驗(yàn) 采用細(xì)菌微量生化反應(yīng)管,嚴(yán)格按照說明書操作,接菌方法為從MRS平板挑取單菌落到生化管,封口,放置于恒溫培養(yǎng)箱[15]。

    1.2.7乳酸菌的生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸曲線的測(cè)定 將復(fù)篩后選出的優(yōu)良乳酸菌稀釋定菌數(shù)(按上述方法)并接種置于37℃恒溫培養(yǎng),在0—24 h每隔2 h取出1批樣品于600 nm處分別測(cè)定MRS培養(yǎng)基的OD值,同時(shí)用pH測(cè)定儀測(cè)定MRS培養(yǎng)基的pH值[16],分別用來表征乳酸菌的生長(zhǎng)速率和產(chǎn)酸速率。

    1.2.8抑菌能力的測(cè)定 將指示菌株的活化劃線于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,37℃恒溫培養(yǎng)48 h。挑取單菌落接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,37℃,180 r·min-1條件下培養(yǎng)24 h。調(diào)整菌體濃度為1×107cfu·mL-1作為指示菌懸液;以1%(V∶V)的接種量將乳酸菌種子液接種于MRS液體培養(yǎng)基中,37℃條件下靜置培養(yǎng)12 h,10 000 r·min-1離心2 min后取上清液,4℃保存作為上清液備用;利用牛津杯法測(cè)定抑菌性能,首先傾注15 mL將2%營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(滅菌)于培養(yǎng)皿,待水平靜置凝固后,打入100 μL指示菌菌液,涂布均勻后備用,均勻放置牛津杯垂直于培養(yǎng)基表面,在其中加入乳酸菌上清液100 μL,4℃擴(kuò)散2 h后再37℃培養(yǎng)24 h。根據(jù)抑菌圈直徑大小來判斷結(jié)果[17]。

    1.2.9數(shù)據(jù)分析 基礎(chǔ)數(shù)據(jù)用Excel 2019處理,用Oringin 2018軟件作圖,用MEGA 7繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 乳酸菌的分離純化

    從青貯樣品中分離得到127株乳酸菌,98株菌株革蘭氏染色均為陽性,過氧化氫觸酶試驗(yàn)均為陰性,初步鑒定為乳酸菌。

    2.2 乳酸菌的產(chǎn)酸能力和生長(zhǎng)能力初篩

    就產(chǎn)酸能力而言,發(fā)酵36 h后,98株菌株中,pH≤4的有39株,占比為39.8%,其中,產(chǎn)酸能力最強(qiáng)的1株菌pH為3.91,以上菌株在8 h和16 h時(shí)也表現(xiàn)較好,8 h時(shí)39株中有一半以上pH≤5,而16 h時(shí)pH又進(jìn)一步下降,39株中有95%左右pH≤4.5;此外,發(fā)酵36 h時(shí),4

    在生長(zhǎng)能力方面,30.77%的菌株8 h時(shí)OD≥2,所有菌株均OD≥0.5;發(fā)酵36 h時(shí),pH≤4的菌株同時(shí)滿足OD≥2。以36 h的pH≤4且OD≥2為條件,篩選得到39株優(yōu)勢(shì)菌,同時(shí)以8 h和16 h的結(jié)果為參考,發(fā)現(xiàn)所選菌株均滿足生命力強(qiáng)且產(chǎn)酸能力強(qiáng)的要求。

    2.3 乳酸菌的耐高溫能力和耐酸能力復(fù)篩

    對(duì)初篩優(yōu)勢(shì)菌39株進(jìn)行耐高溫能力和耐酸能力復(fù)篩,以T=50℃條件下的生長(zhǎng)情況為依據(jù),以T=40℃和T=45℃時(shí)的OD值為參考,選出OD值最大的15株為復(fù)篩優(yōu)勢(shì)菌,去掉測(cè)序結(jié)果中重復(fù)的菌種,最終得到4株優(yōu)勢(shì)菌,并對(duì)其進(jìn)行耐酸能力的實(shí)驗(yàn)。隨著溫度的上升,所有菌株的OD值都呈現(xiàn)下降的趨勢(shì),在T=50℃時(shí),菌株10D,13C,15B的OD值為1.72,菌株14B的OD值為1.77;以pH=6為界,pH值越小則越抑制乳酸菌的生長(zhǎng),這種抑制作用在pH=3時(shí)最為明顯,僅14B的OD≥0.5,10D,13C,15B的OD分別為0.39,0.38,0.4。(表1)。

    2.4 優(yōu)良乳酸菌的生理生化、16S rDNA序列分析、系統(tǒng)發(fā)育樹、生長(zhǎng)速率及產(chǎn)酸速率和抑菌效果

    從表2中可以看出,所選菌株能利用廣泛的糖源,但利用種類和能力有差別。所有的菌株七葉苷和苦杏仁苷生化管反應(yīng)都呈陽性,七葉苷水解試驗(yàn)陽性說明該乳酸菌可將七葉苷分解成葡萄糖和七葉素;苦杏仁苷陽性則說明該該乳酸菌含β-葡萄糖苷酶可催化苦杏仁苷水解為兩分子葡萄糖和1分子杏仁腈;另外,所有的菌株都能利用纖維二糖、葡萄糖、乳糖、果糖、半乳糖、麥芽糖、蕈糖、蔗糖、鼠李糖、木糖、蜜二糖、L-阿拉伯糖,但利用能力不一,其中,15B對(duì)乳糖的利用能力較弱;14B對(duì)蜜二糖的利用能力較弱;13C,14B,15B對(duì)甘露醇的利用能力較弱;14B,15B則對(duì)L-阿拉伯糖的利用能力較弱;10D,15B對(duì)木糖和屬李糖的利用能力較弱;10D,13C,14B對(duì)半乳糖的利用能力較弱;然而,所有的菌株都不能利用山梨醇、淀粉且硝酸鹽反應(yīng)呈陰性,說明所選菌株不含硝酸還原酶和淀粉水解酶;10D不能利用棉子糖、甘露醇。

    表1 4株優(yōu)勢(shì)菌株耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Tolerance of four representative strains to acid and high temperature

    表2 4株優(yōu)勢(shì)菌株生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical characteristics of four representative strains

    將代表菌株進(jìn)行16S rDNA測(cè)序后,將序列結(jié)果提交至NCBI數(shù)據(jù)庫對(duì)相似性進(jìn)行比對(duì),結(jié)果見表3。菌株10D和植物乳桿菌(Lactiplantibacillusplantarumstrain Heal19)同源性最高,菌株13C和植物乳桿菌(LactobacillusplantarumSN13T)同源性最高,菌株14B和植物乳桿(Lactiplantibacillusplantarumstrain 202195) 同源性最高,菌株15B和乳酸片球菌(Pediococcusacidilacticistrain CACC 537)同源性最高,所有菌種的同源性和標(biāo)準(zhǔn)菌株序列覆蓋率均達(dá)到100%,E值都為0。E值代表在隨機(jī)狀態(tài)時(shí),目標(biāo)序列與其他序列的相似度大于本條序列的可能性。表中所列E值均為0,說明比對(duì)結(jié)果可靠。

    表3 4株優(yōu)勢(shì)菌株的16S rDNA序列同源性比對(duì)結(jié)果Table 3 Homologous alignment analysis of 16S rDNA sequences from four typical isolates

    表4可知,4株代表菌株抑菌效果均較明顯,表現(xiàn)在其對(duì)所有致病菌抑菌圈的直徑均大于10 mm。其中10D和13C對(duì)大腸桿菌的抑制作用更強(qiáng);13C對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果更好;10D對(duì)沙門氏菌的抑制作用較好;菌株10D,14B和15B對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的抑菌圈直徑大小較為接近且數(shù)值較高,說明對(duì)該致病菌有更強(qiáng)的抑制能力。

    表4 4株優(yōu)勢(shì)菌株的抑菌能力Table 4 Antibacterial activity of four representative strains

    圖1所示,4株優(yōu)勢(shì)菌株呈現(xiàn)出相似的生長(zhǎng)情況,0~2 h菌株生長(zhǎng)緩慢,處于遲滯期;2 h后迅速生長(zhǎng)繁殖,進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期;到10 h后,生長(zhǎng)速率減緩;22 h后趨于穩(wěn)定,基本不再生長(zhǎng),曲線趨向“S”型。在對(duì)數(shù)期,相比其他菌種,菌株13C長(zhǎng)勢(shì)較快,菌株15B在2~4 h相對(duì)平緩;在穩(wěn)定期,菌株13C生長(zhǎng)情況最好,其余菌株長(zhǎng)勢(shì)相似。

    圖1 在MRS肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)的4株乳酸菌于600 nm 處的光密度值Fig.1 The optical density values at 600 nm of four LAB strains in MRS broth with the process of incubation

    圖2所示,菌株10D培養(yǎng)2~12 h產(chǎn)酸速率較快,12~24 h產(chǎn)酸效率減?。痪?3C和14B在2~6 h時(shí)pH迅速下降,在6~24 h時(shí)pH有所下降但幅度變小;菌株15B在2~8 h時(shí)產(chǎn)酸速率較快,8~22 h產(chǎn)酸效率減小,22 h時(shí)趨于穩(wěn)定期,pH值基本保持不變。在產(chǎn)酸速率上,菌株13C較其他菌株更快;在產(chǎn)酸能力上,菌株10D最強(qiáng)。

    圖2 4株乳酸菌于MRS肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)的 pH值變化Fig.2 The pH values of four LAB strains in MRS broth with the process of incubation

    由圖3可知,菌株10D,13C,14B與植物乳桿菌(GenBank登錄號(hào):MT229370.1)和植物乳桿菌HBUAS52250(GenBank登錄號(hào)MH472975.1)聚于一枝,親緣關(guān)系最近,故將這3株菌株鑒定為植物乳桿菌。由圖4可知,菌株15B與乳酸片球菌(GenBank登錄號(hào)MW425291.1)聚于一枝,親緣關(guān)系最近,因此,將其鑒定為乳酸片球菌(Pediococcusacidilactic)。

    圖3 利用16S rDNA序列對(duì)植物乳桿菌進(jìn)行構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree for Lactobacillus plantarum based on their 16S rDNA sequences

    圖4 利用16S rDNA序列對(duì)乳酸片球菌進(jìn)行構(gòu)建 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree for Pediococcus acidilactici based on its16S rDNA sequence

    3 討論

    青貯發(fā)酵的微觀層面是由飼草表面附著微生物的活動(dòng)所主導(dǎo)的[18],其中,乳桿菌屬(Lactobacillus)和乳球菌屬(Lactococcus)等在青貯飼料發(fā)酵中起關(guān)鍵作用[19]。乳酸菌的迅速繁殖會(huì)使得發(fā)酵體系中的pH值迅速下降,抑制大部分好氧細(xì)菌、大腸桿菌和霉菌等不利于青貯發(fā)酵的微生物繁殖[20],使得發(fā)酵品質(zhì)更佳。因此,從青貯飼料中篩選優(yōu)良乳酸菌對(duì)改善青貯發(fā)酵品質(zhì)具有重要意義。

    本研究以不同氣候區(qū)以及草本、木本飼草為微生物富集材料,為分離純化更豐富的菌株提供了基礎(chǔ)。有學(xué)者總結(jié),在青貯中若要作為添加劑使用,乳酸菌需具備兩個(gè)條件1)耐酸能力強(qiáng),活性高,生長(zhǎng)迅速;同時(shí)大量產(chǎn)酸,迅速使得pH≤4,其它微生物的生長(zhǎng)因此而受到抑制;2)除了乳糖外,可以利用蔗糖、果糖、葡萄糖等,最好可以發(fā)酵戊糖[21]。從初篩結(jié)果和生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看,大部分乳酸菌在MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h,培養(yǎng)液的pH≥4,這表明這些菌株的產(chǎn)酸能力較低,自然青貯難以取得良好效果,而優(yōu)勢(shì)菌10D,13C,14B和15B 在2 h即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,在36 h時(shí)pH降至4.0以下,且均可發(fā)酵多種糖源,因此,所選優(yōu)勢(shì)菌株都有潛力作為乳酸菌添加劑來改善青貯發(fā)酵品質(zhì)。篩選到的優(yōu)勢(shì)菌10D,13C,14B和15B比付浩等[22]從玉米青貯飼料中篩選得到的短乳桿菌和戊糖片球菌(12~20 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)生長(zhǎng)更快,但其優(yōu)勢(shì)菌株36 h左右pH達(dá)到3.6,最終的產(chǎn)酸能力較本實(shí)驗(yàn)所篩的優(yōu)勢(shì)菌稍強(qiáng)。

    此外,青貯微生物受溫度影響比較大,熱帶的高溫環(huán)境會(huì)影響細(xì)菌細(xì)胞酶的活性,從而影響其生長(zhǎng)代謝。而生活在這種環(huán)境中的菌株,會(huì)改變生理生化特性以達(dá)到適應(yīng)環(huán)境的目的,形成特定的氣候生態(tài)型。本研究旨在分離純化出適應(yīng)熱帶氣候的優(yōu)勢(shì)乳酸菌,使本土優(yōu)良菌種種質(zhì)資源得以合理利用。因此在復(fù)篩時(shí)采用T=50℃下的生長(zhǎng)情況較好(OD值高)為篩選原則,得到了4株耐高溫同時(shí)耐酸能力良好的優(yōu)勢(shì)菌株,此前,研究人員從貴州省[7]青貯飼料中篩選得到的布氏乳桿菌(L.buchneri)和西南高溫高濕地區(qū)[10]青貯飼料中篩選得到的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)在pH=3.5和T=45℃的條件下均可生長(zhǎng),對(duì)高溫和酸性環(huán)境具有良好的適應(yīng)性。從蘭州市[23]玉米秸稈和白菜尾菜混貯料中分離純化得到的12株乳酸菌可以在pH=4.5和T=45℃條件下生長(zhǎng)。而本實(shí)驗(yàn)分離純化得到的乳酸菌對(duì)高溫脅迫的耐受性更強(qiáng),能在50℃的環(huán)境下生長(zhǎng)繁殖。

    對(duì)微生物的16S rDNA序列進(jìn)行分析可以達(dá)到初步分類鑒定的目的,基于其構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹可以確定菌種在進(jìn)化中的位置。一般認(rèn)為,在種分類水平上,2個(gè)分類單位間16S rDNA序列同源性高于97.5%則屬于同一個(gè)種。經(jīng)16S rDNA測(cè)序,結(jié)合糖發(fā)酵結(jié)果,10D,13C,14B為植物乳桿菌,15B為乳酸片球菌(Pediococcusacidilactic)。其中,植物乳桿菌被發(fā)現(xiàn)可以從多種飼草中篩選得到,新鮮仙人掌植物和青貯飼料中最常見的乳酸菌是植物乳桿菌(65%)[24];Li等[25]從玉米秸稈青貯飼料中分離出的植物乳桿菌ZZU 203和204具有抗菌活性,可用作青貯添加劑,以抑制青貯過程中不良微生物的增殖并保存青貯飼料的營(yíng)養(yǎng);袁潔等[26]從自然青貯多花黑麥草中篩選出的優(yōu)質(zhì)菌株中80%為植物乳桿菌。乳酸菌可以通過產(chǎn)生大量的有機(jī)酸、過氧化氫等物質(zhì)來抑制致病菌的生長(zhǎng),是否具有抑菌作用和抑菌作用的強(qiáng)弱是評(píng)價(jià)乳酸菌的重要內(nèi)容。結(jié)果顯示4株菌株對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的抑菌圈直徑均大于10 mm,具有很強(qiáng)的抑制作用,說明從青貯飼料分離的這4株乳酸菌對(duì)常見病原菌具有抑制作用。

    4 結(jié)論

    本研究從海南島不同地區(qū)不同植物樣本中共分離到98株乳酸菌,經(jīng)過初篩和復(fù)篩,得到4株優(yōu)勢(shì)菌株并進(jìn)行16S rDNA測(cè)序。經(jīng)鑒定,10D,13C,14B為植物乳桿菌,15B為乳酸片球菌(Pediococcusacidilactic),4株代表菌株中,菌株13C長(zhǎng)勢(shì)較好且產(chǎn)酸速率較快,菌株10D產(chǎn)酸能力較強(qiáng)。耐受性試驗(yàn)中,菌株14B在pH=3.0環(huán)境下生長(zhǎng)較好,耐酸能力較好;所有菌株在50℃環(huán)境下生長(zhǎng)良好,耐高溫能力強(qiáng),在抑菌試驗(yàn)中,所選優(yōu)勢(shì)菌株均可有效抑制致病菌的生長(zhǎng),其中,菌株10D可以有效的抑制大腸桿菌、沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌,菌株13C則對(duì)金黃色葡萄球菌有明顯的抑菌作用。

    猜你喜歡
    產(chǎn)酸青貯飼料乳酸菌
    兩種不同青貯劑對(duì)青貯飼料品質(zhì)的影響
    禽用乳酸菌SR1的分離鑒定
    青貯飼料在肉牛養(yǎng)殖中的使用
    湖南飼料(2019年5期)2019-10-15 08:59:12
    薄荷復(fù)方煎液對(duì)齲病及牙周病常見致病菌生理活性的抑制作用
    產(chǎn)酸沼渣再利用稻秸兩級(jí)聯(lián)合產(chǎn)酸工藝研究
    青貯飼料在豬日糧中的的應(yīng)用研究
    芍藥總多糖抑齲作用的體外研究
    乳酸菌成乳品市場(chǎng)新寵 年增速近40%
    乳飲品中耐胃酸乳酸菌的分離鑒定與篩選
    如何制作青貯飼料
    亚洲欧美日韩无卡精品| 天堂网av新在线| 亚洲精品久久国产高清桃花| 久久久精品94久久精品| 日韩欧美国产在线观看| 精品久久久久久久久av| 久久99精品国语久久久| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 精品日产1卡2卡| 久久韩国三级中文字幕| 亚洲av男天堂| 亚洲精品日韩av片在线观看| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 老女人水多毛片| 欧美另类亚洲清纯唯美| 日韩一区二区三区影片| 国产成人影院久久av| a级毛片a级免费在线| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 两个人的视频大全免费| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 成人性生交大片免费视频hd| 天天躁日日操中文字幕| 超碰av人人做人人爽久久| 精品久久国产蜜桃| 国产私拍福利视频在线观看| 欧美日本亚洲视频在线播放| av天堂中文字幕网| 尾随美女入室| 久久久精品大字幕| 在线播放国产精品三级| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 女人被狂操c到高潮| 久久久色成人| 亚洲国产精品成人综合色| 偷拍熟女少妇极品色| 国产男人的电影天堂91| 亚洲成人中文字幕在线播放| 22中文网久久字幕| 国产精品久久久久久久电影| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 99热这里只有是精品50| 老司机福利观看| 成人鲁丝片一二三区免费| 日韩一区二区三区影片| 亚洲成人久久爱视频| 久久久国产成人免费| 亚洲精品国产av成人精品| 狠狠狠狠99中文字幕| 一边亲一边摸免费视频| 色吧在线观看| 热99在线观看视频| 精品久久久久久久久亚洲| 亚洲av中文av极速乱| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 少妇的逼水好多| 看黄色毛片网站| 欧美潮喷喷水| 国产伦精品一区二区三区四那| 国产高清三级在线| 精品久久久久久久久久久久久| 亚洲人成网站在线播| 国产精品伦人一区二区| 麻豆乱淫一区二区| 91精品国产九色| 国产亚洲精品久久久com| 国模一区二区三区四区视频| 一本久久精品| 一区二区三区四区激情视频 | 久久午夜亚洲精品久久| 男女视频在线观看网站免费| а√天堂www在线а√下载| 中文字幕熟女人妻在线| 一级毛片电影观看 | 免费av不卡在线播放| 99久久精品一区二区三区| 欧美一级a爱片免费观看看| 色视频www国产| 狠狠狠狠99中文字幕| av在线天堂中文字幕| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 我的女老师完整版在线观看| 男人舔女人下体高潮全视频| 日本与韩国留学比较| 悠悠久久av| 国产午夜福利久久久久久| 亚洲经典国产精华液单| 国产精品人妻久久久久久| 国产精品蜜桃在线观看 | 青春草国产在线视频 | 久久人人爽人人片av| a级毛片a级免费在线| 精品午夜福利在线看| www.色视频.com| 成人国产麻豆网| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 我的老师免费观看完整版| 亚洲中文字幕日韩| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| h日本视频在线播放| 久久久久久久久久久免费av| 国产成人a区在线观看| 亚洲国产精品久久男人天堂| 特大巨黑吊av在线直播| 中出人妻视频一区二区| 成人鲁丝片一二三区免费| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 亚洲人与动物交配视频| 在线观看午夜福利视频| 嫩草影院入口| 日韩av在线大香蕉| 能在线免费看毛片的网站| 欧美色视频一区免费| 能在线免费观看的黄片| 麻豆成人午夜福利视频| 国产成人aa在线观看| 日韩亚洲欧美综合| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲五月天丁香| 嫩草影院入口| 六月丁香七月| 亚洲七黄色美女视频| 国产精品久久久久久av不卡| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 一夜夜www| 国产精品女同一区二区软件| 青青草视频在线视频观看| 天美传媒精品一区二区| 嫩草影院精品99| 久久久精品94久久精品| 国产一区二区激情短视频| 国产一区二区在线av高清观看| 亚洲av成人av| 久久久久久大精品| 校园人妻丝袜中文字幕| 两个人视频免费观看高清| 日韩av在线大香蕉| а√天堂www在线а√下载| 国产精品久久久久久av不卡| 久久6这里有精品| 久久午夜福利片| 亚洲精品久久国产高清桃花| 偷拍熟女少妇极品色| 国产精品久久久久久av不卡| 高清毛片免费观看视频网站| 亚洲欧美清纯卡通| 精品欧美国产一区二区三| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产片特级美女逼逼视频| 午夜激情福利司机影院| 99热全是精品| 免费在线观看成人毛片| 色视频www国产| 特大巨黑吊av在线直播| 久久人妻av系列| 国产91av在线免费观看| 国产精品伦人一区二区| 国产真实乱freesex| 乱系列少妇在线播放| 亚洲精品456在线播放app| 亚洲国产精品久久男人天堂| 精品久久久久久久久久免费视频| 一级毛片aaaaaa免费看小| 亚洲在久久综合| 日本成人三级电影网站| 99视频精品全部免费 在线| 国产成人精品久久久久久| 永久网站在线| 国产一区二区在线观看日韩| 日韩中字成人| 久久这里只有精品中国| 麻豆国产97在线/欧美| 18禁在线播放成人免费| 亚洲av免费高清在线观看| 日韩 亚洲 欧美在线| 午夜福利成人在线免费观看| 又爽又黄a免费视频| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 亚洲自偷自拍三级| 久久久精品欧美日韩精品| 成人午夜高清在线视频| 欧美激情在线99| 99riav亚洲国产免费| 久久人人爽人人片av| 如何舔出高潮| 国产在线精品亚洲第一网站| 伦精品一区二区三区| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产精品无大码| av免费在线看不卡| 精品久久国产蜜桃| 成人午夜高清在线视频| 一个人观看的视频www高清免费观看| 性色avwww在线观看| 国产麻豆成人av免费视频| 久久精品久久久久久久性| 天堂影院成人在线观看| 午夜视频国产福利| 麻豆成人av视频| 国产成人精品久久久久久| 日韩欧美精品v在线| 国产伦精品一区二区三区视频9| 亚洲内射少妇av| 欧美zozozo另类| 在现免费观看毛片| 极品教师在线视频| 亚洲在线自拍视频| 国产伦理片在线播放av一区 | 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 久久久久久久久久黄片| 观看美女的网站| 精品一区二区三区视频在线| 老司机福利观看| 精品人妻一区二区三区麻豆| 真实男女啪啪啪动态图| 尾随美女入室| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 亚洲成人精品中文字幕电影| 99久久中文字幕三级久久日本| 国产精品三级大全| 久久午夜福利片| 久久99热6这里只有精品| 国产色爽女视频免费观看| 国产精品不卡视频一区二区| 国产精品久久久久久久电影| 久久人人精品亚洲av| 国产黄a三级三级三级人| 天天躁日日操中文字幕| 免费在线观看成人毛片| 乱码一卡2卡4卡精品| 亚洲无线观看免费| 三级国产精品欧美在线观看| 最新中文字幕久久久久| 国国产精品蜜臀av免费| 性色avwww在线观看| 欧美成人免费av一区二区三区| 麻豆一二三区av精品| 一个人看的www免费观看视频| 久久久久久九九精品二区国产| 国产精品一及| 日韩强制内射视频| 日韩高清综合在线| 免费看日本二区| 中文字幕久久专区| 国产黄片美女视频| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 亚洲综合色惰| 黄色视频,在线免费观看| 麻豆国产av国片精品| 久久精品国产亚洲av天美| 亚洲人成网站在线观看播放| 夫妻性生交免费视频一级片| 男人舔奶头视频| 一级毛片电影观看 | 国内精品美女久久久久久| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产成人福利小说| 亚洲精品国产av成人精品| 欧美色欧美亚洲另类二区| 成人美女网站在线观看视频| 在线a可以看的网站| 欧美日本亚洲视频在线播放| 国产精品人妻久久久影院| 国产精品,欧美在线| 久久久久久久午夜电影| 亚洲av第一区精品v没综合| 51国产日韩欧美| 久久精品国产亚洲网站| 女人被狂操c到高潮| 亚洲不卡免费看| 天堂网av新在线| 一个人看的www免费观看视频| 中文欧美无线码| 久久久久久国产a免费观看| 免费观看的影片在线观看| 成年av动漫网址| 成人欧美大片| 熟女电影av网| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 亚洲成av人片在线播放无| 亚洲电影在线观看av| 国产一区二区三区av在线 | 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 在线国产一区二区在线| 三级国产精品欧美在线观看| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 亚洲真实伦在线观看| 亚洲欧美日韩高清专用| 美女大奶头视频| 国产成人福利小说| 日本在线视频免费播放| 午夜福利视频1000在线观看| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 亚洲丝袜综合中文字幕| 三级经典国产精品| 亚洲国产精品sss在线观看| 舔av片在线| 熟女人妻精品中文字幕| 可以在线观看毛片的网站| 永久网站在线| 国产精品,欧美在线| 好男人视频免费观看在线| 久久久久久久久久久丰满| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 欧美日韩在线观看h| 观看美女的网站| 日本黄色片子视频| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 日韩欧美 国产精品| 精品久久久久久久久av| 国产亚洲精品久久久com| 高清在线视频一区二区三区 | 国产老妇伦熟女老妇高清| 成人亚洲精品av一区二区| 国产伦一二天堂av在线观看| 亚洲乱码一区二区免费版| 嫩草影院精品99| 亚洲成a人片在线一区二区| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 国产亚洲av嫩草精品影院| 高清在线视频一区二区三区 | 极品教师在线视频| 伦精品一区二区三区| 国产亚洲5aaaaa淫片| 我要看日韩黄色一级片| 韩国av在线不卡| 青春草视频在线免费观看| 亚洲第一区二区三区不卡| 高清日韩中文字幕在线| 国产成人影院久久av| 亚洲第一电影网av| 国产熟女欧美一区二区| 高清日韩中文字幕在线| 久久久久九九精品影院| 久久人妻av系列| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 婷婷色综合大香蕉| 国产精品女同一区二区软件| 一进一出抽搐动态| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 真实男女啪啪啪动态图| 22中文网久久字幕| 91久久精品国产一区二区三区| 99久国产av精品国产电影| 国产91av在线免费观看| 看十八女毛片水多多多| eeuss影院久久| 国产高清有码在线观看视频| 人妻久久中文字幕网| 日本熟妇午夜| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 日韩精品有码人妻一区| 国产高清有码在线观看视频| 内地一区二区视频在线| 在线观看66精品国产| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 老司机影院成人| 丝袜喷水一区| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 亚洲欧洲日产国产| 一本一本综合久久| 一级毛片aaaaaa免费看小| 亚洲成人久久性| 99在线人妻在线中文字幕| 日韩 亚洲 欧美在线| 91精品一卡2卡3卡4卡| 只有这里有精品99| 久久久精品94久久精品| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 国产成人午夜福利电影在线观看| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 国产老妇伦熟女老妇高清| 午夜精品一区二区三区免费看| 中文资源天堂在线| 中文字幕av成人在线电影| 免费观看人在逋| 特大巨黑吊av在线直播| 一个人看的www免费观看视频| 久久久成人免费电影| 久久国内精品自在自线图片| 天堂网av新在线| 不卡一级毛片| 99在线人妻在线中文字幕| 免费在线观看成人毛片| 亚洲最大成人中文| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 亚洲丝袜综合中文字幕| 不卡一级毛片| 97在线视频观看| 国产视频内射| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 草草在线视频免费看| 能在线免费看毛片的网站| 黄色欧美视频在线观看| 蜜臀久久99精品久久宅男| 国产高清有码在线观看视频| 国产av一区在线观看免费| 亚洲成人久久性| 九九热线精品视视频播放| 亚洲一区高清亚洲精品| 网址你懂的国产日韩在线| 亚洲18禁久久av| 国产中年淑女户外野战色| 九草在线视频观看| 国产成年人精品一区二区| 久久人人爽人人片av| 欧美人与善性xxx| 久久这里只有精品中国| 一本一本综合久久| 看片在线看免费视频| 日本与韩国留学比较| 久久午夜福利片| 欧美变态另类bdsm刘玥| 91aial.com中文字幕在线观看| 嫩草影院新地址| 国产精品久久久久久久久免| 国产熟女欧美一区二区| 深夜精品福利| 国产中年淑女户外野战色| 国产伦理片在线播放av一区 | 亚洲欧洲日产国产| 久久精品久久久久久久性| 大香蕉久久网| 深夜精品福利| 少妇熟女欧美另类| 色5月婷婷丁香| 我的女老师完整版在线观看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产伦一二天堂av在线观看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 能在线免费观看的黄片| 国产探花极品一区二区| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 精品欧美国产一区二区三| 亚洲无线观看免费| 色综合亚洲欧美另类图片| 男人和女人高潮做爰伦理| 91狼人影院| 久久亚洲精品不卡| 在现免费观看毛片| 尾随美女入室| 亚洲美女视频黄频| 久久久久网色| 成人永久免费在线观看视频| 丰满的人妻完整版| 99热6这里只有精品| 国产精品1区2区在线观看.| 久久久精品94久久精品| 亚洲欧美精品综合久久99| 欧美精品一区二区大全| 免费看美女性在线毛片视频| 国产在视频线在精品| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 国产精品久久久久久av不卡| 久久久a久久爽久久v久久| 欧美+亚洲+日韩+国产| 美女内射精品一级片tv| 99久久精品一区二区三区| 亚洲成人中文字幕在线播放| 男插女下体视频免费在线播放| 国产伦理片在线播放av一区 | 久久午夜福利片| 18+在线观看网站| 热99在线观看视频| 亚洲国产欧美在线一区| 69人妻影院| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 日本黄色片子视频| 人体艺术视频欧美日本| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 亚洲第一电影网av| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 男人和女人高潮做爰伦理| 在线播放无遮挡| 日韩三级伦理在线观看| 国产日本99.免费观看| 一级黄色大片毛片| a级毛片免费高清观看在线播放| 欧美成人免费av一区二区三区| 在线观看av片永久免费下载| 能在线免费看毛片的网站| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 特大巨黑吊av在线直播| 22中文网久久字幕| 亚洲精品影视一区二区三区av| 特大巨黑吊av在线直播| 男女下面进入的视频免费午夜| 99久国产av精品国产电影| 久久久久久久久久黄片| 人妻少妇偷人精品九色| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 中文字幕熟女人妻在线| 内地一区二区视频在线| 亚洲av中文av极速乱| 最后的刺客免费高清国语| 日本熟妇午夜| 亚洲精品粉嫩美女一区| 成年av动漫网址| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 一边摸一边抽搐一进一小说| 91狼人影院| 变态另类丝袜制服| 久久精品国产亚洲av天美| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 一本久久中文字幕| 国产毛片a区久久久久| 国产精品三级大全| 真实男女啪啪啪动态图| 日韩精品有码人妻一区| 人妻系列 视频| 久久精品91蜜桃| 久久6这里有精品| 日韩在线高清观看一区二区三区| 亚洲自偷自拍三级| 人妻久久中文字幕网| 亚洲欧美精品专区久久| 能在线免费观看的黄片| www.av在线官网国产| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| av在线老鸭窝| 丰满的人妻完整版| 少妇熟女欧美另类| 国产一级毛片七仙女欲春2| 岛国在线免费视频观看| 成人一区二区视频在线观看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 啦啦啦啦在线视频资源| ponron亚洲| 日韩欧美精品免费久久| 大香蕉久久网| 国产精品精品国产色婷婷| 赤兔流量卡办理| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 亚洲成人精品中文字幕电影| 亚洲欧美日韩高清专用| 国产高清不卡午夜福利| 丝袜美腿在线中文| 九草在线视频观看| 国产黄片视频在线免费观看| kizo精华| 久久人人爽人人爽人人片va| 国产乱人偷精品视频| 草草在线视频免费看| 国产久久久一区二区三区| 日本与韩国留学比较| 久久精品夜色国产| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 久99久视频精品免费| av在线蜜桃| 亚洲国产精品成人久久小说 | 国产精品,欧美在线| 午夜久久久久精精品| 草草在线视频免费看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 亚洲精品久久久久久婷婷小说 | 日韩强制内射视频| 看片在线看免费视频| 亚洲欧洲日产国产| 免费人成在线观看视频色| 日韩三级伦理在线观看| 国产在视频线在精品| 国产精品av视频在线免费观看| 久久草成人影院| 亚洲精品成人久久久久久| 一级av片app| 久久99蜜桃精品久久| 美女高潮的动态| 中文欧美无线码| 嘟嘟电影网在线观看| 成人三级黄色视频| 男人狂女人下面高潮的视频| 村上凉子中文字幕在线| 国产69精品久久久久777片| 亚洲成人精品中文字幕电影| 成人鲁丝片一二三区免费| 人人妻人人澡欧美一区二区| 韩国av在线不卡| 欧美日本亚洲视频在线播放| 国产视频内射| 亚洲成人精品中文字幕电影| 免费看av在线观看网站| 国产 一区精品| 国产精品蜜桃在线观看 | 青青草视频在线视频观看| 成人永久免费在线观看视频| 观看美女的网站| 日本熟妇午夜| 久久韩国三级中文字幕| 婷婷精品国产亚洲av| 亚洲国产精品成人综合色| 一个人看的www免费观看视频| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 在线a可以看的网站| 午夜福利视频1000在线观看| 国产午夜福利久久久久久| 国产成人aa在线观看| 国产亚洲5aaaaa淫片| 一级av片app| 热99在线观看视频| 国产av一区在线观看免费| av免费在线看不卡| 国产色婷婷99| 国产精品精品国产色婷婷| 日韩一区二区视频免费看| or卡值多少钱| 亚洲在久久综合| 丝袜美腿在线中文| av天堂中文字幕网| 国产成人影院久久av| 国内精品美女久久久久久| 国产麻豆成人av免费视频| av在线观看视频网站免费|