中藥治療輸卵管炎性不孕癥的用藥規(guī)律及潛在作用機(jī)制▲

林曉琴 唐冬艷 周海燕 李衛(wèi)紅

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)1 研究生學(xué)院，2 護(hù)理學(xué)院，廣西南寧市 530001)

近年來(lái)，不孕癥的發(fā)生率呈逐年增高趨勢(shì)，其中輸卵管因素占女性繼發(fā)性不孕病因的30%～50%，以慢性輸卵管炎為主[1]。輸卵管炎性不孕癥是指受淋病奈瑟菌、結(jié)核桿菌、衣原體等病原體感染，宮腔、腹腔內(nèi)手術(shù)操作等頻繁刺激，輸卵管黏膜損傷進(jìn)而引起粘連、閉鎖、堵塞、積水、積膿等，輸卵管結(jié)構(gòu)和功能破壞導(dǎo)致的不孕[2]。古籍中無(wú)輸卵管炎性不孕癥的病名，根據(jù)其癥狀和體征，可歸屬于“不孕”“婦人腹痛”“癥瘕”等范疇。為了改善妊娠結(jié)局，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)多采用經(jīng)期抗炎、藥物通液、選擇性輸卵管造影及復(fù)通術(shù)、宮腹腔手術(shù)等多種方式促使輸卵管再通及蠕動(dòng)功能恢復(fù)，這些治療方法常能快速起效，復(fù)通率高，但常存在輸卵管炎癥反復(fù)、輸卵管再阻塞、妊娠率低等問(wèn)題[2-4]。中醫(yī)學(xué)遵循辨證論治原則，善于運(yùn)用內(nèi)服、外敷、灌腸或針灸等方式改善輸卵管微環(huán)境，恢復(fù)其功能，具有療效確切、無(wú)創(chuàng)傷、痛苦小等優(yōu)點(diǎn)[5]。因此，本研究通過(guò)梳理近30年中藥復(fù)方治療輸卵管炎性不孕癥的臨床研究文獻(xiàn)，總結(jié)其用藥規(guī)律，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法從藥物的作用靶點(diǎn)等方面挖掘藥物治療輸卵管炎性不孕癥的潛在作用機(jī)制，以期為輸卵管炎性不孕癥的臨床用藥提供參考依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源及檢索方式 檢索中國(guó)知網(wǎng)、萬(wàn)方、維普三大數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的中醫(yī)藥治療輸卵管炎性不孕的相關(guān)文獻(xiàn)，檢索時(shí)間為1990年1月至2020年12月。檢索方式：選擇“高級(jí)檢索”，以“輸卵管炎”“不孕癥”“輸卵管炎性不孕癥”“中醫(yī)”“中藥”“中醫(yī)藥”等為主題詞進(jìn)行檢索，對(duì)檢索出的文獻(xiàn)以人工篩查的方式嚴(yán)格按照納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。

1.2 文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)明確診斷為輸卵管炎性不孕者；(2)文獻(xiàn)干預(yù)措施主要采用內(nèi)治法，同時(shí)聯(lián)合西藥、灌腸、針灸、理療等治療方法；(3)文獻(xiàn)信息完整，具有明確的藥物組成和詳細(xì)劑量；(4)收錄處方均為中醫(yī)內(nèi)服湯藥；(5)試驗(yàn)結(jié)果提示療效明確；(6)重復(fù)使用同一中藥處方的文獻(xiàn)以1篇計(jì)；(7)隨癥加減藥物的處方僅納入主方(基本方)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)僅描述方名而未羅列藥物組成和劑量的文獻(xiàn)；(2)會(huì)議論文、學(xué)位論文、文獻(xiàn)綜述、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等文獻(xiàn)。

1.3 中藥名稱的規(guī)范化處理 參照2015版《中華人民共和國(guó)藥典》[6]及《中藥學(xué)》[7]，對(duì)藥材名稱及因炮制或加工方法不同等導(dǎo)致的差異進(jìn)行規(guī)范處理，例如“元胡”統(tǒng)一為“延胡索”，“仙靈脾”統(tǒng)一為“淫羊藿”，“忍冬藤”統(tǒng)一為“銀花藤”等。

1.4 數(shù)據(jù)錄入與核對(duì) 利用Excel建立“輸卵管炎性不孕癥處方用藥”數(shù)據(jù)庫(kù)，采用二分類變量形式，對(duì)文獻(xiàn)中出現(xiàn)的中藥賦值為1，沒(méi)有出現(xiàn)的中藥賦值為0，并進(jìn)行藥物頻次分析、高頻藥物的藥效頻次和性味歸經(jīng)頻次分析，為確保錄入處方用藥信息準(zhǔn)確無(wú)誤，由雙人錄入并交叉檢查。采用SPSS Clementine 12.0軟件中的Apriori算法建模，建立“數(shù)據(jù)源→類型→Apriori→網(wǎng)絡(luò)”的關(guān)聯(lián)規(guī)則數(shù)據(jù)流，根據(jù)支持度和置信度，對(duì)高頻藥物進(jìn)行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析[8]。應(yīng)用SPSS 25.0對(duì)高頻藥物進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。

1.5 生物信息學(xué)分析 將組方規(guī)律分析得到的核心中藥配伍錄入到BATMAN-TCM系統(tǒng)(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)，設(shè)定預(yù)測(cè)目標(biāo)(候選目標(biāo))得分≥每個(gè)成分得分分界的20%，將“Adjust P-value”設(shè)為0.05，篩選出核心中藥配伍所含化學(xué)成分及其潛在作用靶點(diǎn)，并對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行疾病富集分析和信號(hào)通路分析[9]。

2 結(jié) 果

2.1 藥物頻次分析結(jié)果 共納入有效臨床處方138首，包含中藥168味，累計(jì)用藥頻次1 699次，使用頻次≥15次(高頻次)的中藥有34味，排名前10位的中藥依次為當(dāng)歸、赤芍、丹參、三棱、路路通、桃仁、莪術(shù)、香附、川芎、穿山甲，見(jiàn)表1。

表1 治療輸卵管炎性不孕癥的高頻次中藥

2.2 高頻藥物的藥效頻次 對(duì)34味高頻次藥物按中藥功效進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)，共得到有效數(shù)據(jù)1 240條(即34味中藥的總用藥頻次)，涉及的中藥類別主要有活血化瘀藥、清熱藥、補(bǔ)虛藥、行氣藥、祛風(fēng)濕舒經(jīng)活絡(luò)藥、解表藥、利濕藥，其中位居前3名的依次為活血化瘀藥、清熱藥、補(bǔ)虛藥，見(jiàn)表2。

表2 高頻藥物的藥效頻次統(tǒng)計(jì)

2.3 高頻藥物的性味歸經(jīng)頻次 對(duì)34味高頻藥物的性味歸經(jīng)頻次的分析結(jié)果顯示，藥物的藥性以寒性(493次)、溫性(392次)居多，藥味以苦味(790次)常見(jiàn)，其次為辛味(741次)，歸經(jīng)主歸肝經(jīng)(1 045次)、心經(jīng)(513次)。見(jiàn)圖1、圖2、圖3。

圖1 高頻藥物的四氣頻次分布

圖2 高頻藥物的五味頻次分布

圖3 高頻藥物的歸經(jīng)頻次分布

2.4 基于關(guān)聯(lián)規(guī)則的組方規(guī)律 運(yùn)用SPSS Clementine 12.0軟件對(duì)處方中34味高頻中藥通過(guò)Apriori 算法進(jìn)行建模，設(shè)置支持度>15%，置信度>80%，最大前項(xiàng)數(shù)為5，共得到17條藥物組合，其中4條為二階關(guān)聯(lián)藥物組合、13條為三階關(guān)聯(lián)藥物組合(見(jiàn)表3、表4)，并以網(wǎng)絡(luò)展示結(jié)果(見(jiàn)圖4)。規(guī)則組合的提升度越大表明關(guān)聯(lián)性越強(qiáng)[9]，所得藥物組合的提升度均>1，其中莪術(shù)→三棱藥對(duì)的支持度最高，說(shuō)明其為治療輸卵管炎性不孕癥的核心藥對(duì)。

表3 二階關(guān)聯(lián)藥物組合及其關(guān)聯(lián)規(guī)則

表4 三階關(guān)聯(lián)藥物組合及其關(guān)聯(lián)規(guī)則

圖4 高頻藥物的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)

2.5 高頻藥物的系統(tǒng)聚類分析結(jié)果 針對(duì)34味高頻藥物，利用SPSS 25.0軟件進(jìn)行R型聚類分析，輸出樹(shù)狀圖，見(jiàn)圖5。因聚類具有無(wú)監(jiān)督的特點(diǎn)，因此結(jié)合臨床將34味高頻中藥聚為7組核心組方較為合適，見(jiàn)表5。

圖5 高頻藥物的聚類分析樹(shù)狀圖

表5 聚類分析結(jié)果

2.6 核心藥物的作用機(jī)制

2.6.1 莪術(shù)→三棱核心藥對(duì)的疾病富集分析結(jié)果：在BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)中以“E Zhu”“San Leng”為關(guān)鍵詞，得到三棱、莪術(shù)有明確結(jié)構(gòu)信息的化學(xué)成分32種(對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)共1 131個(gè))，無(wú)結(jié)構(gòu)信息的化學(xué)成分17種(無(wú)作用靶點(diǎn))。通過(guò)對(duì)上述1 131個(gè)作用靶點(diǎn)進(jìn)行疾病富集，得出與三棱、莪術(shù)作用靶點(diǎn)相關(guān)的疾病共419種，其中潛在靶點(diǎn)>6個(gè)的疾病共24種，見(jiàn)表6。

表6 莪術(shù)→三棱核心藥對(duì)的疾病富集分析結(jié)果

2.6.2 莪術(shù)→三棱核心藥對(duì)的潛在作用信號(hào)通路：BATMAN-TCM 在線分析系統(tǒng)顯示，與三棱、莪術(shù)作用靶點(diǎn)相關(guān)的生物學(xué)通路共185條，其中潛在靶點(diǎn)數(shù)≥20個(gè)的通路有21條(見(jiàn)表7)，其中最有可能在治療輸卵管炎性不孕癥中發(fā)揮作用的信號(hào)通路是磷酸肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)、叉頭框O(forkhead box O,FOXO)、瞬時(shí)受體電位(transient receptor potential,TRP)信號(hào)通路。三棱、莪術(shù)的靶點(diǎn)-通路-疾病可視化網(wǎng)絡(luò)圖見(jiàn)圖6。

表7 KEGG信號(hào)通路分析

圖6 靶點(diǎn)-通路-疾病可視化網(wǎng)絡(luò)圖

3 討 論

近年來(lái)，輸卵管炎性不孕癥的發(fā)生率逐年增加，其作為不孕癥的主要類型，具有遷延難愈的特點(diǎn)，對(duì)育齡夫婦造成嚴(yán)重困擾?，F(xiàn)代多數(shù)中醫(yī)學(xué)者認(rèn)為本病病位在胞絡(luò)，病性為本虛標(biāo)實(shí)，致病因素不外乎濕、瘀、寒、熱，主要觀點(diǎn)有熱盛雍阻、濕熱瘀阻、寒濕瘀滯、痰濕瘀滯、氣滯血瘀、腎虛血瘀、氣虛血瘀[10]。盡管不同醫(yī)家在辨證分型和遣方用藥上各有側(cè)重，但無(wú)論病因?yàn)楹危潢P(guān)鍵病機(jī)離不開(kāi)“瘀”，當(dāng)以“活血化瘀”為主要治則。正如《神農(nóng)本草經(jīng)》云“無(wú)子者多系沖任瘀血,瘀血去自能有子也”，其認(rèn)為不孕多由瘀血內(nèi)停、損傷沖任所致，瘀血去則自能受孕[11]。辨證論治是中醫(yī)的基本特色，內(nèi)治以活血化瘀為主從而加速盆腔局部血流循環(huán)，再根據(jù)導(dǎo)致血瘀的因素，或佐以清熱解毒，或理氣行滯，或化痰祛濁等方藥，均可有良好療效。

本研究分析了中藥治療輸卵管炎性不孕癥的用藥規(guī)律，其中中藥頻次分析結(jié)果顯示，使用頻次較多的單藥為當(dāng)歸、赤芍、丹參、三棱、路路通，四氣以寒、溫為主，五味以苦、辛居多，歸經(jīng)主歸肝、心兩經(jīng)。寒性藥物可清熱、瀉火、解毒等；溫性藥物可溫經(jīng)、散寒、補(bǔ)陽(yáng)等。苦味具有泄、燥特性，辛味具有行、散特性，二者合用辛開(kāi)苦降，開(kāi)血?dú)庵艚Y(jié)，調(diào)暢氣血。從高頻中藥的藥效類別分析結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，活血化瘀藥、清熱藥、補(bǔ)虛藥、行氣藥最為常用，其中活血化瘀藥占比最大，根據(jù)“以藥測(cè)證”的原理，該結(jié)果也驗(yàn)證了輸卵管炎性不孕癥的本質(zhì)屬性為血瘀。這提示在輸卵管炎性不孕癥的臨床用藥上，可注重選用辛溫之三棱、莪術(shù)等活血化瘀之品，隨證輔以苦寒之赤芍、甘溫之黃芪、辛苦之香附等清熱、補(bǔ)虛、行氣等藥物，符合中醫(yī)祛邪不傷正、扶正不留邪的基本治法。

關(guān)聯(lián)規(guī)則分析結(jié)果顯示，藥對(duì)莪術(shù)→三棱出現(xiàn)的頻次最多，支持度最高，說(shuō)明其為治療輸卵管炎性不孕癥的最基本藥對(duì)，其次為川芎→當(dāng)歸。莪術(shù)→三棱是古今活血類方劑中的常用藥對(duì)，三棱善行氣中之滯，莪術(shù)善破血中之結(jié)，二藥配伍，行氣活血力宏，散瘀消癥功著。相關(guān)研究表明，三棱、莪術(shù)具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗血栓、降低血液黏稠度、改變血液流變學(xué)等作用[12-13]。和嵐等[14]的研究表明，三棱、莪術(shù)能有效改善血瘀證模型大鼠的血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)，改善大鼠機(jī)體高凝狀態(tài)，促進(jìn)血液循環(huán)。當(dāng)歸、川芎為活血化瘀類中藥，其中當(dāng)歸為血中之氣藥，功擅活血調(diào)經(jīng)、祛瘀止痛，配伍氣中之血藥川芎，可增強(qiáng)行氣活血、調(diào)經(jīng)止痛之功[15-16]?，F(xiàn)代藥理研究顯示，川芎、當(dāng)歸的活性成分具有舒張外周血管、改善微循環(huán)、下調(diào)血清腫瘤壞死因子α和C反應(yīng)蛋白等炎癥因子水平的作用[16]。本研究挖掘出的三階關(guān)聯(lián)藥物組合有莪術(shù)、丹參→三棱，川芎、赤芍→當(dāng)歸，以及川芎、香附→當(dāng)歸等，這些藥物組合的主要功效也以活血化瘀行氣為主。從藥物組合的特點(diǎn)看，活血化瘀仍是近現(xiàn)代醫(yī)家在治療輸卵管炎性不孕癥中最鮮明的共性。

系統(tǒng)聚類分析共得到7類(見(jiàn)表5)，其中聚類方1為乳香、沒(méi)藥、赤芍、薏苡仁、金銀花，方中薏苡仁走胃經(jīng)祛濕熱而利經(jīng)絡(luò)，金銀花清熱解毒，兼用活血化瘀藥乳香、沒(méi)藥、赤芍，共奏活血化瘀、清熱利濕之功，對(duì)于濕熱瘀阻型輸卵管炎性不孕癥可選用此方。聚類方2和3為膈下逐瘀湯合柴胡疏肝散加減，全方清熱藥、行氣藥、活血化瘀藥合用，共治郁熱、氣滯、血瘀之標(biāo)實(shí)，適用于熱毒熾盛、氣滯血瘀型患者。賈銳[17]發(fā)現(xiàn)，與單純采用輸卵管通液術(shù)治療相比，輸卵管通液術(shù)聯(lián)合膈下逐瘀湯加減可有效改善輸卵管炎性不孕癥患者的癥狀，提高輸卵管通暢率。胡喜姣等[18]研究發(fā)現(xiàn)，膈下逐瘀湯加減方可降低腫瘤壞死因子α、γ-干擾素的表達(dá)水平，抑制炎癥滲出、輸卵管粘連及纖維化，改善組織微循環(huán)，從而發(fā)揮治療輸卵管炎性不孕癥的作用。聚類方4以路路通、王不留行、穿山甲、皂角刺疏經(jīng)通絡(luò)、通滯消癥，三棱、莪術(shù)破血行氣，軟堅(jiān)散結(jié)，諸藥相配，行血滯而化瘀結(jié)，走厥陰而暢胞絡(luò)。聚類方5為桂枝茯苓丸加減，方中敗醬草、紅藤清熱解毒，桂枝、茯苓直入血分溫經(jīng)散瘀，丹參功擅祛瘀生新，活血而不傷正，牛膝性下行，長(zhǎng)于活血祛瘀，諸藥配伍而具有清熱解毒、活血化瘀之功，針對(duì)輸卵管炎性不孕熱盛雍阻之證。聚類方6和7為補(bǔ)陽(yáng)還五湯方加減，全方由補(bǔ)氣藥和多味活血藥配伍組成，共奏補(bǔ)氣活血通絡(luò)之功?！疤摗薄梆觥倍叱Ｏ嗷ゴ龠M(jìn)，因此臨床治療上應(yīng)根據(jù)“虛”“瘀”的程度遣方用藥，適用于病程日久、兼有血瘀之象的患者?，F(xiàn)代研究表明，補(bǔ)陽(yáng)還五湯可顯著降低氣虛血瘀型大鼠模型的血液黏度，抑制血小板聚集和抗血栓形成，改善血液濃、黏、凝、聚的瘀滯狀態(tài)[19]。

莪術(shù)→三棱為關(guān)聯(lián)規(guī)則分析中的高頻藥物組合，且支持度最高，因此本研究利用BATMAN-TCM 系統(tǒng)分析三棱、莪術(shù)治療輸卵管炎性不孕癥的潛在作用機(jī)制。結(jié)果顯示，在疾病富集結(jié)果中，炎癥、疼痛與輸卵管炎性不孕癥的關(guān)系最大；在所富集的相關(guān)信號(hào)通路中，最有可能在治療輸卵管炎性不孕癥中發(fā)揮作用的信號(hào)通路是PI3K/AKT、FOXO、TRP信號(hào)通路。其中，PI3K蛋白家族參與調(diào)控體內(nèi)細(xì)胞的增殖分化、凋亡及氧化應(yīng)激等過(guò)程，被認(rèn)為與炎性疾病、腫瘤、自身免疫性疾病等密切相關(guān)[20]。PI3K激活的同時(shí)，其下游信號(hào)通路上的核心蛋白AKT也被激活，AKT通過(guò)誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白、糖原合成酶激酶-3β、FOXO1等下游蛋白調(diào)控炎癥反應(yīng)，發(fā)揮免疫應(yīng)答及抗炎、抗凋亡的作用[21-23]。FOXO1是FOX家族的重要成員，近年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)表明FOXO1在炎癥反應(yīng)過(guò)程中扮演重要角色。張娜等[24]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，F(xiàn)OXO1參與了由脂多糖刺激巨噬細(xì)胞Ana-1引起的炎癥改變，上調(diào)炎癥因子腫瘤壞死因子α和白細(xì)胞介素6的釋放；FOXO1過(guò)表達(dá)時(shí)又可減輕炎癥反應(yīng)。TRP通道在炎性及疼痛疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。多項(xiàng)研究表明，TRP介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)與TRPV、TRPA、TRPM、TRPC有關(guān)，其中TRPV1通過(guò)結(jié)合T淋巴細(xì)胞，引起鈣內(nèi)流而激活T淋巴細(xì)胞；巨噬細(xì)胞FCγR激活可引起TRPV2表達(dá)的上調(diào)，TRPV2在脂筏中的聚集對(duì)細(xì)菌吞噬作用意義重大；TRPM7 在巨噬細(xì)胞活化中具有關(guān)鍵作用；TRPC6可動(dòng)員中性粒細(xì)胞，通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度、重塑肌動(dòng)蛋白的細(xì)胞骨架，進(jìn)而促進(jìn)巨噬細(xì)胞C-X-C基序趨化因子配體2和C-X-C基序趨化因子受體2介導(dǎo)的趨化反應(yīng)[25]。TPR介導(dǎo)的疼痛主要與離子通道上的TRPV1、TRPA1傷害感受器有關(guān)，TRPV1參與調(diào)控炎癥反應(yīng)中的痛覺(jué)過(guò)敏及神經(jīng)性疼痛：在小鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中敲除TRPA1或使用拮抗劑后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)寒冷刺激及機(jī)械疼痛的閾值上調(diào)[26-29]。

綜上所述，內(nèi)服中藥治療輸卵管炎性不孕癥主要以活血化瘀藥為主，并隨證配伍清熱、行氣、補(bǔ)虛等藥物，其中莪術(shù)→三棱藥對(duì)為核心中藥配伍；核心藥物配伍組合通過(guò)調(diào)控炎癥反應(yīng)和疼痛相關(guān)信號(hào)通路發(fā)揮治療作用。