封育對不同草地類型土壤細菌群落特征的影響

姜安靜， 董乙強,2,3*， 阿斯太肯·居力海提， 周時杰， 聶婷婷， 李彩英， 席 偉， 安沙舟,2,3

(1.新疆農業(yè)大學草業(yè)學院， 新疆 烏魯木齊 830052； 2.新疆草地資源與生態(tài)重點實驗室， 新疆 烏魯木齊 830052； 3.西部干旱荒漠區(qū)草地資源與生態(tài)教育部重點實驗室， 新疆 烏魯木齊 830052)

新疆草地具有分布面積廣、資源豐富等特點，同時在涵養(yǎng)水源、防風固沙和保護生物多樣性等方面均扮演著重要角色，更影響著地方畜牧業(yè)的發(fā)展。近年來，由于頻繁的人為干擾和惡劣的氣候條件，新疆部分草地呈不同程度的退化狀態(tài)[1]。草地退化不僅影響當地社會的發(fā)展，且對當地以及周邊地區(qū)生態(tài)安全也造成一定程度的威脅，退化草地生態(tài)系統(tǒng)的改良與恢復已成為亟待解決的問題之一。

封育是恢復退化草原的有效途徑之一，也因其投資少、見效快，在世界各國被廣泛應用[2]。目前關于封育對草地植物特征[3]、土壤特性[4]和微生物多樣性[5]等方面已經做了大量的研究。研究表明封育可以提高植物的生物量，改善土壤理化性質，同時還可以通過改變養(yǎng)分的利用效率來改變土壤微生物群落結構和多樣性[6]。土壤微生物群落是草地生態(tài)系統(tǒng)的關鍵驅動力，也是土壤物質循環(huán)的主要調節(jié)因子[7]，其群落結構以及多樣性對環(huán)境變化具有高度敏感性[8]。因此，加強關于土壤微生物群落特征的研究可以有效了解封育效果，對草地恢復具有重要意義。其中，土壤微生物總量的90%是由細菌和真菌組成，土壤細菌更是作為全球最為豐富的菌種資源在生物地球化學循環(huán)過程中扮演重要角色，不僅對植物生長和生物產量產生重要影響，還在土壤碳循環(huán)等過程中發(fā)揮關鍵作用[9]。然而，目前關于封育對土壤細菌群落特征影響的研究結果仍然存在較大的爭議。如有研究表明高寒草地封育4 a后降低了厚壁菌門相對豐度，提高了變形菌門和酸桿菌門的相對豐度，并提高細菌Chao 1指數[10]；同時，也有研究表明，圍欄封育11 a后高寒草甸草地土壤中變形菌門、芽單胞菌門和綠彎菌門相對豐度升高，而酸桿菌門、浮霉菌門和疣微菌門相對豐富度降低，細菌α多樣性變化不顯著，細菌群落受土壤全氮和速效磷影響較大[11]；但有研究表明，封育4～7 a增加了荒漠草地酸桿菌門相對豐度，降低了變形菌門的相對豐度，且土壤容重和全磷含量是影響細菌群落的主要因素[12]。造成這種差異的原因與草地類型、封育年限、氣候不同等具有較大的關系。關于不同草地類型土壤細菌群落特征對封育的響應亟需進一步深入系統(tǒng)研究。

基于以上認識，本研究依托新疆天山北坡西段山地草甸草地和溫性草原草地國家級固定監(jiān)測點，通過對封育區(qū)和放牧區(qū)土壤細菌群落特征的測定分析，闡明封育對土壤細菌群落結構和多樣性的影響，揭示不同草地類型土壤細菌群落特征對封育的響應差異，并結合植物和土壤理化性質，探討不同草地類型細菌群落特征的影響因素，以期為草地合理利用和退化草地恢復改良提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)分別位于新疆博爾塔拉蒙古自治州博樂市(山地草甸草地)和溫泉縣(溫性草原草地)的國家級固定監(jiān)測點，博樂市國家級固定監(jiān)測點年均氣溫1.1℃，年均降水量400 mm，春季氣溫冷暖多變，夏季高溫，氣候炎熱，伴有干熱風，秋季氣爽，主要優(yōu)勢種有天山羽衣草(Alchemillatianschanica)和禾草、雜類草等。溫泉縣國家級固定監(jiān)測點年均氣溫3.6℃，年均降水210 mm，春秋季節(jié)特點不明顯，夏季不炎熱，秋季降溫迅速，主要優(yōu)勢種有針茅(Stipacapillata)、冷蒿(Artemisiafrigida)、博洛塔絹蒿(Seriphidiumborotalense)、羊茅(Festucaovina)等。研究區(qū)的具體位置及基本狀況見表1。

表1 研究區(qū)的地理位置及其基本情況Table 1 Description of the study sites

1.2 試驗設計

在山地草甸(Mountain meadow，MM)草地和溫性草原(Temperate steppe，TS)草地分別設置兩個處理，即封育區(qū)(Grazing exclusion plots，GE)和自由放牧區(qū)(Freely grazing plots，FG)。封育區(qū)均從2012年設置圍欄，于2021年取樣已封育10 a，圍欄封育前屬于輕度退化草地，圍欄封育區(qū)面積均為3.33×104m2，且圍欄封育前后狀態(tài)在植物組成、群落特征及地形地貌上基本相似。研究區(qū)2021年植物群落特征和土壤理化性質狀況如表2和表3所列。

表2 植物群落特征狀況Table 2 Characteristics of vegetation community

表3 土壤理化性質狀況Table 3 Physical and chemical properties of soil

1.3 野外取樣

1.3.1草地群落特征調查方法 2021年7月進行野外植物和土壤樣品的采集，在封育區(qū)和自由放牧區(qū)分別布置3條樣帶，樣帶間的間距50 m，于每條樣帶上分別設置3個1 m×1 m的樣方，樣方間距在50 m左右，樣方數量共計36個樣方(2個試驗樣地×2個處理/試驗樣地×3條樣帶/處理×3個樣方/樣帶)。首先記錄各樣方中的物種種類，并分種進行蓋度、高度、密度及生物量的測定。其中，物種蓋度(%)采用針刺法測定；高度(cm)采用常規(guī)方法測量自然高度；密度(株·m-2)為直接計數法記錄株叢數；生物量(g·m-2)采用齊地刈割法，并帶回實驗室置于烘箱105℃下殺青30 min后80℃烘干24 h至恒重后稱重。

1.3.2土壤取樣與測定方法 土壤樣品采用土鉆法，在測完草地群落特征的樣方內，用土鉆按土層深度0～5 cm，5～10 cm分層取樣，并將每條樣線分別均勻混勻后放入做好標簽的密封袋中，帶回實驗室。將其中一部分置于4℃冰箱冷藏保存，剩余部分在室內撿出植物根系、石礫等雜物后自然風干，并將土樣磨碎、混勻，然后分別過1 mm，0.25 mm篩貯存以備土壤樣品的室內分析。土壤pH值使用pH計法；土壤電導率采用電導儀測定(水土比為5∶1)；土壤含水量采用105℃，24 h烘干稱重法；土壤容重采用環(huán)刀法。土壤有機碳采用重鉻酸鉀外加熱法。

1.3.3土壤微生物采集及分析方法 在測完草地群落特征的樣方內，按0～5 cm，5～10 cm土層采集土壤微生物樣品，每條樣線分別均勻混合后裝入密封袋中置于車載冰箱(-20℃)中帶回實驗室。土壤微生物群落結構和多樣性研究步驟為：(1)采用NanoDrop微量分光光度計測定核酸OD值，采用瓊脂糖凝膠電檢測DNA提取質量，采用Qubit熒光定量檢測每一個樣品的DNA濃度，而后計算樣品DNA總量；(2)以細菌16S rRNA基因的V3～V4可變區(qū)序列為靶標，以帶有barcode序列的338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)-806R(5′-GGA CTACHVGGGTWTCTA AT-3′)為引物，進行PCR擴增，獲取PCR產物。通過熱循環(huán)條件進行PCR擴增：98℃預變性2 min，98℃變性15 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，72℃終延伸5 min。將PCR擴增產物進行熒光定量；(3)PCR產物經過定量及文庫構建后，利用Illumina MiSeq PE 300平臺進行高通量測序，獲取細菌可變區(qū)堿基序列信息；(4)利用QIIME2.0軟件包，對測序片段進行OTU(分類學操作單元)聚類，OTU代表序列與Silva數據庫進行比對分析，獲取OTU對應的分類單元(包括門綱目科屬種)及其相應的豐度信息；(5)計算Chao 1，Shannon-Wiener和Simpson等度量指數；(6)綜合應用ANOVA方差分析等方法尋找各組樣品中的特征菌，為深入挖掘菌群的功能、剖析作用機制做鋪墊。本研究的微生物測序分析均在深圳微科盟科技集團有限公司生科云平臺完成。

1.4 數據分析

采用Excel 2019對數據進行預處理，使用SPSS 25軟件獨立樣本T檢驗對同種草地類型同一土層不同處理的細菌群落結構和多樣性進行顯著性分析，同時也對同種草地類型不同土層和不同處理間的細菌多樣性進行顯著性分析，利用SPSS 25軟件齊性檢驗，再用Origin 2021進行繪圖。數據用“均值±標準誤”的形式表示。

2 結果與分析

2.1 封育對不同草地類型土壤細菌群落組成的影響

在山地草甸草地對不同土層細菌門水平相對豐度分析表明(圖1)。0～10 cm土層中，有9個主要菌門，其相對豐度在封育前后均超過1%，為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)和泉古菌門(Crenarchaeota)，其相對豐度合計占總體97.64%～98.16%，其中變形菌門相對豐度最高，均超過29.61%，為山地草甸土壤細菌優(yōu)勢類群。不同菌門對封育的響應不同，表現為相對豐度增加的細菌數目要大于相對豐度減少的細菌數目，與放牧區(qū)相比，封育后0～10 cm土層酸桿菌門和綠彎菌門相對豐度分別顯著增加16.30%～17.16%和34.59%～35.14%(P<0.05)，其中變形菌門在0～5 cm土層顯著增加1.88%，但在5～10 cm土層顯著降低4.20%(P<0.05)。

在溫性草原草地放牧區(qū)和封育區(qū)0～10 cm土層主要菌門分別為放線菌門、酸桿菌門、變形菌門、擬桿菌門、疣微菌門、芽單胞菌門、綠彎菌門和泉古菌門(圖2)，其相對豐度范圍依次為25.49%～32.17%，20.00%～21.61%，18.08%～20.67%，5.64%～11.38%，6.01%～7.61%，5.38%～7.25%，4.84%～6.18%和1.19%～1.70%，這8個主要菌門豐度和達96.27%～97.24%，其中放線菌門為優(yōu)勢菌門。封育后溫性草原草地菌門豐度增加的細菌數量要少于細菌減少的數量，相比于放牧區(qū)，封育區(qū)變形菌門相對豐度顯著增加5.95%～6.16%(P<0.05)，其余菌門雖有一定幅度的增減但變化均不顯著。

圖2 封育對溫性草原草地不同土層在細菌門水平相對豐度的影響Fig.2 Effects of grazing exclusion on relative abundance of phylum in different soil layers of warm steppe

2.2 封育對不同草地類型土壤細菌α多樣性的影響

由圖3a～3d可知，與放牧區(qū)相比，封育后山地草甸草地0～5 cm土層Chao 1指數、Shannon-Wiener指數和Simpson指數均呈極顯著增加9.53%，3.25%和0.08%(P<0.01)，OTUs顯著增加9.68%(P<0.05)，在5～10 cm土層細菌α多樣性指標均分別極顯著增加16.30%，16.24%，4.74%和0.15%(P<0.01)。不同土層放牧區(qū)和封育區(qū)相比，封育區(qū)細菌α多樣性之間差異不顯著，而放牧區(qū)不同土層細菌多樣性相比差異顯著(P<0.05)。

圖3 封育對山地草甸草地不同土層土壤細菌α多樣性的影響Fig.3 Effects of grazing exclusion on soil bacterial α diversity in different soil layers of mountain meadow注：**表示同一土層不同處理間差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示不同土層不同處理間差異顯著(P<0.05)，相同小寫字母表示不同土層不同處理間差異不顯著(P>0.05)Note:**It indicates that the difference between different treatments of the same soil layer is extremely significant at the 0.01 level,different lowercase letters indicate significant difference between different soil layers and different treatments at the 0.05 level,the same lowercase letters indicate that there is no significant difference between different soil layers and different treatments at the 0.05 level

不同草地類型土壤細菌α多樣性對封育的響應不一致(圖4a～4d)。在溫性草原草地0～10 cm土層圍欄封育后均無顯著變化，且不同土層放牧區(qū)和封育區(qū)相比較差異也均不顯著。

圖4 封育對溫性草原草地不同土層土壤細菌α多樣性的影響Fig.4 Effects of grazing exclusion on soil bacterial α diversity in different soil layers of warm steppe

2.3 植物特征和土壤特性對不同草地類型封育前后土壤細菌群落組成的影響

對山地草甸草地0～5 cm土層冗余分析可得，第一、二軸累計解釋率分別為29.62%和21.97%，5～10 cm土層一、二軸解釋率略微升高，分別為29.80%和22.19%(圖5)。在0～5 cm土層影響細菌群落的主要環(huán)境因子有7個，其中植物蓋度、土壤含水量、土壤有機碳和植物Patrick指數是驅動放牧區(qū)細菌群落變化的主要環(huán)境因子，pH值、電導率和土壤容重是驅動封育區(qū)細菌群落變化的主要環(huán)境因子。隨著土層深度的增加，驅動放牧區(qū)細菌群落變化的主要環(huán)境因子減少(植物Patrick指數和植物蓋度)。

圖5 山地草甸草地不同土層細菌組成與環(huán)境因子的冗余分析Fig.5 Redundancy analysis of bacterial composition and environmental factors in different soil layers of mountain meadow grassland注：H，植物Shannon-Wiener指數；S，植物Patrick指數；SOC，土壤有機碳；SM，土壤含水量；AGB，地上生物量；EC，電導率；BD，容重；Coverage，植物蓋度。下同Note:H,Shannon-Wiener index of plants;S,Plant Patrick index;SOC,Soil organic carbon;SM,Soil moisture;AGB,Aboveground biomass;EC,Electrical conductivity;BD,Bulk density;Coverage,Plant coverage.The same as below

在溫性草原草地0～10 cm土層，通過RDA分析表明第一、二軸解釋率分別為25.68%，21.70%，27.57%和21.82%(圖6)，影響其0～5 cm土層細菌群落的主要環(huán)境因子有電導率、土壤含水量、容重、植物Patrick指數、植物蓋度和土壤pH值，其中封育區(qū)細菌群落與電導率和植物蓋度呈正相關，與土壤含水量呈負相關。在5～10 cm土層，地上生物量變成驅動封育區(qū)細菌群落變化的主要環(huán)境因子，隨著土層深度增加，土壤含水量和植物Patrick指數不再是驅動放牧區(qū)細菌群落變化的主要因子。

圖6 溫性草原草地不同土層細菌組成與環(huán)境因子的冗余分析Fig.6 Redundancy analysis of bacterial composition and environmental factors in different soil layers of warm steppe

3 討論

3.1 不同草地類型土壤細菌群落組成對封育的響應

3.2 不同草地類型土壤細菌多樣性對封育的響應

土壤微生物多樣性是表征微生物群落穩(wěn)定性的重要指標，對充分反映土壤環(huán)境對微生物群落的影響以及評估草地生態(tài)系統(tǒng)的健康狀況有著重要意義[19]。本研究結果表明，對山地草甸草地實施封育措施后，顯著增加了細菌Chao 1指數、Shannon-Wiener指數和Simpson指數(P<0.01)，這與楊鵬年等[20]對高寒草甸草地研究封育提高土壤細菌Chao 1指數和Shannon-Wiener指數研究結果一致，但與尹亞麗等[11]對高寒草甸草地研究得出土壤細菌多樣性在放牧區(qū)和封育區(qū)變化不顯著的研究不一致。造成這種結果的原因：(1)封育增加了地上植物的數量和種類，提高草地植物覆蓋度和生物量進而使凋落物量和根系密度增加，這進一步改善了土壤孔隙和結構及其有機質含量，從而更有利于養(yǎng)分的循環(huán)來增加土壤細菌多樣性[21]；(2)可能是由于圍欄封育消除家畜踐踏和人類活動等外界干擾，促進草地群落自然恢復，改善了土壤理化性質，增加其微生物組成和群落結構，從而提高土壤細菌多樣性[22]。另外，對于溫性草原草地研究發(fā)現，封育對細菌α多樣性影響不顯著，這與張攀[23]對天山北坡溫性草原草地的研究結果一致。整體來看，山地草甸草地和溫性草原草地對封育的響應結果不同，究其原因可能是水熱條件的不同，導致土壤生境的變化，從而使草地細菌α多樣性對封育的響應結果不一致[24]?？傊?，封育有利于山地草甸草地土壤細菌多樣性的增加，但對溫性草原草地影響并不大。

3.3 植物特征和土壤特性對不同草地類型封育前后土壤細菌群落組成的影響

植物多樣性以及土壤特性會影響土壤微生物群落特征[25]，但微生物種類不同，其因環(huán)境變化所作出反應也不同。真菌比細菌更依賴碳源和氮源，在演替過程中沒有較好的生境時，需不斷積累有機質，在前10 a真菌群落組成變化不明顯，因此細菌演替速度快于真菌[26]。同樣，細菌因環(huán)境的改變有較強的反應，可以較快表征土壤健康狀況，從而可以反映出10 a圍欄封育后草地的恢復程度。大量研究表明，土壤pH值是影響細菌群落的主要環(huán)境因子[27-30]，這與本文研究pH值與山地草甸草地封育區(qū)細菌群落呈正相關的結果一致，究其原因可能是pH值偏離中性，使其環(huán)境對微生物群落產生脅迫壓力[31]，限制細菌的生長和生存，從而影響細菌群落組成。同時有學者研究表明，土壤電導率一定程度上可表征土壤pH值和養(yǎng)分狀況[32-33]，封育區(qū)土壤電導率是驅動山地草甸和溫性草原草地細菌群落組成的主要環(huán)境因素，土壤電導率升高，一定程度上加強土壤養(yǎng)分的轉化[34]，從而促進細菌相對豐度升高，進一步得出細菌組成對圍欄封育有較好響應，封育一定程度上對退化草地的恢復有促進作用。

4 結論

從細菌相對豐度來看，封育顯著增加山地草甸草地0～5 cm土層變形菌門，0～10 cm土層酸桿菌門和綠彎菌門相對豐度(P<0.05)；同時顯著增加溫性草原草地0～10 cm土層變形菌門相對豐度(P<0.05)，表明封育對兩種草地類型土壤細菌組成均有促進作用。從細菌α多樣性來看，封育極顯著提高山地草甸草地細菌α多樣性(除0～5 cm土層OTUs數目)(P<0.01)；但對溫性草原草地細菌α多樣性無顯著影響。冗余分析表明，山地草甸草地封育區(qū)細菌群落組成的主要驅動因子為pH值、電導率和土壤容重；而溫性草原草地封育區(qū)細菌群落組成的主要驅動因子為地上生物量、電導率和植物蓋度。