獼猴桃AcWRKY70基因序列克隆及其對潰瘍病病原菌和激素處理表達(dá)模式分析

曲 東，燕 飛，3，劉欣瑞，康 雪，曾海濤，3，張 羽，3，4

(1.陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000；2.陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 漢中 723001；3.陜南秦巴山區(qū)生物資源綜合開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 漢中 723001；4.秦巴生物資源與生態(tài)環(huán)境省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 漢中 723000)

獼猴桃為獼猴桃科(Actinidiaceae)獼猴桃屬(ActinidiaLind L.)木質(zhì)藤本果樹，原產(chǎn)于我國，因其果實(shí)維生素C含量高并富含豐富的營養(yǎng)物質(zhì)而深受人們喜愛[1]。然而，隨著獼猴桃栽培面積迅速擴(kuò)大，獼猴桃潰瘍病、根腐病等病害已經(jīng)嚴(yán)重影響了獼猴桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，尤其是丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種(Pseudomonassyringaepv.actinidiae，Psa)引起的獼猴桃潰瘍病的發(fā)生，對獼猴桃樹生長發(fā)育的危害往往是毀滅性的，嚴(yán)重時(shí)會使得植株死亡造成毀園，給果農(nóng)帶來難以負(fù)擔(dān)的經(jīng)濟(jì)損失[2]。目前，獼猴桃潰瘍病抗病分子機(jī)理研究報(bào)道較少，因此，挖掘獼猴桃抗?jié)儾￡P(guān)鍵基因、探究其響應(yīng)病原菌脅迫應(yīng)答機(jī)制正逐漸成為當(dāng)前獼猴桃育種研究的熱點(diǎn)問題。

轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factors，TFs)是植物信號傳導(dǎo)途徑的重要組成部分，它決定了植物對生物和非生物脅迫刺激的反應(yīng)能力，及其對植物發(fā)育過程中植物內(nèi)部信號的響應(yīng)[3]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物中特有的一類轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，也是轉(zhuǎn)錄因子中最大的家族[4]。在生物及非生物脅迫響應(yīng)中，WRKY轉(zhuǎn)錄因子在多個(gè)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控中起關(guān)鍵作用[5]。近年來，多種植物WRKY超家族成員已被報(bào)道，包括大豆(197個(gè))、擬南芥(75個(gè))、大麥(45個(gè))、西瓜(63個(gè))等[6-8]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合域(DNA-binding domain，DBD)以N-端的保守的WRKYGQK氨基酸序列和C-端的鋅指結(jié)構(gòu)域?yàn)樘卣鱗4]，依據(jù)N-端DBD的數(shù)量和C-端鋅指結(jié)構(gòu)序列特征可將WRKY轉(zhuǎn)錄因子分為四類組：Ⅰ組(2個(gè)WRKY DBD)、Ⅱ組(一個(gè)DBD和不同的C2-H2鋅指結(jié)構(gòu))、Ⅲ組(1個(gè)DBD和C2-HC鋅指結(jié)構(gòu))和Ⅳ(不完整WRKY結(jié)構(gòu)域，不含鋅指結(jié)構(gòu))[9]。研究表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子能夠與(T)TGAC(C/T)結(jié)合(如W-box)，從而誘導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)；其以多種同源和異二聚體組合作為激活劑或阻遏劑參與各種細(xì)胞質(zhì)和核過程[4，10]。

許多物種的WRKY家族都被證實(shí)可直接或間接參與植物的生長、發(fā)育、生物和生理過程，而且在植物非生物脅迫反應(yīng)與植物天然免疫過程中起重要作用[4，11-12]。研究表明，TaWRKY33基因在小麥耐鹽脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用[13]。將擬南芥的WRKYIIa亞家族成員在水稻中過表達(dá)，能夠提高水稻抵抗白葉枯病菌(Xanthomonasoryzaepv．ryzae)的抗病性[14]；分析沉默BnWRKY70基因的油菜植株，在接種黑脛病菌(Leptosphaeriabiglobosa)之后，發(fā)現(xiàn)基因沉默油菜葉片更易感病，表明油菜BnWRKY70基因沉默使得油菜易感黑脛病[15]；在抗白粉病(ErysiphegraminisD.c.f.sp.triticiE.Marchal)小麥(Brock)品種中發(fā)現(xiàn)TaWRKY26基因在小麥對白粉菌侵染的應(yīng)答反應(yīng)過程中發(fā)揮了積極作用[16]。另外研究發(fā)現(xiàn)，WRKY轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)能夠被植物激素調(diào)控，如脫落酸(Abscisic acid，ABA)誘導(dǎo)OsWRKY51和OsWRKY71基因抑制水稻種子糊粉層細(xì)胞中的赤霉素(GA)信號[17]。同樣，AtWRKY18、AtWRKY40、AtWRKY60轉(zhuǎn)錄因子參與由植物激素水楊酸(Salicylic acid ，SA)和茉莉酸(Jasmonic acid，JA)介導(dǎo)的信號通路[18]。當(dāng)沉默辣椒CaWRKY40基因后，辣椒抗青枯假單胞桿菌(Ralstoniasolanacearum)抗性下降，而外源SA、JA能夠上調(diào)該基因的表達(dá)[19]。棉花GhWRKY22基因沉默植株對棉花黃萎病病原菌大麗輪枝菌的敏感性增加，該基因是通過SA和JA激素的途徑參與病原菌響應(yīng)過程的[20]。

研究人員在提高植物抗病能力方面進(jìn)行了大量的研究，但目前在獼猴桃抗?jié)儾∶{迫響應(yīng)方面的相關(guān)報(bào)道較少。為挖掘獼猴桃關(guān)鍵抗病基因，探究AcWRKY70基因在獼猴桃抗病響應(yīng)中的作用，本研究以抗病品種徐香和高感病品種紅陽獼猴桃為材料[21]，克隆AcWRKY70基因序列，并進(jìn)行蛋白性質(zhì)及結(jié)構(gòu)分析、系統(tǒng)進(jìn)化等生物信息學(xué)分析；采用熒光定量PCR(qRT-PCR)方法探究該基因在不同抗性獼猴桃品種根、莖、葉、花組織中的表達(dá)模式及不同抗性獼猴桃品種在病原菌(Psa)、水楊酸與Psa(SA+Psa)共同處理和茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate，MeJA)與Psa(MeJA+Psa)共同處理下的表達(dá)差異，初步探究AcWRKY70轉(zhuǎn)錄因子在不同抗性品種獼猴桃響應(yīng)潰瘍病脅迫作用機(jī)制，以期為AcWRKY70轉(zhuǎn)錄因子在獼猴桃抗?jié)儾∠嚓P(guān)研究和應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 植物材料與處理

試驗(yàn)材料源自陜西省漢中市城固縣自然好獼猴桃專業(yè)合作社獼猴桃園，移栽于陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的嫁接2年生高感病品種紅陽獼猴桃(Actinidiachinensisvar.chinensisHongyang)和抗病品種徐香(Actinidiadeliciosavar.Xuxiang)獼猴桃幼苗。

分別取紅陽獼猴桃和徐香獼猴桃的莖、花、葉，裝入無菌的樣品管內(nèi)標(biāo)記，放入液氮速凍，并保存于-80 ℃冰箱備用。

將紅陽獼猴桃和徐香獼猴桃幼苗分為4組，噴灑水為第1組(正常生長組)，先用水對葉片進(jìn)行噴灑，7 d后用丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種菌液(陜西省資源生物實(shí)驗(yàn)室分離鑒定保存菌種，GenBank序列登錄號：MW404385，菌液濃度1.0×108cfu/mL)進(jìn)行噴灑處理為第2組(Psa)；先用水楊酸(2.5 mmol/L)對葉片進(jìn)行噴灑預(yù)處理，7 d后用丁香假單胞獼猴桃致病變種液噴灑葉片為第3組(SA+Psa)；先用茉莉酸甲酯(1 mmol/L)對葉片進(jìn)行噴灑預(yù)處理，7 d后用丁香假單胞獼猴桃致病變種液噴灑葉片為第4組(MeJA+Psa)，預(yù)處理方法參照文獻(xiàn)[22]；處理后分別在0，6，12，24，48，72 h 這5個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣，裝入無菌的樣品管內(nèi)，用記號筆標(biāo)記采取樣品的處理和時(shí)間，立即放入液氮，轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存待用，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

1.2 獼猴桃AcWRKY70基因的克隆及測序

采用TransZol Plant試劑(TransGen Biotech)提取不同處理時(shí)期樣品RNA，經(jīng)電泳檢測(1%瓊脂糖凝膠)合格，Thermo NanoDrop 2000分光光度計(jì)測定各樣品的濃度以及OD260/280、OD260/230值；后反轉(zhuǎn)錄為cDNA(TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Supermix，TransGen Biotech)并保存于-20 ℃冰箱備用。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期WRKY轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測分析，以獼猴桃數(shù)據(jù)庫(http：//kiwifruitgenome.org/)中WRKY蛋白基因的序列(Ach24g147941-TA)為模板，利用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)引物，AcWRKY70基因上下游引物分別為5′-ATGGGCATCCTTCGGC-3′和5′-TCACTCACCCTCACCAA-3′。以獼猴桃葉片cDNA為模板，利用高保真酶進(jìn)行PCR，退火溫度為54 ℃，PCR產(chǎn)物檢測(1%瓊脂糖凝膠)、膠回收(E.Z.N.A.?Gel Extraction Kit)、載體連接等方法參照本實(shí)驗(yàn)室方法[23]，選取陽性克隆送北京擎科生物有限公司(西安測序部)進(jìn)行測序。

1.3 AcWRKY70序列的生物信息學(xué)分析

利用ORF finder(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)在線分析開放閱讀框，通過 NCBI Conserved Domain Search Service在線分析AcWRKY70蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)域(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)；利用DNAMAN 9.0 軟件對獼猴桃AcWRKY70蛋白質(zhì)與其他物種WRKY蛋白質(zhì)進(jìn)行比對分析；使用 ClutsalX v1.83 程序進(jìn)行多序列比對，然后將比對結(jié)果輸入到Mega 7.0 軟件中，利用鄰接法 (Neighbor-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap 值取 1 000 次；利用 ExPASy-ProtParam tool 在線軟件(http：//web.expasy.org/protparam/)進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析；利用 Expasy 中的 ProtScale 在線軟件(http：//web.expasy.org/protscale/)分析AcWRKY70蛋白質(zhì)的親水性和疏水性；利用NetPhos v3.1(http：// www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)在線工具對獼猴桃 AcNPR1蛋白進(jìn)行潛在的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測分析；利用SOPMA數(shù)據(jù)庫(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)得到AcWRKY70可能的二級結(jié)構(gòu)；利用 SWISS-MODEL(http：//swissmodel.expasy.org)進(jìn)行同源建模，構(gòu)建AcWRKY70的三級結(jié)構(gòu)域模型；通過CELLO2GO 在線分析工具(http：//cello.life.nctu.edu.tw/cello2go/)預(yù)測亞細(xì)胞的可能定位。

1.4 AcWRKY70基因?qū)崟r(shí)熒光定量分析

熒光定量反應(yīng)程序及反應(yīng)體系按照熒光定量試劑盒(Perfectstart Green qPCR Supermix，全式金生物，北京)說明完成，采用美國ABI StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析。熒光定量上下游引物分別為5′-GCTACGGAATCTATTGGAGA-3′和5′-AATCACACGCACACTTCA-3′；內(nèi)參基因上下游引物分別為5′-CTGTGAAACTGCGAATGGCTC-3′和5′-TTCCAGAAGTCGGGGTTTGT-3′，試驗(yàn)采用3次生物學(xué)重復(fù)，不同材料中目的基因的相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt方法計(jì)算。利用 SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 AcWRKY70基因克隆以及序列分析

據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期對獼猴桃WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族生物信息學(xué)分析，預(yù)測得到一個(gè)與AtWRKY70最密切相關(guān)的獼猴桃WRKY基因，將該序列(Ach24g147941-TA)命名為AcWRKY70，為AcWRKY70基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，并以紅陽葉片RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行AcWRKY70基因序列PCR擴(kuò)增(圖1-A)，測序得AcWRKY70基因序列全長為906 bp(GenBank登錄號：MW881147)。另外，以徐香葉片cDNA為模板獲得的WRKY基因序列與紅陽AcWRKY70基因序列只有個(gè)別堿基有差異。對紅陽AcWRKY70基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析， NCBI ORF Finder 在線工具進(jìn)行開放閱讀框預(yù)測結(jié)果顯示，AcWRKY70基因含有開放閱讀框長度為885 bp，編碼294個(gè)氨基酸；NCBI Conserved domains在線工具分析表明，該蛋白結(jié)構(gòu)中第122—182位區(qū)域間含有1個(gè)WRKY保守結(jié)構(gòu)域，包含61個(gè)氨基酸(圖1-B)。

2.2 AcWRKY70基因編碼的氨基酸序列比對分析

將克隆得到的獼猴桃AcWRKY70基因的氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列比對，利用DNAMAN 9.0對不同物種WRKY轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列多重比較，結(jié)果表明，獼猴桃AcWRKY70氨基酸序列與中華獼猴桃(Actinidiachinensis)、茶樹(Camelliasinensis)、藍(lán)果樹(Nyssasinensis)、橡膠樹(Heveabrasiliensis)、楊梅(Morellarubra)、銀白楊(Populusalba)、葡萄(Vitisvinifera)的WRKY類轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域一致性較高，N端有一個(gè)WRKYGQK保守結(jié)構(gòu)域，C端為CX7CX24HXC(C2-HC)型鋅指結(jié)構(gòu)，屬于Ⅲ類 WRKY 轉(zhuǎn)錄因子(圖2)；其與中華獼猴桃、茶樹、藍(lán)果樹蛋白序列相似性分別為99.32%，50.62%，48.73%。

M.GL DNA Marker 2000 Ladder；1.紅陽AcWRKY70基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。M.GL DNA Marker 2000 Ladder；1.PCR product of Hongyang AcWRKY70 gene.

紅色框線.WRKYGQK保守結(jié)構(gòu)域；紅色箭頭.C2-HC鋅指結(jié)構(gòu)域。Red box.The conserved domain of WRKYGQK;Red arrows.The zinc finger domain of C2-HC.

2.3 獼猴桃AcWRKY70的系統(tǒng)進(jìn)化分析

采用 Mega 7.0 軟件對12個(gè)物種的WRKY蛋白序列與紅陽獼猴桃AcWRKY70蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析并構(gòu)建進(jìn)化樹(圖3)，結(jié)果顯示，WRKY蛋白被大致分為2組，紅陽獼猴桃AcWRKY70蛋白與楊梅、銀白楊、葡萄、茶樹等聚為一組，紅陽獼猴桃AcWRKY70蛋白與茶樹和藍(lán)果樹WRKY蛋白親緣關(guān)系最近。

紅陽獼猴桃AcWRKY70蛋白序列位于紅框中。The AcWRKY70 protein sequence of kiwifruit is located in the red frame.

2.4 AcWRKY70基因編碼蛋白的理化性質(zhì)及磷酸化位點(diǎn)分析

利用在線工具ProtParam 分析AcWRKY70基因編碼的蛋白質(zhì)的分子式為 C1436H2271N405O455S23，編碼 295個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為 33.226 ku，理論等電點(diǎn)(pI)5.94，脂肪指數(shù)為 58.01，不穩(wěn)定指數(shù)Ⅱ?yàn)?8.52，屬于不穩(wěn)定蛋白；通過對氨基酸疏水性進(jìn)行分析，總平均親水性系數(shù)為-0.545，為親水性蛋白。利用 NetPhos 對該蛋白的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)AcWRKY70蛋白均具有絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)和酪氨酸(Try)磷酸化位點(diǎn)(圖4)。

圖4 AcWRKY70 蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測Fig.4 The phosphorylation sites prediction of AcWRKY70 protein

2.5 AcWRKY70蛋白二、三級結(jié)構(gòu)分析及亞細(xì)胞定位分析

利用SOPMA在線預(yù)測軟件對AcWRKY70基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)AcWRKY70蛋白的二級結(jié)構(gòu)由無規(guī)則卷曲、α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角四部分構(gòu)成，占比分別為64.75%，23.05%，9.49%，2.71%；無規(guī)則卷曲是AcWRKY70蛋白的主要二級結(jié)構(gòu)。通過SWISS-MODEL軟件對AcWRKY70蛋白的三級空間結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明，該蛋白至少由3個(gè)α-螺旋、2個(gè)較穩(wěn)定的反向平行β-折疊和許多無規(guī)則卷曲構(gòu)成 (圖5)。利用CELLO2GO在線工具進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測，結(jié)果顯示，AcWRKY70蛋白亞細(xì)胞定位在細(xì)胞核得分為2.85，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于細(xì)胞中其他部位，AcWRKY70蛋白最可能定位于細(xì)胞核當(dāng)中參與獼猴桃其他基因表達(dá)的調(diào)控過程。

圖5 AcWRKY70蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 The tertiary structure prediction of AcWRKY70 protein

2.6 獼猴桃AcWRKY70基因在不同處理?xiàng)l件下的表達(dá)模式分析

2.6.1AcWRKY70基因組織表達(dá)模式分析 通過qRT-PCR技術(shù)分別對紅陽和徐香2個(gè)品種中AcWRKY70基因在根、莖、葉、花不同組織中相對表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果表明，AcWRKY70基因在徐香和紅陽(圖6)2個(gè)品種中基因相對表達(dá)量由高到低均為葉>莖>花，葉片中AcWRKY70基因相對表達(dá)量最高，顯著高于莖、花中的基因表達(dá)量(P<0.05)。

不同小寫字母代表不同處理存在顯著差異(P<0.05)。圖7同。Different lowercase indicate significant difference in different treatments， P<0.05．The same asFig.7.

2.6.2AcWRKY70基因在病原菌處理、病原菌與水楊酸預(yù)處理、病原菌與茉莉酸甲酯預(yù)處理下的表達(dá)模式分析 實(shí)時(shí)熒光定量分析Psa、SA+Psa以及MeJA+Psa處理下不同抗性品種獼猴桃AcWRKY70基因表達(dá)水平的變化情況，結(jié)果表明，在Psa處理下的，0 h高感病品種紅陽獼猴桃中AcWRKY70基因相對表達(dá)量迅速上升至正常生長葉片的3.18倍，抗病品種徐香獼猴桃中AcWRKY70基因相對表達(dá)量上升至正常生長葉片的1.85倍；6 h后2個(gè)品種中AcWRKY70基因相對表達(dá)量均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(圖7-A)，特別是抗病品種徐香獼猴桃在12 h基因相對表達(dá)量急劇升高至峰值，為正常生長葉片的80.58倍，在24，48 h基因相對表達(dá)量雖呈降低趨勢，但仍處于較高水平，分別為正常生長葉片的13.68，8.65倍；而高感病紅陽品種中AcWRKY70基因相對表達(dá)量始終維持在較低水平，除了在48 h基因相對表達(dá)量為正常生長葉片的3.03倍，Psa處理下高感病品種紅陽AcWRKY70基因相對表達(dá)量始終低于抗病品種徐香(除0 h之外)(圖7-A)。

在SA+Psa處理下，0 h高感病品種紅陽中AcWRKY70基因相對表達(dá)量為正常生長葉片的1.95倍，抗病品種徐香中AcWRKY70基因相對表達(dá)量迅速升高至正常生長葉片的4.01倍；之后徐香AcWRKY70基因相對表達(dá)量均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，在12 h基因相對表達(dá)量達(dá)到最大，為正常生長葉片的39.91倍，紅陽AcWRKY70基因相對表達(dá)量在6～72 h內(nèi)波動變化，72 h達(dá)到最大，為正常生長葉片的2.95倍，且該處理下0，6，12，24 h紅陽基因相對表達(dá)水平低于徐香(圖7-B)。

在MeJA+Psa處理下，6 h高感病品種紅陽中AcWRKY70基因相對表達(dá)量為正常生長葉片的1.09倍，抗病品種徐香中AcWRKY70基因相對表達(dá)量迅速升高至正常生長葉片的5.42倍；之后徐香AcWRKY70基因相對表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，12 h基因相對表達(dá)量達(dá)到最大，為正常生長葉片的42.22倍，紅陽AcWRKY70基因相對表達(dá)量在6～72 h內(nèi)波動變化，24 h達(dá)到最大，為正常生長葉片的2.66倍(圖7-C)。

3 結(jié)論與討論

近年來，WRKY轉(zhuǎn)錄因子由于其參與植物生長發(fā)育多個(gè)過程、生物和非生物脅迫反應(yīng)及植物天然免疫過程(包括微生物或病原體相關(guān)分子模式觸發(fā)免疫反應(yīng)(MTI或 PTI)和誘發(fā)免疫反應(yīng)(ETI))而被廣泛關(guān)注[4，11-12]，然而，關(guān)于獼猴桃WRKY轉(zhuǎn)錄因子在潰瘍病脅迫反應(yīng)中的響應(yīng)機(jī)制報(bào)道較少。

脅迫反應(yīng)相關(guān)基因的誘導(dǎo)表達(dá)主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，植物特異性轉(zhuǎn)錄因子家族就是大量參與植物脅迫響應(yīng)誘導(dǎo)特定應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)的重要部分[24]。大量研究表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族參與了受體介導(dǎo)的過程從而誘導(dǎo)脅迫響應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)[4]。研究表明，在已報(bào)道的72個(gè)擬南芥WRKY基因中，有49個(gè)WRKY基因能夠被獼猴桃潰瘍病致病菌不同程度調(diào)控表達(dá)[25]。本研究表明，獼猴桃潰瘍病致病菌侵染獼猴桃后，在抗病品種徐香中Psa誘導(dǎo)AcWRKY70基因迅速表達(dá)；而在高感病品種紅陽中只在0，48 hAcWRKY70基因表達(dá)量被上調(diào)，可見，AcWRKY70基因在響應(yīng)獼猴桃潰瘍病脅迫反應(yīng)中發(fā)揮了作用。值得注意的是，在抗病品種徐香中AcWRKY70基因強(qiáng)烈響應(yīng)Psa脅迫，表達(dá)量急劇升高，遠(yuǎn)高于感病品種中基因表達(dá)量，這可能與不同品種間抗病性、抗病機(jī)制存在差異有關(guān)，AcWRKY70基因可能通過誘導(dǎo)抗病相關(guān)基因的表達(dá)從而提高徐香獼猴桃的抗病性。這與煙草抗病與感病品種中WRKY2、WRKY11基因的表達(dá)情況類似，當(dāng)煙草受黃瓜花葉病毒侵染后，煙草抗病品種臺煙8號中WRKY轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量增加，而感病品種K326中WRKY轉(zhuǎn)錄因子未受明顯誘導(dǎo)[26]。除此之外，AcWRKY70基因在抗病品種中可能主要參與了植物對病原菌的早期抗性反應(yīng)，這與煙草中WRKY轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)情況也一致。

脅迫響應(yīng)往往與激素信號相關(guān)，WRKY轉(zhuǎn)錄因子也是復(fù)雜的植物激素信號網(wǎng)絡(luò)中的一個(gè)重要部分。研究表明，擬南芥中屬于WRKY轉(zhuǎn)錄因子第Ⅲ類的WRKY70和WRKY46基因能夠被SA和病原體誘導(dǎo)大量表達(dá)從而提高植物抗病性[27]。本研究中，經(jīng)過Psa處理后抗病品種徐香與高感病品種紅陽AcWRKY70基因均被上調(diào)表達(dá)，這與AcWRKY屬于WRKY轉(zhuǎn)錄因子第Ⅲ類家族特征一致[28]；SA+Psa處理0 h抗病品種徐香AcWRKY70基因相對表達(dá)水平高于高感病品種紅陽中該基因相對表達(dá)水平，表明AcWRKY70基因表達(dá)水平受到SA處理的影響，且不同抗性品種間該基因調(diào)控機(jī)制方面存在差異。研究表明，經(jīng)過SA預(yù)處理的海沃德獼猴桃葉片接種Psa后， Psa定殖率僅為只接種Psa獼猴桃葉片的46%[22]。在MeJA+Psa處理0 h，抗病品種徐香AcWRKY70基因相對表達(dá)水平也高于高感病品種紅陽中該基因相對表達(dá)水平，表明茉莉酸甲酯預(yù)處理對于AcWRKY70基因的表達(dá)具有調(diào)控作用，基因表達(dá)水平的變化可能與SA預(yù)處理、MeJA預(yù)處理降低了Psa在獼猴桃葉片上的定殖率有關(guān)；這與辣椒CaWRKY27轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)SA、JA信號提高抗病性一致[29]；在高感病品種紅陽中AcWRKY70基因相對表達(dá)量始終處于較低水平，這可能與AcWRKY70轉(zhuǎn)錄因子在不同抗病性品種間調(diào)控機(jī)制不同有關(guān)，其可能是導(dǎo)致獼猴桃高感病品種紅陽和抗病品種徐香抗性差異的原因之一。

本研究克隆并分析不同抗性獼猴桃品種中AcWRKY70基因在Psa、SA+Psa、MeJA+Psa處理?xiàng)l件下的基因表達(dá)情況，結(jié)果表明，AcWRKY70基因受Psa誘導(dǎo)表達(dá)且在不同抗病性獼猴桃品種間的作用機(jī)制存在差異，SA、MeJA預(yù)處理可以提高抗病獼猴桃品種的抗病能力，但具體機(jī)制仍需繼續(xù)探究，今后將進(jìn)一步探索AcWRKY70轉(zhuǎn)錄因子在抵御獼猴桃潰瘍病中的調(diào)控機(jī)制，為AcWRKY70基因的抗病功能的研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。