黃鐵礦和谷氨酸對砷酸鹽生菜毒性的調(diào)控研究

溫婧玉，唐鑫，翁靚嫻，穆莉，劉瀟威，趙玉杰，戴禮洪

（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全環(huán)境因子控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市農(nóng)業(yè)環(huán)境與農(nóng)產(chǎn)品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300191）

環(huán)境中過量的砷（As）會損害植物生長，并可通過食物鏈威脅人類健康。好氧環(huán)境是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中植物生長的常見環(huán)境，其中As主要以砷酸鹽形式存在，研究表明As對非抗性植物具有明顯的脅迫作用[1]。植物As中毒后會表現(xiàn)出葉片數(shù)量減少、萎黃、壞死，植物衰老和落葉等形態(tài)變化，As不僅可使植物養(yǎng)分吸收受限、葉綠素降解以及生物量和產(chǎn)量減少，還會導(dǎo)致活性氧（ROS）過度產(chǎn)生和碳水化合物、蛋白質(zhì)、DNA的合成受損等[2]。植物可通過多種機(jī)制增強(qiáng)對As的抗性，如合成金屬結(jié)合蛋白，通過特定轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或區(qū)隔化作用降低重金屬毒性，以及通過內(nèi)部酶促及非酶促反應(yīng)系統(tǒng)清除造成細(xì)胞損傷的ROS[3]。近期研究表明，通過添加外源物質(zhì)可增強(qiáng)植物自身抗逆性并降低有毒物質(zhì)的積累，如水楊酸[4]、腐植酸（HA或FA）[5]、脯氨酸[6]、硅[7]和磷[8]的外源供應(yīng)均可以通過減少有毒物質(zhì)的吸收及ROS產(chǎn)生、增加抗氧化酶活性及葉綠素濃度、加快生長等機(jī)制減輕As脅迫導(dǎo)致的植物毒害。基于前期研究發(fā)現(xiàn)[5]，谷氨酸（Glu）作為植物面臨壓力環(huán)境時(shí)的信號分子，參與創(chuàng)傷反饋，對植物適應(yīng)非生物脅迫（如鹽、冷、熱和干旱）作出反應(yīng)，并轉(zhuǎn)導(dǎo)因局部刺激（非生物或生物脅迫）觸發(fā)的長距離信號。因此本研究通過添加谷氨酸，以期達(dá)到增強(qiáng)植物對As抗逆性的目的。

鐵的氧化還原過程顯著影響地下水和土壤環(huán)境中As的存在形態(tài)[9]，砷酸鹽As（Ⅴ）與硫化鐵礦物之間的相互作用通常會影響As在地球化學(xué)環(huán)境中的遷移和轉(zhuǎn)化，其中黃鐵礦（FeS2）是地球表面最常見的巖石形成礦物之一，其對As有較強(qiáng)的親和性。在自然界還原性的沉積物或土壤中，鐵硫化物[包括馬基諾礦（FeS）和黃鐵礦]對As固定起重要作用[10]。FeS-As（Ⅴ）共沉淀在酸性環(huán)境中對As（Ⅴ）的固持能力較大，且易與Fe位點(diǎn)結(jié)合[11]。黃鐵礦在As（Ⅴ）環(huán)境中被氧化，其表面形成Fe（Ⅲ）氧化物，同時(shí)氧化S（2-Ⅱ）并釋放Fe（Ⅱ）[12]。黃鐵礦釋放S（-Ⅱ）和Fe（Ⅱ）離子均會促使As沉淀，氧化形成的Fe（Ⅲ）和環(huán)境中的As（Ⅴ）在黃鐵礦表面反應(yīng)形成無定形砷酸鐵，最終轉(zhuǎn)化為結(jié)晶性的臭蔥石[13]，增強(qiáng)了As在酸性條件下的穩(wěn)定性。黃鐵礦表面的官能團(tuán)和活性氧會通過形成等化學(xué)鍵，對As的存在狀態(tài)及吸附產(chǎn)生影響[14]。目前溶解性鐵離子與As的相互作用研究主要集中在鐵（氫）氧化物對As的吸附上，但近年來，許多研究表明黃鐵礦可以從水中去除包括As在內(nèi)的各種有機(jī)和無機(jī)污染物[15]。黃鐵礦能影響As和有機(jī)物的環(huán)境行為，特別是溶解性有機(jī)物（DOM），其可通過金屬陽離子橋與As形成絡(luò)合物（As-Fe-DOM三元絡(luò)合物）[16]。基于此，本研究以天然黃鐵礦為研究對象，考察其對As存在狀態(tài)及對植物As積累造成的影響，并在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察其與谷氨酸組合處理對As植物毒性的調(diào)控作用。

本研究選取谷氨酸作為外源添加有機(jī)物，采用球磨天然黃鐵礦，研究兩者單獨(dú)及組合處理對As植物毒性的調(diào)控作用?？疾炝伺囵B(yǎng)液中黃鐵礦與As之間的相互作用關(guān)系及有機(jī)小分子添加對其造成的影響。通過比較各處理組植物可食部As積累、植物生長發(fā)育和生理生化變化、植物營養(yǎng)元素變化等，闡明黃鐵礦等自然要素及外源小分子對植物As脅迫的調(diào)控作用，以期為As生態(tài)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評估及污染事故應(yīng)急處理提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和處理方法

選擇意大利生菜（Lactuca sativavar.capitalata）作為研究對象。種子用75%酒精消毒3 min，超純水漂洗3次，超純水浸泡30 min。采用蛭石培育種子至4～5片真葉階段，然后將幼苗轉(zhuǎn)移到Hoagland溶液培養(yǎng)10 d，培養(yǎng)液配制及培養(yǎng)條件采用本課題組前期的研究方法[17]。每天光照（350 μmol·m-2·s-1）時(shí)間設(shè)置為14 h。最終選擇均勻的個(gè)體進(jìn)行As（Ⅴ）暴露實(shí)驗(yàn)，暴露時(shí)間分別為10、20、30、40、50 d。Hoagland溶液體積為100 mL，每10 d更換一次。

為研究黃鐵礦和谷氨酸對生菜As脅迫的影響，未暴露于As（Ⅴ）的植株作為空白對照組（CK），4個(gè)處理組分別為五價(jià)As（Ⅴ）、五價(jià)As+黃鐵礦（V-P）、五價(jià)As+谷氨酸鹽（V-G）、五價(jià)As+黃鐵礦+谷氨酸鹽（V-PG），每種處理分別設(shè)置3個(gè)重復(fù)。As（Ⅴ）標(biāo)準(zhǔn)溶液由上海安譜（O2Si）提供，添加濃度為10 mg·L-1，該濃度根據(jù)前期研究選取，在該濃度下生菜對外源物質(zhì)較敏感[5，17]。為進(jìn)一步比較不同處理對As脅迫的調(diào)控作用，首先考察黃鐵礦和谷氨酸（C5H9NO4，Sigma-Aldrich，CAS：56-86-0）對溶液和生菜中As形態(tài)的影響。為了避免對植物造成額外的負(fù)面影響，黃鐵礦顆粒添加量為2 mg（黃鐵礦與As的質(zhì)量比為2∶1）[13]，谷氨酸鹽的濃度為10 mg·L-1[18]，超聲混合。使用的天然黃鐵礦（直徑0.153～0.483 cm）由Alfa Aesar（美國）提供，采用球磨的方式快速減小黃鐵礦粒徑、均一化顆粒尺寸[14]，用球磨機(jī)在300 r·min-1下球磨4 h（干磨法，3個(gè)研磨球，一個(gè)直徑5 mm，兩個(gè)直徑20 mm），球磨后顆粒的平均粒徑為13.58 μm（直徑3.84～39.02 μm）。

為考察不同生長期生菜生長情況，分別收取第10、20、30、40、50天的生菜葉片，用蒸餾水沖洗后測量生菜的葉質(zhì)量和葉綠素水平。其中葉綠素水平采用便攜式葉綠素儀（SPAD-502，Minolta Camera，Osaka，日本）測定，葉綠素水平用SPAD（Soil and plant analyzer development）值表示。

1.2 黃鐵礦顆粒的表征

將添加黃鐵礦的培養(yǎng)液[含As（V）]用10 000 r·min-1離心10 min，去掉上清液保留沉淀物，用超純水清洗沉淀物并離心3次，最后將沉淀物冷凍干燥，獲得反應(yīng)后的黃鐵礦顆粒。采用TESCAN MIRA4掃描電鏡-能量色散光譜（SEM-EDS）對黃鐵礦顆粒表面形貌和元素分布進(jìn)行表征。X射線光電子能譜（XPS）采用X射線光電子能譜儀（美國ThermoFischer，ESCALAB 250Xi）測試，儀器配備Al ka射線（hv=1 486.6 eV），在真空（4×10-7Pa）和14.6 kV電壓下工作，獲得了Fe2p、S2p、O1s和As3d的窄掃描光譜（20次掃描），并以C1s=284.8 eV結(jié)合能為能量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行荷電校正。XPS的數(shù)據(jù)分析參考數(shù)據(jù)庫（NIST X-ray Photoelectron Spectroscopy Database）。

1.3 As總量和營養(yǎng)元素的測定

收集生菜葉片并用超純水沖洗。稱取新鮮樣品0.5 g，營養(yǎng)元素及As測定的前處理采用王琦等[17]的方法。培養(yǎng)液經(jīng)適當(dāng)稀釋后直接上機(jī)測定。采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS，Agilent7700）分析砷（As）、鈣（Ca）、銅（Cu）、鐵（Fe）、鉀（K）、鎂（Mg）、錳（Mn）、鉬（Mo）、鈉（Na）和鋅（Zn）的濃度。每個(gè)分析批次包含至少一個(gè)試劑空白和兩個(gè)參考材料，如GBW（E）100348和GBW10049（GSB-27）。

1.4 As形態(tài)的測定

分別收取各處理組的生菜葉片，每份稱取0.5 g，將樣品加液氮研磨后加入10 mL提取劑（2 mmol·L-1磷酸氫二銨和0.2 mmol·L-1乙二胺四乙酸二鈉），250 r·min-1振蕩20 min，10 000 r·min-1離心5 min，上清液經(jīng)0.45 μm水系濾膜過濾后上機(jī)測定。使用與電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用的高效液相色譜法（HPLCICP-MS，Agilent Technologies 7700 Series，美國）對葉中的As無機(jī)形態(tài)進(jìn)行分析，具體方法及質(zhì)量控制參考王琦等[17]的方法，用無機(jī)As濃度表示As對植物的毒害程度。

1.5 生菜營養(yǎng)指標(biāo)和抗氧化系統(tǒng)活性的測定

按照維生素C（建成科技）、纖維素（Solarbio）、蛋白質(zhì)濃度（格銳思生物）試劑盒的步驟測定第50天時(shí)生菜葉片的品質(zhì)指標(biāo)。植物丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性采用南京建成科技公司提供的試劑盒測定。用MDA值判斷植物細(xì)胞受自由基迫害的程度，用SOD值表示植物清除氧自由基的能力。

1.6 數(shù)據(jù)處理

所有生菜實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)平行，結(jié)果以平均值和標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。使用IBM SPSS Statistics 24通過單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。統(tǒng)計(jì)顯著性用P值評估，P＜0.05被認(rèn)為具有差異顯著性。

2 結(jié)果與討論

2.1 黃鐵礦及谷氨酸對培養(yǎng)液中As存在狀態(tài)的影響

研究表明，溶解性有機(jī)物有降低植物As吸收的作用[5-6]。黃鐵礦通過吸附或共沉淀作用去除As[19]，有機(jī)物與As在環(huán)境中存在競爭吸附和絡(luò)合沉淀的相互作用[20]，從而可以減少生菜從培養(yǎng)液中吸收As。從圖1a至圖1c的黃鐵礦顆粒表面As元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可知，在添加As的生菜培養(yǎng)液中，V-PG礦物表面的As比重高于V-P和原始黃鐵礦。與V-P相比，V-PG的As分布主要集中在顆粒表面，可能是谷氨酸使As更穩(wěn)定地結(jié)合在了黃鐵礦表面。前期研究表明，植物根際產(chǎn)生的小分子酸釋放到溶液中會使溶液呈弱酸性（pH＜6.0），該條件會促進(jìn)As結(jié)合到礦物表面，因?yàn)樵谒嵝詶l件下，亞砷酸鹽[As（Ⅲ）]和砷酸鹽[As（Ⅴ）]對黃鐵礦表面都有很強(qiáng)的親和力[21]。在有氧環(huán)境中，As（Ⅴ）結(jié)合在黃鐵礦表面可形成砷酸鐵和黃鉀鐵礬氧化層[22]。圖1d和圖1e的XPS數(shù)據(jù)顯示，V-P和VPG的固體中出現(xiàn)了As2S5和表明溶液中的As可以與黃鐵礦結(jié)合，并與黃鐵礦中的硫形成基團(tuán)[23]。與已有研究中的Fe發(fā)揮主要作用不同，F(xiàn)e在本研究收集的固體中XPS的峰值較低（0.01%），而S起到了重要作用，近年有研究建議可以將S肥用于降低農(nóng)產(chǎn)品中的As毒性[24]。此外，As的遷移率與有機(jī)物的分子量有關(guān)，分子量越小，有機(jī)物與As之間的競爭吸附能力越小，從而使得更多的As保留在礦物表面。谷氨酸的低分子量（147 Da）維護(hù)了As在礦物表面的穩(wěn)定性，這種低As遷移率可能是由于抑制了礦物的氧化溶解，或通過表面絡(luò)合增強(qiáng)了Fe（Ⅲ）（氫氧）氧化物沉淀對As的吸附[18]，如圖1d中V-PG較明顯的的特征峰。從黃鐵礦顆粒的表征推斷，在弱酸性的生菜培養(yǎng)液中，As吸附或結(jié)合在黃鐵礦表面，谷氨酸的添加使得這種吸附或結(jié)合更加穩(wěn)定，更多的As（Ⅴ）保留在體外環(huán)境中，從而減少了As從植物根部進(jìn)入體內(nèi)的機(jī)會。

圖1 黃鐵礦表面As的質(zhì)量分?jǐn)?shù)SEM-EDS圖譜和As 3d、S 2p和O 1s的XPS圖譜Figure 1 The specific gravity of arsenic on the surface of pyrite from SEM-EDS and the As 3d，S 2p and O 1s XPS spectra of original pyrite and V-P，V-PG after 40 days

2.2 生菜葉片中As的累積變化規(guī)律

無機(jī)As對植物的毒性較有機(jī)As更強(qiáng)[25]，因此本研究主要研究了植物可食部的無機(jī)As含量。如圖2所示，第10天時(shí)，V-P、V-G、V-PG之間無機(jī)As濃度[As（Ⅲ）+As（Ⅴ）]差異較小，且均大于V；第20天時(shí)，外源添加物使無機(jī)As濃度低于V，而且黃鐵礦+谷氨酸鹽更有利于降低生菜葉片中的無機(jī)As含量，即無機(jī)As含量為V-PG＜V-G＜V-P；隨著植物生長，第30天和第40天葉片中積累的無機(jī)As含量低于第20天的含量。在第30天時(shí)，V-G和V-PG的無機(jī)As含量差異較小，且低于V和V-P。在第40天時(shí)，V-G和VPG的無機(jī)As含量均低于V和V-P，V-G和V-PG之間含量差異較小，V和V-P之間差異也較小。在20～40 d，生菜葉片中的As以As（Ⅲ）為主，通過比較發(fā)現(xiàn)V-PG比V-G的無機(jī)As濃度平均降低4.0%，比V-P平均降低35.9%。

如圖2所示的As總量[As（T）]，在植物轉(zhuǎn)移到染毒培養(yǎng)液的第10天，相比其他添加外源物的處理組，V中植物對As吸收較少，與上述無機(jī)As的結(jié)果一致。隨著植物的生長，從20～40 d，V-PG中的As含量低于V-P或V-G，說明黃鐵礦和谷氨酸同時(shí)存在有利于降低植物體內(nèi)的As含量，即V-PG＜V-G＜V-P。20～40 d間，V-PG比V-G的As（T）含量降低21.8%，比V-P降低16.9%。

含鐵礦物、有機(jī)物和As之間在水環(huán)境中通過氧化還原、絡(luò)合沉淀[20]和競爭吸附[26]作用減少As進(jìn)入植物體內(nèi)，若植物根部形成鐵膜還會阻礙進(jìn)入植物組織內(nèi)部的As向上轉(zhuǎn)運(yùn)[27]。如圖3所示，總As濃度在V的培養(yǎng)液中第10天到第30天平均剩余6.7 mg·L-1，添加黃鐵礦和谷氨酸后，培養(yǎng)液中總As濃度增加85.67%（V-PG），說明含鐵礦物和有機(jī)物對植物吸收As具有阻礙作用，這與在水稻和白骨壤中的研究現(xiàn)象一致[27]。該現(xiàn)象在固相表征中也得到證實(shí)，即培養(yǎng)液中黃鐵礦顆粒表面As的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加。同時(shí)，進(jìn)入植物根部的As（Ⅴ）也能通過自身代謝途徑外排到植物體外[28]。有研究表明番茄和水稻根不僅可直接排出As（Ⅴ），還可以迅速將植物體中的As（Ⅴ）還原為As（Ⅲ）進(jìn)行外排[29]。第30天培養(yǎng)液中的總As濃度在所有處理中相對較高，此時(shí)植物體內(nèi)As（T）含量最低。黃鐵礦和谷氨酸組合處理通過吸附等作用固定As以減少As向植物體內(nèi)遷移，從而有效降低葉片中As（T）及無機(jī)As積累，并通過轉(zhuǎn)化As形態(tài)而增強(qiáng)As的流動(dòng)性，進(jìn)而增強(qiáng)植物對As的抗脅迫能力。

2.3 生菜生長發(fā)育及抗氧化指標(biāo)的變化

由圖2中As（T）和無機(jī)As含量變化以及圖4a的葉質(zhì)量判斷得出，快速生長期為30～40 d。通過對不同處理組第30天和第40天的抗氧化指標(biāo)進(jìn)行比較，闡明黃鐵礦和谷氨酸抗氧化系統(tǒng)的調(diào)控作用。各處理組第30天SOD的值高于第40天（圖4b），葉片葉綠素含量在30～40 d持續(xù)上升（圖3c），第30天的MDA含量小于第40天（圖3d），以上說明30～40 d時(shí)植物清除氧自由基的能力最強(qiáng)，對As毒性的抗性最大。

圖2 生菜葉片中的As含量Figure 2 Arsenic concentration in lettuce leaves

圖3 培養(yǎng)液中總As濃度Figure 3 Total As concentration in Hoagland solution

植物暴露于無機(jī)As中會導(dǎo)致體內(nèi)產(chǎn)生過多的ROS[30]，抗氧化酶的合成有利于過量ROS的清除。SOD是用于清除植物體中ROS的重要抗氧化酶，其活性高低與酚類物質(zhì)代謝和植物抗性密切相關(guān)，可以反映特定環(huán)境下植物的適應(yīng)能力，其活性越高，植物對逆境的忍受能力越強(qiáng)。如圖4b所示，第30天時(shí)，V-P、V-G和V-PG的SOD值均大于V，且V-PG大于V-G和V-P，說明添加黃鐵礦和谷氨酸均有利于清除植物體內(nèi)因環(huán)境脅迫產(chǎn)生的自由基，使植物的抗性增強(qiáng)，且黃鐵礦和谷氨酸組合處理時(shí)植物對As脅迫表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗性。有研究表明外源添加氨基酸可以通過增強(qiáng)抗氧化酶的活性來抵抗環(huán)境中的重金屬毒害[31]。第40天的SOD值在不同處理之間的差異較小，說明隨著生長，植物對砷酸鹽的脅迫具有了一定的適應(yīng)性，體內(nèi)氧化還原反應(yīng)比前期減緩。植物細(xì)胞中的Fe-SOD主要存在于葉綠體中，如圖4c所示，20～30 d時(shí)的葉綠素含量保持上升，40～50 d時(shí)開始下降。添加黃鐵礦和谷氨酸有利于維持葉片中的葉綠素含量，并且抑制由As（Ⅴ）引起的葉綠素降解，表現(xiàn)為在10～50 d時(shí)，V-P、V-G和V-PG的葉綠素含量均高于V，相比V提高了17.1%～25.5%。有研究表明外源氨基酸的添加可緩解茄子幼苗中由As脅迫引起的葉綠素含量下降[6]。As脅迫會下調(diào)葉片中的谷氨酸[5]，并造成植物的谷氨酸激酶活性顯著降低[32]，外源谷氨酸緩解了由As（Ⅴ）脅迫引起的氧化應(yīng)激，提高了植物對砷酸鹽的抗逆性。由此推斷，黃鐵礦和谷氨酸是通過增加SOD的合成限制ROS在體內(nèi)的積累，并維持葉片中的葉綠素含量，從而在As（Ⅴ）脅迫時(shí)對葉綠體起到保護(hù)作用。

圖4 葉片濕質(zhì)量、超氧化物歧化酶活性、葉綠素和丙二醛含量Figure 4 Leaves wet weight，SOD，chlorophyll content and MDA

脂質(zhì)過氧化是As脅迫對植物代謝造成較強(qiáng)損傷的表現(xiàn)[33]。MDA是膜脂質(zhì)過氧化的最終分解產(chǎn)物，MDA在體外影響線粒體呼吸鏈復(fù)合物及線粒體內(nèi)關(guān)鍵酶，加劇膜損傷，其含量可以反映植物遭受逆境傷害的程度。As（Ⅴ）脅迫下，隨時(shí)間的延長，生菜的生長速率減緩，由圖4d可知30～40 d時(shí)MDA含量增加，呈損害程度加深的趨勢，但添加黃鐵礦（V-P、V-PG）呈現(xiàn)MDA含量降低的趨勢，說明黃鐵礦可緩解膜脂質(zhì)過氧化作用，在As（Ⅴ）脅迫時(shí)保護(hù)植物細(xì)胞膜，使得葉片的濕質(zhì)量相比V增加了20.8%～30.8%（圖4a，20～50 d的平均值）。第30天時(shí)，MDA含量為V-PG＜V-G＜V；第40天時(shí)，V-PG＜V-P＜V；V-P、V-PG在第30天時(shí)的SOD活性均大于V組。在V-P中第40天的MDA含量比第30天低；V-PG的MDA含量在第30天和第40天間差距較小且保持較低值，與CK的MDA含量最接近。在As脅迫下，植物體內(nèi)產(chǎn)生的谷氨酸優(yōu)先用于代謝途徑，增加植物螯合素的合成[32]。植物螯合素的產(chǎn)生對于抵抗As毒害具有重要意義，然而其可能會導(dǎo)致谷胱甘肽含量的消耗，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)[34]。從MDA的結(jié)果來看，外源谷氨酸減弱了生菜的氧化應(yīng)激反應(yīng)。綜上可知，添加谷氨酸的生菜在As（Ⅴ）誘導(dǎo)時(shí)可分泌更多的SOD，黃鐵礦可減少脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，兩者組合添加可以更有效地增強(qiáng)植物對As積累的耐受性。

2.4 生菜中營養(yǎng)元素的變化

黃鐵礦和谷氨酸通過增加營養(yǎng)元素吸收來提高生菜對As（Ⅴ）的耐受性。由于第10天處于初期暴露階段，各組的葉質(zhì)量較?。▓D4a），組內(nèi)誤差較大；第50天各組葉片萎黃，葉綠素值較低（圖4c），生菜處于生長的穩(wěn)定期，營養(yǎng)指標(biāo)處于衰退階段。因此，本研究選取生長至第20天、第30天和第40天的生菜進(jìn)行礦物營養(yǎng)元素分析。如圖5所示，相對于CK的元素含量分析結(jié)果，在培養(yǎng)20 d后，暴露于As（Ⅴ）使得葉片中的Ca、Fe、Mg、Mn、Na含量顯著升高，Zn和Mo含量降低；Ca2+和Mg2+起到降低膜通透性的作用[35]，植物能通過調(diào)節(jié)膜通透性抵抗As毒性。在對水稻的研究中也有類似的結(jié)果[36]。V-PG顯著增加了葉片中K、Na和Fe的含量。由圖6可知，在第20天時(shí)，F(xiàn)e含量在V-PG中顯著提高（160.6%），比V-G高78.8%，比V-P高57.1%。Fe可構(gòu)成細(xì)胞色素，是過氧化物酶、過氧化氫酶的激活劑[35]，說明V-PG在第20天時(shí)的抗氧化活性提高。在As（Ⅴ）脅迫的基礎(chǔ)上，添加黃鐵礦和谷氨酸（V-P和V-G）對生長20 d的礦物營養(yǎng)元素影響相對減弱，生菜自身對毒性的應(yīng)激反應(yīng)減弱，可能是黃鐵礦和谷氨酸使As（Ⅴ）毒性相對減弱，與抗氧化指標(biāo)的結(jié)果一致。隨著植株對環(huán)境適應(yīng)性增強(qiáng)，V與CK之間的差異性相對減小。培養(yǎng)30 d后，相對CK，添加As（Ⅴ）使得葉片中的Ca、Fe含量顯著升高。V-P的Ca、Fe含量升高但不顯著，可能是黃鐵礦使植株適應(yīng)環(huán)境的速度變快，V-PG在第20天即出現(xiàn)了營養(yǎng)元素含量的顯著差異，在同時(shí)期的5組中表現(xiàn)出最高的Fe含量（圖6）。第40天，各組與CK的營養(yǎng)元素含量差異不顯著。黃鐵礦和谷氨酸通過增加葉片中營養(yǎng)元素含量來緩解As（Ⅴ）毒性，加快植物對As的適應(yīng)，單獨(dú)谷氨酸對營養(yǎng)元素的吸收影響不顯著。

圖5 葉片中的營養(yǎng)元素相對含量變化（相對CK）Figure 5 Changes in relative contents of nutrient elements in leaves（compared with CK）

圖6 葉片中的Fe含量Figure 6 The Fe content in leaves

如圖5所示，相比V的植株，生長20 d后，V-P和V-PG提高了V中的Zn和Mo含量，ORTAS等[37]的研究也表明黃鐵礦可以作為植物的Zn肥添加。V-G和V-PG相比V還增加了Cu的含量。第20天，V-PG提高了葉片中Zn、Mo、Cu和K的含量。第30天，V-PG的Cu含量高于V，V-P的Mo含量高于V。第40天，V-PG的Ca、Na含量高于V，V-P的Na、Mo、Mn含量比V提高，V-G的Fe含量大于V。在As（Ⅴ）脅迫時(shí)，谷氨酸對營養(yǎng)元素的吸收影響較小，黃鐵礦在20～40 d期間提高了Zn、Mo、Na、Mn的含量，黃鐵礦和谷氨酸組合在20～40 d增加了葉片中Zn、Mo、Cu、K、Ca和Na的含量。黃鐵礦在提高小麥必需微量營養(yǎng)素（Fe、Cu、Zn和Mn）方面也起到了促進(jìn)作用[38]。Fe、Cu和Mo等元素是許多酶的組成成分，Mn、Cu可以調(diào)節(jié)植物礦質(zhì)營養(yǎng)平衡，參與植物的光合作用，對改善品質(zhì)、提高產(chǎn)量及抗逆性有重要作用[39]。本研究表明，添加黃鐵礦在提高膜滲透、吸收更多養(yǎng)分供生長需求方面，比谷氨酸發(fā)揮了更多的促進(jìn)作用，并通過促進(jìn)元素吸收，增強(qiáng)了對As（Ⅴ）脅迫的抗逆性。

從CK和V對比得出的元素含量結(jié)果可知，受影響的元素中Mg、Mn、Cu和Fe均與葉綠體組成以及色素合成有關(guān)。在植物細(xì)胞中，微量營養(yǎng)元素金屬陽離子的主要匯是葉綠體和線粒體（葉綠體中存在50%的Cu和80%的Fe[35]）。隨植物生長，添加黃鐵礦和谷氨酸組葉綠素水平高于V（圖4c）。綜上可以推斷，對于生菜生長，黃鐵礦起到促進(jìn)營養(yǎng)元素吸收的主要作用，而谷氨酸的影響不顯著；相比單獨(dú)添加黃鐵礦，黃鐵礦和谷氨酸組合可使生菜更快吸收營養(yǎng)元素，從而加快植物對As（Ⅴ）環(huán)境的適應(yīng)，增加植物葉片生物量，抑制由As（Ⅴ）引起的葉綠素降解。

2.5 黃鐵礦與谷氨酸對生菜品質(zhì)的影響

由圖7a可知，生菜的VC含量在V與V-PG中顯著提升，V-P、V-G與CK的差異較小；V-PG的VC含量與V-G和V-P相比，分別增加42.5%和69.3%。由圖7b可知，V-P的纖維素含量最低，而V-PG的纖維素含量與V-G、CK、V-P相 比 分 別 提 高21.2%、168.3%、374.6%。谷氨酸和黃鐵礦組合處理比單獨(dú)谷氨酸處理使植物纖維素的合成明顯增強(qiáng)。如圖7c所示，植物體中蛋白質(zhì)含量之間關(guān)系為V＞CK，V-PG＞V-P＞V-G。V-PG的蛋白質(zhì)含量與V-G及V-P相比分別提高了71.4%和21.4%。黃鐵礦和谷氨酸的添加有利于纖維素的合成，As（Ⅴ）刺激了葉片中蛋白質(zhì)的合成，添加黃鐵礦有利于改善谷氨酸單獨(dú)處理組蛋白質(zhì)含量較低的現(xiàn)象。此外，MDA可以與蛋白質(zhì)、核苷反應(yīng)，松馳纖維素分子間的橋鍵，或抑制蛋白質(zhì)的合成[40]。因此As過量會降低纖維素含量并改變植物組織結(jié)構(gòu)，特別是對多年生的植物有顯著影響[41]。組合處理能降低植物對MDA的積累，從而減少其對纖維素和蛋白質(zhì)合成的損傷。在植物生長的30～40 d，V-PG的MDA含量與V-G和V-P相比分別降低35.2%和36.6%。在暴露于As（Ⅴ）的50 d后，黃鐵礦和谷氨酸維持葉片中的VC含量，刺激纖維素和蛋白質(zhì)的合成與積累，黃鐵礦和谷氨酸組合有利于改善二者單獨(dú)添加時(shí)生菜的品質(zhì)，對提高生菜VC和纖維素水平有重要意義。

圖7 第50天時(shí)的生菜葉片品質(zhì)Figure 7 Quality of lettuce leaves at day 50

3 結(jié)論

（2）黃鐵礦和谷氨酸處理可以促進(jìn)生菜對營養(yǎng)元素的吸收，尤其對Mg、Mn、Cu和Fe元素的吸收作用明顯增強(qiáng)；提高生菜對As（Ⅴ）的適應(yīng)性，并有效增加了生菜葉片的生物量，緩解了As（Ⅴ）引起的生菜中葉綠素的降解。

（3）與單獨(dú)谷氨酸或黃鐵礦處理相比，二者組合處理提高了生菜維生素C、纖維素和蛋白質(zhì)含量，使植物的營養(yǎng)品質(zhì)得到明顯改善。