藜麥種質(zhì)資源對霜霉病的抗性鑒定與評價

王 昶， 楊發(fā)榮， 李敏權(quán)， 陸建英， 魏玉明， 趙桂琴

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院，甘肅 蘭州 730070；2. 甘肅省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所，甘肅 蘭州 730070； 3. 甘肅省農(nóng)業(yè)科學院畜草與綠色農(nóng)業(yè)研究所，甘肅 蘭州 730070；4. 甘肅省農(nóng)業(yè)科學院，甘肅 蘭州 730070)

藜麥(Chenopodiumquinoa)原產(chǎn)于南美洲安第斯山區(qū)，距今已有7 000多年的栽培歷史[1]，是當?shù)鼐用駛鹘y(tǒng)的食物和家畜飼料來源[2]。藜麥籽粒無麩質(zhì)[3]，蛋白質(zhì)含量高，而且富含人體必需的9種氨基酸以及礦物質(zhì)、維生素、抗氧化物質(zhì)、膳食纖維等營養(yǎng)物質(zhì)[4]。藜麥對生物和非生物脅迫均表現(xiàn)出優(yōu)異的抗性[5]，可在惡劣環(huán)境中生長，尤其是邊緣貧瘠土壤中。藜麥全株均可作為優(yōu)良飼草，葉片[6]、籽實[7]和麩皮[8]均是優(yōu)質(zhì)的高蛋白飼料，可改善飼草中氨基酸平衡，為家畜提供優(yōu)質(zhì)蛋白。藜麥秸稈的營養(yǎng)價值雖與其它部分相比較低，但其仍表現(xiàn)出與現(xiàn)有優(yōu)良飼草料相當?shù)娘曈脙r值[9]。藜麥的營養(yǎng)價值高、抗逆性強，是全球理想的糧飼兼用型作物，深受歡迎，現(xiàn)已突破南美洲傳統(tǒng)原產(chǎn)國，擴延至全球90多個國家[10]。目前，我國藜麥種植區(qū)主要分布在甘肅、山西、青海、內(nèi)蒙古等省份，2020年僅甘肅省種植面積就達1萬hm2左右，約占全國面積的一半。

藜麥的全球擴延，帶來了病蟲害種類和數(shù)量增加的問題[11]。病原菌PeronosporavariabilisG?um引起的(曾命名為P.farinosaf. sp.chenopodiiByford)[12]藜麥霜霉病(Downy mildew，DM)是藜麥生產(chǎn)中為害最嚴重的世界性病害[13]，現(xiàn)已傳播至全球所有藜麥種植區(qū)[14]。該病害主要為害葉片，最初在葉正面出現(xiàn)小而不規(guī)則的褪綠壞死斑，同時在葉背形成灰色霉層，隨著病程的發(fā)展，這些斑點開始聚結(jié)，融合，葉片萎黃，最終導(dǎo)致葉片脫落。病害發(fā)生后葉片機體受損，光合面積減少，嚴重影響植株的生長發(fā)育。霜霉病可導(dǎo)致藜麥減產(chǎn)33%～99%[15]，氣候環(huán)境有利病害生長時，減產(chǎn)甚至可達100%[16]。藜麥霜霉病在我國普遍發(fā)生嚴重，在山西省靜樂縣發(fā)病率達95%，使藜麥減產(chǎn)40%左右[17]。筆者調(diào)查發(fā)現(xiàn)，甘肅省的甘南州、臨夏州和武威市等藜麥種植區(qū)發(fā)病率普遍在40%以上，臨夏州陰濕區(qū)最為嚴重，甚至高達95%，已嚴重威脅本地藜麥生產(chǎn)。

藜麥霜霉病的防治非常困難[18]，噴施殺菌劑是其防治的傳統(tǒng)方法[19]。藜麥霜霉病病原菌Peronosporavariabilis具有有性生殖，易變異[20]，使其產(chǎn)生抗藥性。利用抗病品種防治是最簡單、經(jīng)濟和有效的措施，而種質(zhì)資源抗病性評價是其實現(xiàn)的先決條件。國外學者開展了大量的抗性篩選和評價研究[14,21-22]。Mhada等[14]對77份藜麥種質(zhì)資源和當?shù)?份野生種(Chenopodiumalbum和Chenopodiumurale)在摩洛哥通過采取離體葉片接菌鑒定和田間自然感病鑒定的方法進行了霜霉病抗性鑒定，發(fā)現(xiàn)種質(zhì)資源‘M2a’和‘S938/1’表現(xiàn)抗病，‘M24’表現(xiàn)高感，其余均感病。Nolen[18]對3個Chenopodiumberlandierivar.Macrocalycium(BVM)、2個BVM ×C.quinoa雜交種、1個藜(C.album)、4個藜麥(C.quinoa)等10個藜屬植物進行了霜霉病抗性評價，未發(fā)現(xiàn)完全抗病或免疫材料。近年來，國內(nèi)學者對藜麥的研究多集中在引種、栽培[23-24]、耐鹽性[25-26]、抗旱性[27-28]、功能物質(zhì)分析[29-30]及功能基因鑒定[31-32]等方面，鮮見有關(guān)藜麥霜霉病抗性評價的研究報道?；诖?，我們開展本土環(huán)境條件下藜麥種質(zhì)的霜霉病抗性篩選與評價試驗，旨在為抗病基因的挖掘、藜麥遺傳改良與霜霉病綜合防控提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1藜麥種質(zhì)資源 參試材料包括49份藜麥(C.quinoa)種質(zhì)資源和1份‘臺灣紅藜’(Chenpodiumformosanum)，均由甘肅省農(nóng)業(yè)科學院畜草與綠色農(nóng)業(yè)研究所從中國農(nóng)業(yè)科學院國家作物種質(zhì)資源庫、山西稼祺藜麥公司、北京農(nóng)品堂營養(yǎng)科技股份有限公司和甘肅條山集團農(nóng)林科學研究所等機構(gòu)引進和收集。

1.1.2供試病原菌 采集田間典型的藜麥病葉(為了與田間抗性鑒定病原菌保持一致，盡量采集田間試驗區(qū)藜麥病葉)，在低溫冷藏條件下帶回實驗室，用無菌毛刷刷掉葉片老舊孢子和雜質(zhì)，用無菌水沖洗干凈，滅菌濾紙吸干表面水分，置于培養(yǎng)箱中，在20℃黑暗條件下保濕培養(yǎng)48 h，待葉片背面長出新鮮孢子囊后備用。

1.1.3孢子懸浮液的制備 將長出新鮮孢子囊的葉片置于20 mL無菌離心管中，加入5 mL無菌水，在渦旋儀上均勻震蕩，使得孢子囊和葉片充分脫離，倒出懸浮液，4層無菌紗布過濾，取濾液在顯微鏡下用血球計數(shù)板計數(shù)，調(diào)至每毫升1×105個孢子囊，加入0.1%吐溫20備用。

1.2 試驗方法

1.2.1田間自然感病鑒定 試驗于2020年在臨夏州康樂縣八松鄉(xiāng)八松村進行，該地屬陰濕區(qū)，霜霉病易發(fā)高發(fā)，平均海拔2 000 m，年均氣溫7.5℃，降雨量625 mm。選擇地勢平坦地塊，人工開溝點播，每穴播種3粒種子，株距20 cm，行距50 cm。每品種播種2行，行長6 m，以高感材料‘QA065’作對照。4～6葉期間苗，每穴留苗1株。選擇藜麥花芽分化期至盛花期(霜霉病盛發(fā)期)[33]調(diào)查發(fā)病率，分別采用“全葉法”(Total-leaf method)和“三葉法”[15](The three-leaf method)調(diào)查病害嚴重度，計算病情指數(shù)、評估抗性類型。“全葉法”調(diào)查時，每品種隨機選取3株，從上而下調(diào)查每株全部葉片，病害嚴重度依據(jù)菌體覆蓋單葉面積的比例確定；“三葉法”調(diào)查時，隨機選取9株，把整個植株分為上、中、下三部分，在每部分中隨機選取一葉調(diào)查。

采用Mhada等[14]的0～5級病害分級標準(略有改動)進行分級。0級：無病斑。1級：小而分散的病斑，病斑占葉片面積0～10%。2級：病斑數(shù)量和面積明顯增加，病斑占葉片面積11%～25%。3級：病斑呈褐色，葉片背面開始形成孢子，病斑占葉片面積26%～50%。4級：病斑占葉片面積51%～90%。5級：病斑面積大于葉面積90%，葉片正面和背面形成大量孢子。

發(fā)病率和病情指數(shù)分別用以下公式計算：

根據(jù)病情指數(shù)對每個品種進行抗性分級，采用Staudt和Kassemeyer[34]分級標準(略有改動)：0為免疫；0～5為高抗(HR)；5.1～25為抗(R)；25.1～50為中抗(MR)；50.1～75為感病(S)；>75為高感(HS)。

1.2.2室內(nèi)離體葉片接菌鑒定 采用“葉盤法”測定。采集藜麥成株期相同部位健康葉片，70%的乙醇表面消毒30 s，無菌水沖洗干凈，晾干，用打孔器避開主脈取直徑10 mm的葉盤，置于鋪有2層無菌濾紙，直徑為90 mm的培養(yǎng)皿中，每皿放置12個葉盤，葉背朝上，每個葉盤中央滴20 μL的孢子懸浮液，加無菌水使濾紙濕潤，保鮮膜封口。每品種3次重復(fù)，設(shè)置1個清水對照。將培養(yǎng)皿置于溫度為20℃，相對濕度80%的人工氣候培養(yǎng)箱中，黑暗培養(yǎng)24 h后，用無菌濾紙吸掉葉盤表面液滴，封口后12 h黑暗/12 h光照交替培養(yǎng)，接種5～7 d后調(diào)查發(fā)病情況。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS 18.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。用Duncan氏新復(fù)極差法進行差異顯著性檢驗；組間連接法(Between-groups linkage)進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間抗性鑒定結(jié)果

分別采用“全葉法”和“三葉法”對50份藜麥材料進行田間發(fā)病率和病情指數(shù)的調(diào)查及抗性評價。結(jié)果如表1所示，不同材料發(fā)病率、“全葉法”病情指數(shù)、“三葉法”病情指數(shù)及抗性表現(xiàn)出顯著差異水平(P<0.05)。參試材料全部發(fā)病，普遍嚴重，無免疫品種，基于“全葉法”病情指數(shù)的抗性評價結(jié)果顯示(表1、圖1)，表現(xiàn)高抗的有‘臺灣紅藜’和‘QA064’，表現(xiàn)中抗的有‘隴藜2’號和‘HL-Q5’，占參試材料的8%，表現(xiàn)感病的有‘QA045’、‘QA050-2’和‘青海-02’等3份材料，占參試材料的6%，其余43材料均表現(xiàn)高感，占參試材料的86.00%；“三葉法”病情指數(shù)大于70.00 的有45個品種，占參試材料的90.00%，小于70.00的有5份材料，‘臺灣紅藜’病情指數(shù)最小，為2.67?；凇叭~法”病情指數(shù)的抗性評價結(jié)果顯示(表1、圖1)，表現(xiàn)高抗的材料有‘臺灣紅藜’和‘QA064’，占比4%，表現(xiàn)中抗的有‘隴藜2號’和‘HL-Q5’，占比4%，表現(xiàn)感病的有‘高臺02’和‘青海-02’，占比4%，其余44材料均表現(xiàn)高感，占比88.00%；參試材料的“全葉法”和“三葉法”病情指數(shù)非常接近，抗性鑒定中除‘QA050-2’、‘QA045’和‘高臺02’等3份材料基于“全葉法”病指分別評價為感病、感病和高感，而基于“三葉法”分別評價為高感、高感和感病外，其余鑒定結(jié)果完全一致。

表1 藜麥種質(zhì)資源對霜霉病抗性田間自然感病鑒定Table 1 Resistance identification of quinoa germplasm accessions against Peronospora variabilis by natural infection in the field

圖1 不同藜麥抗性比例分布Fig.1 Resistance ratios distribution of the different quinoas

2.2 室內(nèi)離體葉片抗性鑒定結(jié)果

采用葉盤法在室內(nèi)對離體葉片人工接菌進行病葉率和病情指數(shù)的調(diào)查和抗性評價，結(jié)果如表2所示，不同藜麥材料之間病葉率和病情指數(shù)差異顯著(P<0.05)。病葉率小于100.00%的有8份材料，占參試材料的16.00%，‘臺灣紅藜’最小，為19.45%，其余42份材料均為100.00%，占比84.00%；室內(nèi)離體葉片抗性評價結(jié)果顯示(表2、圖1)90%的材料病情指數(shù)大于70.00，‘臺灣紅藜’表現(xiàn)高抗，病情指數(shù)最低，為4.44，占比2.00%，表現(xiàn)抗病的有‘QA064’，占比2.00%，表現(xiàn)中抗的有‘隴藜2號’和‘HL-Q5’，占比4.00%，表現(xiàn)感病有‘QA045’‘QA050-2’和‘青海-02’，占比6.00%；其余43份材料均表現(xiàn)高感，占比86.00%。

表2 藜麥種質(zhì)資源霜霉病抗性室內(nèi)離體葉片接種鑒定Table 2 Resistance identification of quinoa germplasm accessions against Peronospora variabilis by indoor artificial inoculation of the detached leaves

2.3 藜麥不同抗性的聚類分析

以田間全葉病情指數(shù)、三葉病情指數(shù)及室內(nèi)離體葉片病情指數(shù)共同作為聚類分析的統(tǒng)計指標，采用組間連接法進行聚類分析，以平方歐式距離(Squared Eucideandistance)2.5為聚類分割點時(圖2)，50份藜麥材料聚為5類。第一類僅為‘臺灣紅藜’，第二類僅為‘QA064’，第三類包含‘隴藜2號’和‘HL-Q5’，第四類包括‘QA045’‘QA050-2’‘高臺02’和‘青海-02’，其余42份材料為第5類。結(jié)合田間和室內(nèi)抗性評價，聚類分析第一類可定為高抗材料，第二類為抗病材料，第三類為中抗材料，第四類為感病材料，第五類為高感材料。

2.4 植株發(fā)病率、病葉率和病情指數(shù)的相關(guān)性分析

植株發(fā)病率、病葉率和病情指數(shù)的皮爾遜相關(guān)系數(shù)(Pearson correlation coefficient)分析表明(表3)，植株田間發(fā)病率、室內(nèi)病葉率、全葉病情指數(shù)、三葉病情指數(shù)和室內(nèi)病情指數(shù)相互之間呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，尤其是三葉法病情指數(shù)和全葉法病情指數(shù)、室內(nèi)病情指數(shù)和全葉法病情指數(shù)以及室內(nèi)病情指數(shù)和三葉法病情指數(shù)的相關(guān)性系數(shù)分別高達0.924，0.976和0.925，充分說明這幾項指標能夠相互印證，從一定程度上真實準確地反映出了病害發(fā)生的實際情況。

表3 發(fā)病率、病葉率和病情指數(shù)的皮爾遜(Pearson)相關(guān)性分析Table 3 Pearson correlation analysis of disease incidence,infection leaves rate and disease index

3 討論

3.1 藜麥種質(zhì)對霜霉病的抗性

藜麥遺傳多樣性高，生態(tài)類型多樣，抗性變異大[35]，這為抗病性評價提供了先天基礎(chǔ)，國外的研究已得到證實。Kumar等[33]對引進的34份藜科種質(zhì)資源，包括7個野生型和27個不同來源的藜麥種質(zhì)資源在印度中東部田間自然感病條件下采用“兩點法”(Two-point method)進行了霜霉病抗性評價和篩選，7個野生型和4份藜麥資源‘PI 510532’‘CHEN 67/78’‘Ames 22158’和‘CHEN 7/81’表現(xiàn)為免疫/高抗。Colque-Little等[36]在3個獨立的溫室中對132個藜麥基因型(5個對照、21個栽培種和106份種質(zhì))材料通過接種病原菌開展了霜霉病抗性評價和表型鑒定，結(jié)果顯示對照品種C.album，Puno，基因庫種質(zhì)‘G41’‘G42’‘G76’‘G93’‘G96’和‘G112’抗性最高，而對照品種‘Vikinga’，栽培種‘CV13’和‘CV21’及種質(zhì)‘G4’‘G9’‘G57’‘G67’‘G82’‘G91’最易感病。本研究首次在本土環(huán)境條件下，對來自國內(nèi)外的50份藜麥種質(zhì)資源分別通過田間自然感病和室內(nèi)離體葉片接菌的方法進行了霜霉病抗性鑒定和評價，結(jié)果顯示其發(fā)病率和病情指數(shù)表現(xiàn)出較大的變化(發(fā)病率13.30%～100.00%，病情指數(shù)1.00～100.00)；50份材料中無免疫品種，絕大多數(shù)表現(xiàn)高感，‘臺灣紅藜’表現(xiàn)高抗，‘QA064’表現(xiàn)抗病，‘隴藜2號’和‘HL-Q5’表現(xiàn)中抗，這進一步證實藜麥霜霉菌侵染程度的高度變異和藜麥種質(zhì)抗性存在明顯差異[22,33,35]。藜麥霜霉病病原菌P.variabilis屬卵菌(Oomycetes)，有性生殖是卵配生殖(Oogamous)，存在異宗配合(Heterothallic)現(xiàn)象[37]，可促進菌群的進化和變異，產(chǎn)生許多新的毒力基因[38]。而在此試驗中，我們盡量保持了相同單一菌株，然而，由于毒力基因的分化，同一藜麥材料可能對不同霜霉病菌株的抗性存在差異，在今后的研究中需要關(guān)注這一問題。

本研究中表現(xiàn)高抗的‘臺灣紅藜’(C.formosanum)是臺灣土著假谷物作物[10]，與藜麥(C.quinoa)同屬莧科藜屬，兩者的生物學特性非常相似[39]，其營養(yǎng)價值非常接近。我國藜麥產(chǎn)學研相關(guān)人員通常將臺灣紅藜列為藜麥的一個品種[32]。本研究首次發(fā)現(xiàn)了作為藜麥近緣種的‘臺灣紅藜’能夠被P.variabilis侵染。‘臺灣紅藜’生育期長，植株高大，生物量多，是作為飼草型藜麥的首選。表現(xiàn)中抗的‘隴藜2號’是由甘肅省農(nóng)業(yè)科學院畜草與綠色農(nóng)業(yè)研究所選育的糧飼兼用型品種，可在生產(chǎn)中直接應(yīng)用。該研究為藜麥霜霉病抗性基因的挖掘、利用及抗病機理的探究和防控奠定了基礎(chǔ)。

3.2 霜霉病抗性鑒定時期

藜麥霜霉病抗性鑒定時期至關(guān)重要，若過早，則病害未充分發(fā)生，真實抗性容易被掩蓋，若過遲，則病葉嚴重脫落，抗性不易觀察，因此，恰當?shù)臅r期能夠充分體現(xiàn)病害侵染最嚴重程度和最真實抗性。本研究在前期調(diào)查的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)藜麥霜霉病在盛花期發(fā)病最重，因此，選擇盛花期作為抗性鑒定的時期。這與人們普遍認為花芽分化期是藜麥種質(zhì)資源霜霉病抗性鑒定最重要和關(guān)鍵時期[33]基本吻合。藜麥的霜霉病抗性與其生育期密切相關(guān)，一般來說晚熟比早熟品種更具抗性[40]。通常情況下，早熟品種會在霜霉病肆虐前成熟，從而逃避了侵染，表現(xiàn)出“假抗性”[41]。高抗材料‘臺灣紅藜’屬晚熟品種，生育期高達170 d，明顯高于其他材料。Kumar等[33]篩選的免疫品種中，除‘CHEN 67/78’(119 d)外，其余‘PI 510532’(158 d)、‘CHEN 7/81’(134 d)和‘Ames 22158’(131 d)均是晚熟品種。

3.3 霜霉病抗性鑒定方法

目前，尚無統(tǒng)一有效和可重復(fù)的藜麥霜霉病嚴重度測定方法[20,33]?？煽康脑u價方法對病害流行病學研究、產(chǎn)量損失評估、致病性和毒力測定及種質(zhì)資源抗性鑒定至關(guān)重要[20]。本研究采用田間和室內(nèi)離體葉片鑒定相結(jié)合的方法進行評價，結(jié)果顯示田間發(fā)病率和室內(nèi)病葉率、田間病情指數(shù)(“全葉法”和“三葉法”)和室內(nèi)病情指數(shù)非常接近，相關(guān)性系數(shù)分別為0.660，0.976和0.925，表現(xiàn)出極顯著的正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)(表3)。50份材料抗性鑒定結(jié)果基本一致，除‘QA064’田間鑒定為高抗，而室內(nèi)鑒定為抗病，‘高臺02’田間鑒定為感病，室內(nèi)鑒定為高感，‘青海-02’田間鑒定為高感，室內(nèi)鑒定為感病外，其余材料完全一致，這種差異可能是由于室內(nèi)鑒定法接菌量大，材料離體抗病性弱[42]及田間自然感病鑒定受諸多因素影響[43]所致。一般而言，田間評價不會十分準確，因為寄主基因型×病原菌基因型×環(huán)境(G×G×E)的互作效應(yīng)在大田中無法控制，包括田間條件、寄主、小氣候溫濕度、菌株毒力和孢子分布等因素都對抗性鑒定產(chǎn)生影響[41]。此外，病原菌侵染的癥狀受葉片組織的位置和葉齡的影響[44]，可能產(chǎn)生誘導(dǎo)性抗性，這種抗性不僅發(fā)生在初始侵染位置，而且也發(fā)生在末梢和未侵染的部分[45]。而離體葉片鑒定技術(shù)的溫濕度可控，接種量分布均勻，被認為是實驗室評估霜霉病抗性最可靠的方法[20]，總之，離體葉片鑒定法是一種霜霉病抗性評價的理想方法。

本研究采用了傳統(tǒng)的“全葉法”和“三葉法”調(diào)查病害嚴重度，計算病情指數(shù)，結(jié)果顯示兩種測定方法的病情指數(shù)非常近似，且呈極顯著性正相關(guān)(r=0.92)(P<0.01)，這充分說明兩種方法均可靠可行，但是，由于藜麥植株高大，葉片數(shù)量多，“全葉法”測定工作量大，尤其是在田間對大批量種質(zhì)資源抗性的評價。而“三葉法”因只對單葉進行嚴重度評估而具有簡便、快捷的優(yōu)點，其結(jié)果的可比較性和重復(fù)性好，且其也是預(yù)測霜霉病產(chǎn)量損失的最佳方法[20]。由此可見，“三葉法”在霜霉病抗性鑒定和產(chǎn)量損失評價等方面具有簡便、快捷和可靠的特點，應(yīng)成為田間霜霉病抗性研究的首選方法。

4 結(jié)論

本研究表明藜麥種質(zhì)對霜霉病的抗性存在明顯差異，藜麥及其近緣種中存在豐富的抗性材料；首次發(fā)現(xiàn)‘臺灣紅藜’能被P.variabilis侵染，但其表現(xiàn)高抗，藜麥材料‘QA064’表現(xiàn)抗病，‘隴藜2號’和‘HL-Q5’表現(xiàn)中抗；進一步證實田間藜麥霜霉病抗性鑒定采用“三葉法”在藜麥盛花期進行效果較好，相比而言，室內(nèi)離體葉片接菌鑒定技術(shù)更具優(yōu)勢。