檢測燕麥干草主要營養(yǎng)成分含量的近紅外光譜分析模型

王 儲， 麻冬梅， 李 躍， 屈新月， 李智林， 胡倩楠， 喬葭月， 孫 彥*

(1. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 北京 100093； 2. 寧夏大學(xué)生態(tài)環(huán)境學(xué)院， 寧夏 銀川 750021)

燕麥(Avenasative)是一種優(yōu)良的禾本科(Gramineae)飼草，具有較高的營養(yǎng)價值與飼用價值，可改善粗飼料的消化利用率，是家畜重要的飼料來源，對緩解家畜矛盾、提供均衡飼料、維持草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展和生態(tài)建設(shè)均起到了至關(guān)重要的作用[1-3]。燕麥干草適口性好，具有可消化纖維含量高以及鉀和硝酸鹽含量低等特點，可提高家畜的生產(chǎn)性能外，還能降低在某些時期疾病的發(fā)病率，例如降低奶牛產(chǎn)后酮病的發(fā)生。燕麥干草的營養(yǎng)品質(zhì)主要取決于粗蛋白(CP)、中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)和粗脂肪(EE)含量，而且易受品種、產(chǎn)地、收獲時期、加工方式等因素的影響[4-7]。目前國內(nèi)對牧草營養(yǎng)指標(biāo)的測定普遍采用常規(guī)的化學(xué)測定方法，具有準(zhǔn)確度和精確度高等優(yōu)點，但存在周期長、成本高、局限性強(qiáng)和操作麻煩等缺點，不能實時監(jiān)測，此外，檢測使用危險的化學(xué)藥品，對檢測員與環(huán)境也會造成一定的危害。

近紅外光譜分析是一種能夠快速估測樣品中一種或多種化學(xué)成分含量的新技術(shù)，其關(guān)鍵特征是對有機(jī)化學(xué)物質(zhì)在其近紅外光譜區(qū)內(nèi)光學(xué)特性的利用，并且具有定量分析，可連續(xù)進(jìn)行樣品分析，為飼料品質(zhì)快速鑒定、常規(guī)營養(yǎng)成分快速檢測和飼料產(chǎn)地溯源等提供了技術(shù)途徑[8-11]。近紅外光譜屬于分子振動光譜類型，其本質(zhì)又是非諧振動的倍頻和組合頻。由于每個分子都會有許多吸收帶，并且吸收帶的強(qiáng)弱為近紅外分析樣品濃度，物理性質(zhì)(如密度、粘度、粒度、硬度等)和化學(xué)成分(如蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪、淀粉、水分等)提供了可能。理論上說，凡能產(chǎn)生近紅外光譜的物質(zhì)，都可用近紅外光譜技術(shù)進(jìn)行分析檢測。近年來，近紅外在紫花苜蓿(Medicagosativa)、黑麥草(Loliumspp.)、玉米秸稈中營養(yǎng)品質(zhì)的測定得到廣泛的運用[12-14]，其中，納嶸等[15]通過采集94份苜蓿樣本結(jié)合最小二乘法，使用4種數(shù)學(xué)處理方法與5種散射校正方法對原始光譜進(jìn)行處理建立苜蓿干草常規(guī)營養(yǎng)成分含量的近紅外模型，然而，在燕麥干草主要營養(yǎng)成分含量分析上國內(nèi)鮮有人報道。近紅外技術(shù)本身屬于一種間接檢測技術(shù)，在實際運用中需要采集大量具有代表性的樣本，除此之外樣品來源、收獲時期和生產(chǎn)年限都會使建立的模型產(chǎn)生差異，因此研究應(yīng)用NIRS快速、準(zhǔn)確測定不同年限不同收獲時期以及不同品種的燕麥干草中粗蛋白(CP)、中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維含量(ADF)和粗脂肪(EE)含量的方法，對我國飼草行業(yè)的發(fā)展和提供優(yōu)質(zhì)牧草，起到了關(guān)鍵的作用。

1 材料和方法

1.1 樣品采集與處理

試驗樣品采自2020—2021年寧夏平羅-寧夏大學(xué)試驗地種植的燕麥種質(zhì)資源，品種分別來自中國、美國、加拿大，于拔節(jié)、抽穗、開花、乳熟和完熟期進(jìn)行齊地刈割收獲，每個小區(qū)隨機(jī)采集5株。在60℃下烘干至恒重，剪碎，混勻、用康源鑫KF-25(溫州)高速粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，然后過1 mm的篩，得到249份燕麥全株干草樣品。試驗技術(shù)路線圖如圖1所示。

圖1 模型構(gòu)建流程圖Fig.1 Model construction flow chart

1.2 數(shù)據(jù)處理與分析

采用定標(biāo)軟件WinISI III和EXCEL 2019對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析。

1.3 近紅外光譜數(shù)據(jù)的獲取和處理

本試驗采用FOSS公司生產(chǎn)的NIRSsystem500型近紅外光譜儀，工作條件為室溫26℃，掃描波長范圍1 100 ～2 492.8 nm，波長間隔2 nm，掃描次數(shù)32次計算平均光譜。

為了消除儀器和環(huán)境的干擾，提高信噪比，進(jìn)行光譜預(yù)處理，采用無散射預(yù)處理(None)、標(biāo)準(zhǔn)化處理(SNV)、去趨勢化處理(Detrend)、SNV+ Detrend、標(biāo)準(zhǔn)化多元散射處理(SMSC)、加權(quán)多元散射處理(WMSC)、反向多元散射處理(IMSC)等處理方法；數(shù)學(xué)處理包含導(dǎo)數(shù)處理和平滑處理；回歸方法包括改進(jìn)局部偏最小二乘法(MPLS)、偏最小二乘法(PLS)、主成分回歸(PCR)。

1.4 燕麥干草營養(yǎng)分含量(品質(zhì))的檢測

燕麥干草中粗蛋白質(zhì)(CP)含量參照GB/T 6432—2018方法(KDY-9830凱氏定氮儀)測定；中性洗滌纖維(NDF)含量參照GB/T 20806—2006方法(ANKOM 2000i 全自動纖維分析儀)測定；酸性洗滌纖維(ADF)含量參照NY/T 1459—2007方法(ANKOM 2000i 全自動纖維分析儀)測定；粗脂肪(EE)含量參照GB/T 6433—2006方法(DFA-2型分布式脂肪測定儀)。每個樣品指標(biāo)重復(fù)測定3次，取平均值作為最終化學(xué)分析測定值，所有營養(yǎng)成分含量均以干物質(zhì)為基礎(chǔ)。

1.5 建立NIRS定量分析模型方法

近紅外分析的樣品包括定標(biāo)集和驗證集，定標(biāo)集樣品中盡可能包括那些最高、最低范圍內(nèi)的樣品。將剔除異常值后的所有樣品為定標(biāo)集，再做交叉驗證并用驗證記進(jìn)行外部驗證，根據(jù)RSQ,RMSEC,RMSECV,RMSEP和RPD等指標(biāo)確定最優(yōu)模型。建立模型后對隨機(jī)選取35個樣品(驗證集)進(jìn)行預(yù)測，并將預(yù)測值與真實值進(jìn)行檢驗判定預(yù)測結(jié)果與真實值的差異來評價模型預(yù)測能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 燕麥干草CP，NDF，ADF和EE的化學(xué)分析結(jié)果

圖2是249份燕麥干草樣品中CP，NDF，ADF和EE的化學(xué)分析結(jié)果。含量范圍分別是4.50%～12.30%，43.40%～57.10%，18.22%～44.50%，4.60%～15.30%。由圖2可見樣品中這4個指標(biāo)的含量變化幅度大，符合正態(tài)分布，樣品來源廣泛，其變化范圍基本上覆蓋當(dāng)前生產(chǎn)上不同生育時期推廣品種和品種選育中可能出現(xiàn)的CP，NDF，ADF和EE的含量，可用于建立燕麥干草主要營養(yǎng)成分的近紅外光譜校正模型。

圖2 燕麥草常規(guī)養(yǎng)分含量測定值Fig.2 Measued value of conventional nutrient contents of oat grass

2.2 燕麥干草的光譜圖分析

圖3是249個燕麥樣品的近紅外漫反射光譜圖曲線，從中可以看出近紅外區(qū)內(nèi)燕麥干草的光譜反映很好，每個樣品的吸收波段很相似卻不會完全重合，這表明不同樣本之間的重現(xiàn)性良好，又存在差異。樣品之間的差異也有可能是因為不同樣品表面的粗糙程度不同、電噪聲和操作的影響，所以需要進(jìn)一步對光譜進(jìn)行預(yù)處理。儀器噪音即使用者操作失誤等均會產(chǎn)生奇異樣本，使整個分析數(shù)據(jù)的結(jié)果受到影響。本次試驗的聚類算法采用主成分分析(PCA)，并利用馬氏距離法(GH>3)和T檢驗(T>2.50)剔除異常值，發(fā)現(xiàn)并剔除6個異常樣本，最終得到243份燕麥干草樣品的光譜圖用來建立預(yù)測燕麥干草品質(zhì)的近紅外模型。

圖3 燕麥干草原始光譜Fig.3 Oat hay raw spectrum

2.3 CP，NDF，ADF和EE近紅外校正模型的建立與優(yōu)化

本試驗通過定標(biāo)軟件WinISI III分別對CP，NDF，ADF和EE定標(biāo)集的243個燕麥干草樣品進(jìn)行最佳光譜處理和最優(yōu)數(shù)學(xué)處理方法以及最適合的回歸方法的篩選。建立校正標(biāo)準(zhǔn)誤差和交叉驗證誤差最小，定標(biāo)相關(guān)系數(shù)最大的校正模型。得到了CP，NDF，ADF和EE的最佳近紅外建模數(shù)據(jù)。采用MPLS分別對經(jīng)過不同光譜和數(shù)學(xué)預(yù)處理后的光譜進(jìn)行建模分析，并通過交叉驗證的方式進(jìn)行預(yù)測，具有最低的SEC、SECV和最高的RSQ和1-VR模型為最優(yōu)模型。

表1是CP與EE的定標(biāo)相關(guān)系數(shù)和交叉驗證系數(shù)分別為0.97和0.92,0.91和0.83，校正標(biāo)準(zhǔn)誤和交叉驗證誤差分別為0.00和0.00,0.01和0.01，逼近化學(xué)分析的精確度。另外NDF與ADF的建模效果較CP和EE差，定標(biāo)相關(guān)系數(shù)和交叉驗證系數(shù)分別為0.86和0.79,0.83和0.79，校正標(biāo)準(zhǔn)誤和交叉驗證誤差分別為0.02和0.02,0.01和0.01，接近化學(xué)分析的精確度。

表1 燕麥干草主要營養(yǎng)成分含量的最優(yōu)定標(biāo)模型Table 1 Optimization results for the calibration of CP,NDF,ADF and EE

2.4 CP，NDF，ADF和EE近紅外校正模型預(yù)測效果評價

為了進(jìn)一步檢驗校正模型的優(yōu)劣，本次試驗采用驗證集樣品對模型的預(yù)測效果進(jìn)行評價，衡量參數(shù)選用RSQv外部驗證決定系數(shù)，RMSEP預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)誤差，RPD預(yù)測相對標(biāo)準(zhǔn)誤差。根據(jù)Sinnaeve、Park和何云的報道，當(dāng)RPD(SD/RMSESV)大于2.50時模型能用于近紅外預(yù)測[12,16-17]，大于3.00時模型具有較好的預(yù)測效果，小于2.00時，定標(biāo)模型受到限制，不能用于預(yù)測。由表2看出CP,ADF,NDF,和EE的外部驗證決定系數(shù)和預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)誤差分別為0.96和0.01,0.90和0.00,0.84和0.00,0.95和0.00。其中CP,NDF和EE的預(yù)測相對標(biāo)準(zhǔn)誤差均大于3說明具有很好的預(yù)測效果，ADF的預(yù)測相對標(biāo)準(zhǔn)誤差相對較小但是大于2.50，可以用于近紅外預(yù)測。除此之外，由散點圖4-7所示，比較化學(xué)值與預(yù)測值之間的差異，發(fā)現(xiàn)他們之間相關(guān)系數(shù)分別為0.96，0.90，0.84，0.95，均在0.83以上，表明預(yù)測值與真實值之間比較接近有很好的預(yù)測效果，可以應(yīng)用此模型對未知的燕麥干草樣品中的CP,ADF,NDF和EE的含量進(jìn)行實際預(yù)測。

表2 燕麥干草主要營養(yǎng)成分含量的最優(yōu)定標(biāo)模型的預(yù)測效果評估Table 2 Evaluation of prediction effect of optimal calibration model for main nutrient content of oat hay

圖4 CP測定值與預(yù)測值的相關(guān)性Fig.4 Correlation between measured and predicted value of CP

圖5 NDF測定值與預(yù)測值的相關(guān)性Fig.5 Correlation between measured and predicted value of NDF

圖6 ADF測定值與預(yù)測值的相關(guān)性Fig.6 Correlation between measured and predicted value of ADF

圖7 EE測定值與預(yù)測值的相關(guān)性Fig.7 Correlation between measured and predicted value of EE

3 討論

3.1 NIRS模型測定燕麥干草品質(zhì)的可行性

本試驗中所采集的燕麥干草樣品分別來自不同地區(qū)、年限、生長期，并且樣品的常規(guī)養(yǎng)分含量變化幅度大，覆蓋面廣泛，時間跨度較長，有利于NIRS模型的構(gòu)建與優(yōu)化；樣品間的離散程度大符合正態(tài)分布，表明所選樣品分布廣泛，且具有良好的代表性。NIRS與化學(xué)分析方法聯(lián)用，包括光譜預(yù)處理、變量選擇、數(shù)學(xué)處理、多元校正和模型轉(zhuǎn)移，一定程度上能夠提高模型預(yù)測的準(zhǔn)確性和可靠程度[18]。為了進(jìn)一步優(yōu)化模型，人們采用NIRS與多元線性回歸法(MLR)、主成分回歸法(PCR)、改進(jìn)偏最小二乘回歸法(MPLS)和偏最小二乘回歸法(PLS)相結(jié)合使預(yù)測的結(jié)果更為可靠[19-20]。本試驗在建立燕麥干草品質(zhì)鑒定近紅外預(yù)測模型中，對不同營養(yǎng)成分含量對應(yīng)的光譜圖進(jìn)行了不同預(yù)處理以及數(shù)學(xué)處理，在此基礎(chǔ)上再結(jié)合MPLS分析，將燕麥干草的光譜圖和對應(yīng)的通過化學(xué)分析方法測定的燕麥干草營養(yǎng)指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)，通過交叉驗證評價模型預(yù)測效果，最終得到準(zhǔn)確度較高的CP,NDF,ADF和EE含量的4個預(yù)測模型。目前關(guān)于近紅外在燕麥干草品質(zhì)分析中應(yīng)用的報道較少，關(guān)于燕麥干草中EE含量的預(yù)測，更是罕見或者預(yù)測結(jié)果不太理想[21-23]。本次試驗建立的模型具有以下特點：樣品來源分布廣，品種數(shù)目多，收集于不同生長時期和年限，分析結(jié)果更加全面,因此本試驗建立的模型效果表明NIRS技術(shù)可用于分析燕麥干草品質(zhì)。

3.2 影響NIRS校正模型建立的因素

近紅外作為一種通過光譜間接檢測的技術(shù)，存在許多影響準(zhǔn)確性的因素，其受到影響的因素可概括為以下幾點：(1)樣品的儲存環(huán)境；(2)收獲時期；(3)來原產(chǎn)地；(4)莖葉比；(5)樣品的狀態(tài)；(6)化學(xué)分析結(jié)果的準(zhǔn)確性；(7)光譜的處理方法對測定結(jié)果的影響[24-28]。本研究中為了避免樣品的狀態(tài)、儲存環(huán)境影響，采用統(tǒng)一烘干，重復(fù)取樣，選取光譜平均值的方法，來消除影響。關(guān)于化學(xué)分析測定均參照國家標(biāo)準(zhǔn)，并進(jìn)行多次重復(fù)測定來降低誤差。本試驗通過不同光譜處理、數(shù)學(xué)處理和回歸方法的組合挑選適宜的預(yù)處理方法來減少和消弱非目標(biāo)因素對光譜的影響，此外本次試驗對燕麥微量元素的測定還沒有涉及，為進(jìn)一步提高模型的準(zhǔn)確性和適用性，應(yīng)在今后的研究中進(jìn)一步擴(kuò)大樣品數(shù)量，增加測定指標(biāo)，加強(qiáng)樣品的代表性以及獲取更多的準(zhǔn)確數(shù)據(jù)來完善模型的應(yīng)用。

4 結(jié)論

本試驗利用了NIRS分析技術(shù)建立了燕麥干草品質(zhì)的近紅外預(yù)測模型。其中CP,NDF和EE含量預(yù)測模型的定標(biāo)系數(shù)均(RSQ)和外部驗證決定系數(shù)(RSQv)均在0.83以上，校正標(biāo)準(zhǔn)誤(SEC)、交叉驗證誤差(SECV)和預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)誤差(RESEP)均小于0.02，RPD均大于3，具有很好的預(yù)測效果，達(dá)到化學(xué)分析的精確度，ADF含量預(yù)測模型的定標(biāo)系數(shù)均和外部驗證決定系數(shù)分別為0.83和0.84，校正標(biāo)準(zhǔn)誤(SEC)、交叉驗證誤差(SECV)和預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)誤差(RESEP)均小于0.01，接近化學(xué)分析精度，預(yù)測相對標(biāo)準(zhǔn)誤差(RPD)相對較小但是大于2.50。所有模型均可用于實際檢測中且適應(yīng)良好，其中CP，NDF，EE含量的定標(biāo)模型效果更為精確和可靠。