基因缺失技術(shù)在動(dòng)物疫苗中的研究應(yīng)用進(jìn)展

劉海霞，王艷曉，王磊

（1.天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司 天津 300308；2.天津市農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)中心 天津 300402）

我國(guó)是畜禽養(yǎng)殖業(yè)大國(guó)，我國(guó)畜禽養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)模和數(shù)量均居全球首位，畜禽業(yè)為我們提供了豐富的畜產(chǎn)品。然而，動(dòng)物疫病如禽流感、非洲豬瘟等對(duì)畜禽養(yǎng)殖業(yè)有著毀滅性的打擊。同時(shí)，一些畜禽疫病還是人畜共患病，不僅危害畜牧業(yè)健康發(fā)展，還對(duì)人類公共衛(wèi)生事業(yè)造成極大隱患。動(dòng)物疫苗的發(fā)展極大地解決了動(dòng)物疫病對(duì)畜牧業(yè)的危害。

隨著基因組測(cè)序技術(shù)、蛋白質(zhì)組學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，基因缺失技術(shù)得到飛速發(fā)展。相較傳統(tǒng)疫苗如：滅活疫苗、減毒活疫苗等而言，運(yùn)用基因缺失技術(shù)研制的基因缺失疫苗有著可控、快速、高效等優(yōu)點(diǎn)。本文就基因缺失技術(shù)的概念、主要技術(shù)手段及動(dòng)物基因缺失疫苗研發(fā)及應(yīng)用等做一總結(jié)，以期對(duì)基因缺失疫苗的研究提供參考。

1 基因缺失技術(shù)的含義

1953 年DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)被發(fā)現(xiàn)，人類進(jìn)入分子生物學(xué)研究階段。經(jīng)過近70 年發(fā)展，已從研究DNA 中堿基序列排列規(guī)律發(fā)展到研究DNA 基因片段的遺傳密碼功能階段?；蛉笔Ъ夹g(shù)正是研究DNA 基因片段的技術(shù)，就是將細(xì)胞（細(xì)菌或病毒）內(nèi)的某些功能性基因片段通過DNA 同源或異源轉(zhuǎn)化、重組去掉，從而改變細(xì)胞（細(xì)菌或病毒）遺傳學(xué)特性的技術(shù)，它其實(shí)是基因工程技術(shù)中基因敲除技術(shù)的一個(gè)分支。

在動(dòng)物疫苗的研制和生產(chǎn)中，通過基因缺失技術(shù)敲除掉動(dòng)物疫病致病源（如：病毒等）DNA 序列中某些致病基因片段，構(gòu)建一個(gè)缺失這些致病基因的疫苗株，而保留致病源的傳染性，從而達(dá)到免疫疫病的作用。

2 基因缺失常用技術(shù)手段

CRISPR-Cas9 系統(tǒng)、TALEN 技術(shù)、ZFN 技術(shù)等基因缺失研究技術(shù)都是在近年發(fā)現(xiàn)DNA 基因片段特性的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。2020年，CRISPR-Cas9 基因編輯系統(tǒng)獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，在動(dòng)物疫苗的研發(fā)中已廣泛應(yīng)用。

2.1 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)

CRISPR-Cas9 系統(tǒng)是規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）及其相關(guān)蛋白（clustered regularly interspaced short palin dromic repeats-associated proteins，Cas）的簡(jiǎn)稱。

CRISPR-Cas9 系統(tǒng)是由兩種蛋白組合而成，該系統(tǒng)主要通過蛋白酶將目的DNA 位點(diǎn)切割，可以使DNA 雙鏈斷裂。當(dāng)同源序列存在時(shí)，斷裂DNA 區(qū)間可以直接進(jìn)行同源重組，進(jìn)而定點(diǎn)敲除目的基因。當(dāng)雙鏈斷裂端為非同源末端時(shí)，不同源序列可重新連接DNA 游離末端，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)基因敲除的目的，此種情況主要發(fā)生在真核生物。因此，CRISPR-Cas9 技術(shù)特點(diǎn)是通過不同的sgDNA 設(shè)計(jì)對(duì)基因進(jìn)行定點(diǎn)修飾，并且對(duì)同源和非同源DNA 均可以進(jìn)行基因缺失操作。它的主要優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、識(shí)別位點(diǎn)選擇多、試驗(yàn)周期較短、成本較低、快捷高效。

2.2 類轉(zhuǎn)錄激活子蛋白（TALEN）技術(shù)

TALEN 技術(shù)主要是由類轉(zhuǎn)錄激活子（Transcription activa tor-like effector，TALE）和DNA 內(nèi)切酶（FokⅠ）兩部分發(fā)揮作用。TALE 主要作用為識(shí)別并特異結(jié)合靶DNA，F(xiàn)okⅠ的主要作用為內(nèi)切酶切割TALE 識(shí)別的DNA 位點(diǎn)。TALE 由四部分組成，分別是：遷移域（Translocation domain，TD）、DNA 特異識(shí)別結(jié)合域、核定位域（Nuclear localization signal，NLS）和激活結(jié)構(gòu)域（Activation domain，AD）4 部分構(gòu)成。其中，TALE 中部DNA 特異識(shí)別結(jié)合域是由一系列數(shù)目不定的串聯(lián)重復(fù)氨基酸單元組成。每個(gè)重復(fù)單元只能識(shí)別1 個(gè)核苷酸。TALE 識(shí)別DNA 位點(diǎn)后，F(xiàn)okⅠ將DNA 鏈切割，通過基因敲除，將目標(biāo)基因缺失。TALEN 技術(shù)的發(fā)明使得基因敲除的效率明顯提高，因此，在小鼠、斑馬魚、擬南芥等基因工程研究熱門物種中得到廣泛應(yīng)用。

2.3 ZFN 技術(shù)

ZFN 由鋅指蛋白（ZFP）和DNA 內(nèi)切酶（FokⅠ）兩部分組成。該技術(shù)的原理是：ZFP 識(shí)別并特異結(jié)合目標(biāo)DNA 序列，F(xiàn)okⅠ切割目標(biāo)DNA。細(xì)胞再通過非同源類末端接合或同源重組等方式對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行修復(fù)，改變目標(biāo)DNA 序列，從而達(dá)到基因敲除的目的。ZFP 一般是由3～6 個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域串聯(lián)組成，多個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)的優(yōu)點(diǎn)在于可識(shí)別較長(zhǎng)的目標(biāo)DNA 序列，而發(fā)揮切割作用至少需要兩個(gè)FokⅠ形成的二聚體，在二聚體的中間切割DNA。

ZFN 是第一代人工DNA 內(nèi)切酶技術(shù)，與傳統(tǒng)的DNA 干擾技術(shù)相比，ZFN 技術(shù)提高了基因組的編輯效率，操作簡(jiǎn)單，可以快速敲除目的基因。

2.4 Cre/LoxP 系統(tǒng)/FLP-FRT 系統(tǒng)

Cre/LoxP 系統(tǒng)由大腸桿菌噬菌體的Cre 重組酶和LoxP 位點(diǎn)兩部分組成。Cre 重組酶蛋白可以切除同向重復(fù)的2 個(gè)LoxP 位點(diǎn)內(nèi)的DNA 片段。該系統(tǒng)的原理是：在Cre 基因啟動(dòng)子的誘導(dǎo)下，Cre 重組酶蛋白得以表達(dá)，進(jìn)而將LoxP 位點(diǎn)之間的基因切除。研究者可以通過對(duì)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)時(shí)間的控制，調(diào)節(jié)編碼Cre/LoxP 系統(tǒng)在轉(zhuǎn)移到動(dòng)物體內(nèi)后，再進(jìn)行識(shí)別動(dòng)物的組織細(xì)胞中LoxP 位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)控制該系統(tǒng)在正確的點(diǎn)位進(jìn)行基因敲除。

FLP-FRT 系統(tǒng)[FLP 重組酶-FLP 識(shí)別目標(biāo)（Flp recognition tar get，F(xiàn)RT）]的作用機(jī)理與Cre/loxP 系統(tǒng)的機(jī)理類似，F(xiàn)LP 也是位點(diǎn)特異的重組酶，再通過FRT 在FLP 識(shí)別位點(diǎn)對(duì)基因進(jìn)行切割再鏈接，使目標(biāo)基因得以缺失。與TALEN 技術(shù)和ZFN 技術(shù)相同，這些技術(shù)都需要特異性識(shí)別、切割蛋白系統(tǒng)。

2.5 Red 同源重組技術(shù)

Red 同源重組技術(shù)主要是在表達(dá)質(zhì)粒上來實(shí)現(xiàn)的。在表達(dá)質(zhì)粒上的含有Red 重組酶的exo、beta 和gam 這3 種基因，exo和beta 基因表達(dá)后形成兩種蛋白，它們偶聯(lián)結(jié)合形成復(fù)合物，特異性的識(shí)別外源基因并與之結(jié)合，與宿主細(xì)菌的染色體上的同源基因發(fā)生重組，而gam 的表達(dá)蛋白作用是抑制宿主細(xì)菌特異識(shí)別降解外源DNA，達(dá)到保護(hù)外源插入目的基因的目的。整合到宿主細(xì)菌后，質(zhì)粒再通過同源重組將帶有宿主DNA 的片段切除，達(dá)到基因缺失的目的。

3 基因缺失動(dòng)物疫苗研發(fā)及應(yīng)用

3.1 豬基因缺失疫苗的研發(fā)

豬是我國(guó)畜牧業(yè)最主要的養(yǎng)殖動(dòng)物。近年來，養(yǎng)豬業(yè)遭受非洲豬瘟（African swine fever，ASF）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、豬圓環(huán)病毒2（porcine circovirus type 2，PCV2）等致病微生物的侵襲，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大損失。目前，借助基因缺失技術(shù)研究豬用疫苗取得很多進(jìn)展。

張艷艷等將我國(guó)首例非洲豬瘟疫情中分離的流行毒株（SY18）作為親本株，運(yùn)用同源重組缺失技術(shù)篩選構(gòu)建了ASF 病毒中的免疫抑制（MGF）基因和（CD2V）基因缺失的非洲豬瘟病毒基因缺失疫苗候選株，試驗(yàn)結(jié)果顯示MGF 和CD2V 雙基因缺失株（ASF SY18ΔMGF／ΔCD2V）對(duì)豬安全，接種豬能夠100%抵抗親本強(qiáng)毒株SY18 株的攻擊，可以作為非洲豬瘟疫苗候選株。唐雯利用CRISPR/Cas9 技術(shù)結(jié)合同源重組技術(shù)對(duì)PCV2 和偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）的四個(gè)基因位點(diǎn)敲除后，找到TK-/gE-/gI-/Cap+重組偽狂犬病毒株，這為開發(fā)二聯(lián)PCV2/PRV二聯(lián)疫苗奠定了基礎(chǔ)。

3.2 家禽基因缺失疫苗的研發(fā)

家禽養(yǎng)殖周期短，蛋和肉產(chǎn)品是百姓餐桌上常見的食品。但是家禽的許多疾病具有傳播快、變異快的特點(diǎn)。而且多種禽流感病毒還是人畜共患病的致病因素，為預(yù)防增加了難度。家禽的基因缺失疫苗在多致病病源上都取得突破。

楊森等利用雞馬立克病病毒（MDV）在疫苗株和強(qiáng)毒株之間具有明顯的序列差異性這一特點(diǎn)。運(yùn)用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)，以MDV 疫苗株meq 基因?yàn)榘悬c(diǎn)，設(shè)計(jì)合成gRNA，克隆構(gòu)建pX459-gRNA 質(zhì)粒，成功構(gòu)建出1 株meq 基因缺失毒株（CVI988Δmeq-C7），為后續(xù)篩選和鑒定抗MDV 疫苗株奠定了基礎(chǔ)。Zou 等研制出一種同時(shí)對(duì)鴨腸炎病毒（DEV）、鴨坦布蘇病毒（DTMUV）和高致病性禽流感病毒（HPAIV）H5N1 均有效的新型疫苗，這項(xiàng)研究利用CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的基因編輯系統(tǒng)，高效地獲得了同時(shí)編碼HPAIV H5N1 血凝素（HA）基因和膜前蛋白（PrM）基因以及DTMUV 包膜糖蛋白（E）基因的DEV 重組蛋白。DEV 重組蛋白對(duì)H5N1 和DTMUV 均有較強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，對(duì)H5N1、DTMUV 和DEV 均有較強(qiáng)的保護(hù)作用。此項(xiàng)研究首次證明CRISPR/Cas9 系統(tǒng)能夠快速、高效地對(duì)DEV 基因組進(jìn)行改造，重組缺失病毒株可以作為一種潛在的鴨傳染性胃腸炎三價(jià)疫苗來預(yù)防H5N1、DTMUV 和DEV 感染。

3.3 牛、羊基因缺失疫苗的研發(fā)

牛皰疹病毒Ⅰ型（BHV-1）可引發(fā)牛傳染性鼻氣管炎，對(duì)養(yǎng)牛業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。穆艷霞應(yīng)用CRISPR/Cas9 基因編輯與同源重組技術(shù)，構(gòu)建帶有增強(qiáng)綠色熒光蛋白（enhanced green fluo rescent protein，EGFP）標(biāo)記并缺失E 糖蛋白（glycoprotein E，gE）的重組BHV-1 病毒（BHV-1 gE/EGFP）。這項(xiàng)研究探索了利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)進(jìn)行BHV-1 gE 基因的缺失編輯，為構(gòu)建高效的BHV-1 基因缺失毒株提供了一種思路，為今后基因缺失疫苗的研制提供依據(jù)。

羊傳染性膿皰（Contagious ecthyma，CE）是由羊傳染性膿皰病毒（Orf virus，ORFV）引起的一種急性人獸共患傳染病。周帥帥利用同源重組技術(shù)構(gòu)建ORFV-SY17 株122 基因缺失病毒株（OR FV-SY17△122），經(jīng)過驗(yàn)證基因缺失株的復(fù)制能力得到明顯削弱，為研發(fā)ORFV 疫苗提供理論基礎(chǔ)。

3.4 其它養(yǎng)殖動(dòng)物基因缺失疫苗的研發(fā)

水產(chǎn)養(yǎng)殖疫苗是近年新興的一類疫苗，區(qū)別于傳統(tǒng)的消毒劑和抗菌藥，可以減少水產(chǎn)品中的藥物殘留。殺魚愛德華氏菌（Ed wardsiella piscicida）是一種常見水生致病菌，它感染范圍廣，傳染能力強(qiáng)，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)行業(yè)危害巨大。周鵬運(yùn)用同源重組的基因敲除方法將該菌crp 基因敲除，獲得Δcrp 基因缺失株，試驗(yàn)表明crp 基因缺失菌毒力顯著下降，具有進(jìn)一步開發(fā)為減毒活疫苗的潛質(zhì)。

4 展望

基因缺失技術(shù)發(fā)展到今天已經(jīng)經(jīng)過三代，隨著科學(xué)家對(duì)各種生物體基因組特性的深入了解，必定會(huì)找到更加先進(jìn)的DNA 識(shí)別和酶切組合，目前應(yīng)用較多的是CRISPR-Cas9 系統(tǒng)，已經(jīng)在動(dòng)物疫苗的研究中廣泛應(yīng)用?；蛉笔?dòng)物疫苗與傳統(tǒng)的動(dòng)物疫苗相比，該項(xiàng)技術(shù)可以精確地將病原基因敲除，操作簡(jiǎn)便，成本較低?；蛉笔б呙缇哂忻庖邩?biāo)識(shí)，利用缺失的基因可以進(jìn)行野生型感染和疫苗免疫的診斷，已成為新型疫苗研究開發(fā)的主流。

但是，目前也有關(guān)于基因缺失疫苗返毒突變?yōu)閺?qiáng)毒株的報(bào)道，隨著基因缺失技術(shù)的不斷完善，基因缺失疫苗會(huì)成為研究新型動(dòng)物疫苗的有效手段之一。