COVID-19病毒N基因在昆蟲細(xì)胞內(nèi)的表達

宿 放，韓佃剛 ，葉玲玲 ，張 沖 ，尹尚蓮 ，羅倩敏 ，董仙蘭 ，李瑤瑤 ，李凌楓 ，艾 軍，信吉閣

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.昆明海關(guān)，云南 昆明 650200)

突發(fā)和再次暴發(fā)的傳染性疾病是公共衛(wèi)生系統(tǒng)面臨的全球性挑戰(zhàn)[1-2]。2019年12月底暴發(fā)的由新型冠狀病毒導(dǎo)致的新型冠狀病毒肺炎(Coronavirus disease 2019，COVID-19)是當(dāng)前全球關(guān)注的公共健康問題，嚴(yán)重威脅全球人類健康。新型冠狀病毒屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，因其外包膜突起顆粒形似冠狀而得名[3]。2020年2月12日，國際病毒分類委員會正式將新型冠狀病毒命名為嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型(SARS-CoV-2)[4]。SARS-CoV-2具有極強的傳染性，主要通過呼吸道飛沫和接觸傳播，也可經(jīng)消化道傳播，感染者可出現(xiàn)發(fā)熱、干咳、乏力、胸悶等癥狀，但也有無癥狀感染者[5]。

SARS-CoV-2是β屬單股正鏈RNA病毒，基因組序列約有29 kb，擁有10個基因，可有效編碼10個蛋白[6]。作為SARS-CoV-2基因同一條編碼鏈上5個典型的開放閱讀框(ORF)之一的核衣殼蛋白(Nucleocapsid gene，N gene，419 aa)，分子量接近46 ku[7-8]。N蛋白是一種高免疫原性蛋白，在感染過程中大量表達，與病毒基因組RNA相互纏繞形成病毒核衣殼，具有較高的保守性和RNA分子伴侶活性，在病毒復(fù)制過程中相比其他基因而言不易突變，同時在病毒RNA的合成過程中發(fā)揮著重要的作用[9-10]。作為真核表達系統(tǒng)的一員，昆蟲細(xì)胞表達系統(tǒng)有許多獨特的優(yōu)點，在眾多研究中被廣泛利用[11-14]。

新型冠狀病毒檢測方法的研究，對于此病的防控非常重要。本研究利用昆蟲表達系統(tǒng)表達外源蛋白更接近天然蛋白的特點，根據(jù)SARS-CoV-2病毒N蛋白在病毒感染過程中大量表達，可作為抗原和抗體檢測靶標(biāo)的特性，開展了SARS-CoV-2病毒N蛋白在昆蟲細(xì)胞上的表達研究。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗材料 包含目的片段的人工合成重組質(zhì)粒pUC57-COV19-N來自生工生物工程(上海)股份有限公司，E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞來自TaKaRa公司，E.coliDH10Bac、pFastBacTMHTB載體來自Thermo Fisher Scientific公司，Sf9昆蟲細(xì)胞為昆明海關(guān)技術(shù)中心動物檢疫實驗室保存。

1.1.2 試劑 高保真酶Primer STAR HS、PremixTaq酶、dATP、質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DNA Ligation Kit Ver.2.1、限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和XbaⅠ、T-Vector pMD19(simple)、牛血清白蛋白(BSA)來自TaKaRa公司；SOC培養(yǎng)基、10×TBST洗液、Cellfectin ReagentⅡ脂質(zhì)劑來自Thermo Fisher Scientific公司；Grace細(xì)胞培養(yǎng)基、卡那霉素(Kan)、四環(huán)素(Tet)、慶大霉素(Gen)、氨芐青霉素(Amp)來自Solarbio公司。

1.1.3 儀器 PCR儀來自美國Bio-Rad公司，高速臺式離心機來自德國Eppendorf公司，高速液體冷凍離心機來自日本HITACHI公司，超凈工作臺來自美國Termo Forma公司，凝膠成像系統(tǒng)來自美國基因公司，恒溫空氣搖床來自美國Life Sciences公司，電泳儀來自德國Pharmacia公司，細(xì)胞培養(yǎng)箱來自日本SAKURA公司，倒置顯微鏡來自德國萊卡公司，超低溫冰箱來自日本SANYO公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物合成 以pUC57-COV19-N為模板設(shè)計出一對PCR擴增引物，并根據(jù)pFastBacTMHTB載體序列和結(jié)構(gòu)特點選擇BamH Ⅰ和XbaⅠ作為酶切位點分別加至上、下游引物5′端(下劃線表示酶切位點)：COV19-N-F：5′-TGGGATCCATGTCTGATAATGGACC-3′(BamH Ⅰ);COV19-N-R：5′-CGTCTAGATTAGGCCTGAGTTGAGTC-3′(XbaⅠ)。

1.2.2 PCR擴增目的片段 使用高保真酶Primer STAR HS進行擴增，PCR反應(yīng)體系為：5×PrimeSTAR Buffer，10 μL；dNTP Mixture(2.5 mmol/L)，4 μL；COV19-N-F(10 μmol/L)，1 μL；COV19-N-R(10 μmol/L)，1 μL；COV19-N人工合成質(zhì)粒，2 μL；高保真酶Primer STAR HS(2.5 U/μL)，0.5 μL；ddH2O補足至50 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性10 s，50.7 ℃退火15 s，72 ℃延伸76 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸3 min。

1.2.3 PCR產(chǎn)物加A尾 以PCR回收產(chǎn)物為模板，50 μL PCR回收產(chǎn)物中加入3 μL dATP和0.5 μLTaq酶，72 ℃延伸30 min；電泳，凝膠回收加A尾的PCR產(chǎn)物。

1.2.4 目的片段與T-Vector pMD19(simple)載體的連接轉(zhuǎn)化 按照TaKaRa DNA連接試劑盒使用說明，取加A尾的PCR產(chǎn)物4 μL與1 μL T-Vector pMD19(simple)載體連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，PCR鑒定，獲得重組質(zhì)粒pMD19-T(simple)-COV19-N。

1.2.5 重組質(zhì)粒pMD19-T(simple)-COV19-N的雙酶切鑒定 往25 μL體系中加入1 μLBamH Ⅰ(15 U/μL)，1 μLXbaⅠ(15 U/μL)，1 μL 10×K Buffer，17 μL pMD19-T(simple)-COV19-N重組質(zhì)粒，37 ℃水浴酶切2 h；電泳，確定目的條帶符合大小后凝膠回收雙酶切產(chǎn)物。

1.2.6 重組質(zhì)粒pMD19-T(simple)-COV19-N的測序 將初步鑒定的pMD19-T(simple)-COV19-N重組質(zhì)粒送至昆明擎科技術(shù)有限公司進行測序。

1.2.7 重組桿粒DH10Bac-pFastBacTMHTB-COV19-N的構(gòu)建 用限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和XbaⅠ雙酶切pFastBacTMHTB載體(4 857 bp)和重組質(zhì)粒pMD19-T(simple)-COV19-N，然后將COV19-N基因連接入pFastBacTMHTB載體，轉(zhuǎn)化E.coliDH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)Gen、Kan和Tet 3種抗生素篩選，獲得重組桿粒DH10Bac-pFastBacTMHTB-COV19-N。

1.2.8 重組桿粒DH10Bac-pFastBacTMHTB-COV19-N鑒定 PCR體系為：5×PrimeSTAR Buffer，10 μL；dNTP Mixture(2.5 mmol/L)，4 μL；M13-F(10 μmol/L)，1.25 μL；M13-R(10 μmol/L)，1.25 μL；重組桿粒，2 μL；高保真酶Primer STAR HS(2.5 U/μL)，0.5 μL；ddH2O補足至50 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸5 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。電泳，觀察目的條帶位置確定重組桿粒成功構(gòu)建。

1.2.9 重組桿粒DH10Bac-pFastBacTMHTB-COV19-N的真核表達 復(fù)蘇Sf9昆蟲細(xì)胞，將生長良好的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至六孔板上，放入28 ℃無CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至約9×105個Sf9細(xì)胞/孔時取出六孔板進行試驗。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，在Cellfectin ReagentⅡ脂質(zhì)劑的介導(dǎo)下將重組桿粒DH10Bac-pFastBacTMHTB-COV19-N轉(zhuǎn)入Sf9昆蟲細(xì)胞中，同時設(shè)立GFP熒光蛋白對照組與空白對照組，在六孔板上培養(yǎng)約3 d后轉(zhuǎn)入長滿昆蟲細(xì)胞的25 cm2小瓶內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)96～120 h后凍融3次收集蛋白，加入適量含PMSF的細(xì)胞裂解液煮沸制樣并保存于-20 ℃。

1.2.10 重組桿粒DH10Bac-pFastBacTMHTB-COV19-N的蛋白鑒定 配制10%的分離膠與5%的濃縮膠，用制好的重組N蛋白、GFP蛋白進行SDS-PAGE試驗，分離膠設(shè)定電壓50 V，直至PageRuler 預(yù)染蛋白Marker剛開始分離時將電壓調(diào)至120 V，電泳1 h后取出凝膠并在150 V、350 mA的條件下于預(yù)冷泡沫箱中轉(zhuǎn)膜1 h。轉(zhuǎn)膜過程中使用的材料均提前用轉(zhuǎn)膜緩沖液浸泡，PVDF膜提前激活，轉(zhuǎn)膜完成后用含3% BSA的1×TBST溶液37 ℃封閉1 h。HRP-His標(biāo)記抗體用TBST稀釋1 000倍，4 ℃過夜孵育，次日取出并加入1×TBST于搖床上清洗3次，每次10 min。稱取50 mg DAB溶于100 mL 1×TBST中，加入50 μL 30% H2O2溶液立即染色并拍照觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pMD19-T(simple)-COV19-N的PCR鑒定

查閱資料已知N基因片段大小為1 260 bp，將重組質(zhì)粒pMD19-T(simple)-COV19-N進行PCR擴增獲得圖1結(jié)果，可以看出，1—4這4個泳道條帶大小約為1 260 bp，符合預(yù)期大小，表明目的片段被成功擴增，可以用于下一步試驗。

M.DL5000 DNA Marker；1—4. pMD19-T(simple)-COV19-N的PCR產(chǎn)物。M.DL5000 DNA Marker；1—4. PCR products of pMD19-T(simple)-COV19-N.

2.2 重組質(zhì)粒pMD19-T(simple)-COV19-N雙酶切鑒定

利用BamH Ⅰ和XbaⅠ對pMD19-T(simple)-COV19-N重組質(zhì)粒進行雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，從圖2中的1—4泳道可以觀察到每個泳道上均有2個條帶，6泳道條帶為T-Vector pMD19(simple)載體帶，大小約為2 692 bp，5泳道條帶為COV19-N條帶，大小約為1 260 bp；第5泳道為2.1中重組質(zhì)粒pMD19-T(simple)-COV19-N的PCR產(chǎn)物，由于其濃度較高，因此，電泳后與前4個泳道COV19-N條帶相比更亮，第6泳道為T-Vector pMD19(simple)空載體帶，由于同種質(zhì)粒會因為空間結(jié)構(gòu)不同而導(dǎo)致電泳速率發(fā)生變化，T-Vector pMD19(simple)空載體條帶電泳速率會高于雙酶切得到的T-Vector pMD19(simple)載體條帶的電泳速率，因此，該空載體目的條帶離點樣孔更遠。通過前4個泳道與5，6這2個泳道的對比結(jié)果可知雙酶切試驗成功，表明N基因與T-Vector pMD19(simple)載體成功連接，因此，可將樣品測序來做進一步鑒定。

M.DL5000 DNA Marker；1—4.pMD19-T(simple)-COV19-N雙酶切結(jié)果；5.pMD19-T(simple)-COV19-N的PCR產(chǎn)物對照；6.T-Vector pMD19(simple)空載體對照。

2.3 重組質(zhì)粒pMD19-T(simple)-COV19-N測序

得到測序結(jié)果與原人工合成序列進行比對，可知送出測樣的序列與原序列相同，表明在擴增過程中堿基未發(fā)生突變和錯漏等情況，可繼續(xù)進行重組桿粒的構(gòu)建。

2.4 重組桿粒DH10Bac-pFastBacTMHTB-COV19-N的PCR鑒定

從圖3可以看到，pFastBacTMHTB空載體經(jīng)過電泳后出現(xiàn)了3個條帶，離加樣孔最遠的條帶最亮、濃度最高，是因為環(huán)形載體空間中會出現(xiàn)扭轉(zhuǎn)彎曲等情況，導(dǎo)致出現(xiàn)不同的結(jié)構(gòu)，最亮的條帶為pFastBacTMHTB空載體的超螺旋結(jié)構(gòu)，超螺旋結(jié)構(gòu)的載體含量越高則做后續(xù)的連接試驗效率更高。利用M13引物對構(gòu)建的重組桿粒進行PCR鑒定會出現(xiàn)2個條帶，遠離加樣孔的條帶是使用pFastBacTMHT系列的pFastBacTMHTB載體時會出現(xiàn)的固有條帶(2 430 bp)，離加樣孔近的條帶大小是由固有條帶大小加上N基因大小(3 690 bp)，從圖4中可觀察到2條帶，與預(yù)期結(jié)果相同，表明重組質(zhì)粒pFastBacTMHTB-COV19-N轉(zhuǎn)入DH10Bac細(xì)胞后得到了重組桿粒，該重組桿粒能直接用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗。

M.DL5000 DNA Marker；1—2.pFastBacTMHTB空載體。M.DL5000 DNA Marker；1—2.pFastBacTMHTB empty vector.

M.DL5000 DNA Marker；1.M13引物PCR擴增重組桿粒。M.DL5000 DNA Marker；1.Amplification of recombinant bacmid by M13 primer PCR.

2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗結(jié)果

由于重組桿粒DH10Bac-pFastBacTMHTB-COV19-N在轉(zhuǎn)染過程中并不能通過直接觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果判定轉(zhuǎn)染成功，因此，在轉(zhuǎn)染時設(shè)立空白組和DH10Bac-pFastBacTMHTB-GFP熒光蛋白組作為對照組。重組GFP轉(zhuǎn)染對照試驗，發(fā)現(xiàn)重組GFP桿粒轉(zhuǎn)染六孔板內(nèi)的Sf9細(xì)胞確定重組桿粒的最佳轉(zhuǎn)染量為1.5 μg/孔；在試驗過程中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染6～12 h后即可觀察到對照組的熒光出現(xiàn)，說明轉(zhuǎn)染效率很高，再經(jīng)過3～5 d培養(yǎng)，可觀察到對照組出現(xiàn)大量熒光，且細(xì)胞生長較好，表明重組桿粒轉(zhuǎn)染成功。對于重組桿粒DH10Bac-pFastBacTMHTB-COV19-N也采取了以上同步的轉(zhuǎn)染策略。桿粒轉(zhuǎn)染六孔板120 h后，細(xì)胞轉(zhuǎn)移至長滿細(xì)胞的瓶內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，約5 d后將細(xì)胞凍融3次后收集，加入含PMSF的細(xì)胞裂解液并分裝保存，準(zhǔn)備用于蛋白鑒定試驗(圖5)。

A.DH10Bac-pFastBacTMHTB-GFP對照組(明視野)，約12 h，40×10；B. DH10Bac-pFastBacTMHTB-GFP對照組(暗視野)，約12 h，40×10；C.DH10Bac-pFastBacTMHTB-GFP對照組，120 h，40×10；D.DH10Bac-pFastBacTMHTB-COV19-N組，120 h，40×10。

2.6 SDS-PAGE和WB鑒定

用收集的DH10Bac-pFastBacTMHTB-COV19-N重組蛋白(約46 ku)與DH10Bac-pFastBacTMHTB-GFP熒光蛋白制樣并進行SDS-PAGE與WB試驗。從SDS-PAGE試驗結(jié)果中無法清楚地區(qū)分目的條帶(圖6)，分析原因可能是由于收集和制樣時未處理好蛋白樣品導(dǎo)致蛋白濃度低。由于pFastBacTMHTB載體末端存在6×His標(biāo)簽，因此，在轉(zhuǎn)膜后使用HRP-His標(biāo)記抗體來驗證重組桿粒是否順利表達，通過DAB法染色驗證蛋白成功在昆蟲細(xì)胞內(nèi)表達，重組N蛋白條帶顏色與GFP蛋白條帶相比較淺(圖7)，反映出GFP熒光蛋白表達量高于重組N蛋白，同時也說明重組桿?？梢栽诶ハx細(xì)胞內(nèi)高效表達，因此，后續(xù)試驗中可以繼續(xù)優(yōu)化試驗條件使DH10Bac-pFastBacTMHTB-COV19-N重組蛋白表達量提高。

N.PageRuler預(yù)染蛋白Marker；1.DH10Bac-pFastBacTMHTB-GFP熒光蛋白對照；2.DH10Bac-pFastBacTMHTB-COV19-N重組蛋白。圖7同。

圖7 轉(zhuǎn)膜后使用DAB染色法染色Fig.7 DAB staining after membrane transfer

3 結(jié)論與討論

面對嚴(yán)峻的疫情，在當(dāng)前疫防控工作中，對所有人員進行普篩檢查尤其是對無癥狀感染者的檢查是疫病篩查的重點，SARS-CoV-2 lgM/lgG快速檢測試劑卡是一種快速判斷是否是無癥狀感染者的一種重要血清學(xué)檢測方法，其中N蛋白便是SARS-CoV-2 lgM/lgG快速檢測試劑卡的核心原材料，這表明N蛋白的重要性。本試驗利用昆蟲細(xì)胞表達系統(tǒng)中桿狀病毒穿梭載體的穩(wěn)定性，使病毒迅速在昆蟲細(xì)胞內(nèi)進行穩(wěn)定傳播來最大限度保證外源蛋白的穩(wěn)定表達，同時，屬于真核表達系統(tǒng)的昆蟲細(xì)胞表達系統(tǒng)也有許多原核表達系統(tǒng)(大腸桿菌表達系統(tǒng))不具備的優(yōu)點：可對表達的蛋白質(zhì)進行翻譯加工，且能正確進行空間折疊和形成二硫鍵，從而使表達的重組蛋白更接近于天然的蛋白質(zhì)；可對重組蛋白進行定位，如將核蛋白轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核上、膜蛋白轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上、分泌蛋白分泌到細(xì)胞外；昆蟲細(xì)胞較易培養(yǎng)，能表達自然界大部分蛋白質(zhì)，通常用于大規(guī)模表達重組蛋白，與哺乳動物細(xì)胞表達系統(tǒng)相比縮短了從基因克隆至蛋白表達的時間；具有高度特異的宿主范圍，對脊椎動物和植物無致病性，是安全的載體[15-16]。在本研究之初希望獲得具有天然蛋白質(zhì)活性的蛋白以便應(yīng)用于日常檢測當(dāng)中，使檢測結(jié)果更加精確，因此，選擇了被廣泛應(yīng)用的安全高效的昆蟲細(xì)胞表達系統(tǒng)來表達重組N蛋白，由試驗結(jié)果可知符合預(yù)期目標(biāo)，成功對重組N蛋白進行表達，為進一步驗證重組蛋白的免疫原性及ELISA檢測方法的建立等相關(guān)研究提供試驗基礎(chǔ)。

近年來，越來越多的研究人員開始使用昆蟲表達系統(tǒng)Bac-to-bac來表達蛋白，并進行相關(guān)的研究。徐興莉等[17]首次采用昆蟲表達系統(tǒng)對微小牛蜱Enolase基因得到高效表達后進行了免疫反應(yīng)原性及抗凝指標(biāo)測定；曾博宇等[18]為獲得具有良好免疫原性的流感病毒蛋白，針對流感病毒HA球狀頭部結(jié)構(gòu)域，利用昆蟲表達系統(tǒng)并成功表達，為新型流感疫苗的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)；張愉等[19]針對廣西IBV優(yōu)勢血清型代表株，利用昆蟲表達系統(tǒng)成功表達出具有很好免疫原性的GX-YL5株的S蛋白。王睿男等[20]為了制備出特異性強、親和性高，針對牛γ干擾素的單克隆抗體，同樣選擇了昆蟲表達系統(tǒng)來代替原核表達系統(tǒng)進行試驗，原因是昆蟲表達系統(tǒng)表達的蛋白質(zhì)其空間結(jié)構(gòu)與天然牛IFN-γ蛋白更為相近。大量的文獻表明，昆蟲表達系統(tǒng)在不同病毒的蛋白表達中已被廣泛應(yīng)用，且起到了非常重要的作用，表達出的蛋白更接近天然蛋白質(zhì)，具有更好的免疫原性。經(jīng)中國知網(wǎng)檢索，查閱的文獻中發(fā)現(xiàn)，關(guān)于COV19-N蛋白的表達通常使用的為原核表達系統(tǒng)，利用真核表達系統(tǒng)表達該蛋白幾乎沒有相關(guān)文獻，而真核表達系統(tǒng)表達出的蛋白質(zhì)更接近于天然的蛋白質(zhì)，因此，在后續(xù)相關(guān)的試驗及實際檢測中利用真核表達系統(tǒng)表達的重組N蛋白應(yīng)會使試驗結(jié)果和檢測結(jié)果更加精確，進一步降低假陽性結(jié)果出現(xiàn)的可能性，提高檢測效率。本研究利用Bac-to-bac昆蟲細(xì)胞表達系統(tǒng)成功構(gòu)建了重組桿粒DH10Bac-pFastBacTMHTB-COV19-N。在試驗過程中為了保證每個步驟的精確無誤，在設(shè)計引物時于引物兩端增加酶切位點以便構(gòu)建過程中每一個步驟除了PCR驗證外再進行雙酶切驗證并測序，測序結(jié)果表明，構(gòu)建的重組N基因與原人工合成序列100%相同，證明重組N蛋白載體構(gòu)建成功。用重組N蛋白和GFP蛋白分別轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，并設(shè)置了轉(zhuǎn)染細(xì)胞的質(zhì)粒與試劑的濃度梯度來盡量保證轉(zhuǎn)染效果更佳，凍融裂解收集蛋白后通過SDS-PAGE與WB試驗、利用HRP-His標(biāo)記抗體證明重組蛋白在昆蟲細(xì)胞內(nèi)成功表達，雖然條帶顏色較淺，但期望后期通過不斷優(yōu)化轉(zhuǎn)染和蛋白制樣等步驟來增加樣品中的蛋白含量、提高目的條帶顏色深度。

本研究利用昆蟲表達系統(tǒng)成功構(gòu)建了重組桿粒DH10Bac-pFastBacTMHTB-COV19-N并驗證其在昆蟲細(xì)胞內(nèi)成功表達，為建立更精確的ELISA檢測方法提供了試驗基礎(chǔ)。