不同生育時(shí)期水稻土壤細(xì)菌群落特征與生態(tài)功能預(yù)測

陳秋圓，趙帥兵，梁 賀，劉 曄，崔燕妮，彭 廷，2，趙全志，2，張 靜，2

(1．河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，河南省水稻生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450046；2．河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，水稻河南省工程實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450046)

水稻(Oryzasativa)是我國三大糧食作物之一，近些年，探究水稻產(chǎn)量形成的生理生態(tài)機(jī)制是農(nóng)業(yè)工作者關(guān)注的焦點(diǎn)之一。水稻產(chǎn)量構(gòu)成要素包括穗數(shù)、穗粒數(shù)、千粒質(zhì)量和結(jié)實(shí)率[1]。氮素是水稻必需營養(yǎng)元素之一。在適宜的施氮量條件下，氮肥一般分3～5次施入大田，通常以基蘗肥和穗粒肥方式按一定比例施用。基蘗肥中氮肥除作為基肥外，分蘗肥通常在水稻插秧7 d后施入；穗粒肥則分別在孕穗期和抽穗期施入。分蘗期和拔節(jié)—孕穗期是水稻穗數(shù)和穗粒數(shù)形成的關(guān)鍵時(shí)期。合理施用分蘗肥可提高有效分蘗，控制無效分蘗。在穗軸分化期和花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂期施用穗肥可促進(jìn)枝梗和穎花分化、減少穎花退化，有利于千粒質(zhì)量和結(jié)實(shí)率的提高。前人研究發(fā)現(xiàn)，土壤微生物在植物生長發(fā)育過程中的作用不容忽視。水稻內(nèi)生細(xì)菌、土壤細(xì)菌群落與穗粒數(shù)呈顯著正相關(guān)關(guān)系；稻田土壤細(xì)菌的增加，可改善土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，增加水稻穗數(shù)和穗粒數(shù)[2-4]。因此，稻田土壤微生物中細(xì)菌與水稻產(chǎn)量及其構(gòu)成要素形成關(guān)系密切，是實(shí)現(xiàn)水稻高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的重要生態(tài)因子之一[5]。

隨著高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)研究的發(fā)展，16S rRNA擴(kuò)增子測序技術(shù)已成為研究環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)和組成的重要手段。國內(nèi)外研究學(xué)者已有較多關(guān)于水稻[6-8]、小麥[9-11]、玉米[12]等作物土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)方面的研究報(bào)道，發(fā)現(xiàn)稻田土壤優(yōu)勢菌群主要為擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)等[13-16]。隨著施氮量增加，土壤細(xì)菌群落多樣性呈上升趨勢[17]。長期施肥條件下，土壤細(xì)菌多樣性及數(shù)量均較不施肥處理顯著增加[18]。已有報(bào)道指出，分蘗期稻田土壤微生物數(shù)量多、種類復(fù)雜、代謝能力強(qiáng)[19]。拔節(jié)—孕穗期是決定穗粒數(shù)多少的關(guān)鍵時(shí)期[20-21]。與分蘗期相比，孕穗期稻田土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著變化[22]。但不同生育時(shí)期水稻土壤細(xì)菌群落組成與結(jié)構(gòu)、生態(tài)功能與產(chǎn)量間的關(guān)系報(bào)道較少。由于水稻高產(chǎn)栽培管理過程中，氮肥多以基蘗肥與穗粒肥按6∶4或7∶3的比例施入，因此，以2個(gè)高產(chǎn)水稻品種為材料，通過設(shè)置2個(gè)氮肥施用比例處理，采用 Illumina MiSeq 高通量測序技術(shù)，研究水稻分蘗期、拔節(jié)—孕穗期土壤細(xì)菌群落組成與結(jié)構(gòu)、生態(tài)功能的差異，及其與土壤氮素、水稻產(chǎn)量的關(guān)系，旨在為深入解析土壤微生物在水稻產(chǎn)量形成中的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 種植材料

2個(gè)水稻品種為Y兩優(yōu)900和早豐優(yōu)69。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)信陽教學(xué)試驗(yàn)基地(34°34′ N，115°33′ E)進(jìn)行，設(shè)2種氮肥施用比例，基蘗肥和穗粒肥比例分別為6∶4(即基肥為40%，分蘗肥為20%，穗粒肥為40%)和7∶3(即基肥為40%，分蘗肥為30%，穗粒肥為30%)，總施氮量均為277.5 kg/hm2。小區(qū)面積60 m2，3次重復(fù)。基肥施750 kg/hm2復(fù)合肥(N∶P2O5∶K2O=15∶15∶15)，分蘗肥以尿素形式施入。穗粒肥追施尿素分2次施入，倒四葉施入60%，剩余部分在倒二葉時(shí)施用。磷肥和鉀肥與氮肥的施用比例為N∶P2O5∶K2O=1∶0.5∶1，磷肥按1∶1的比例分別隨基肥和穗粒肥施入，鉀肥隨基肥一次性施入土壤。水稻于2015年4月30日播種，5月20日移栽，行株距為30 cm×21 cm，每穴2株。試驗(yàn)期間其他田間栽培管理方式與當(dāng)?shù)乇３忠恢?。該地土壤pH值6.40，有機(jī)質(zhì)含量29.30 g/kg，全氮含量1.00 g/kg，堿解氮36.75 mg/kg，速效磷16.50 mg/kg，速效鉀13.94 mg/kg。

1.3 水稻產(chǎn)量及其構(gòu)成要素測定

成熟期選取長勢一致的2 m×2 m樣塊進(jìn)行產(chǎn)量的測定，并調(diào)查各小區(qū)200穴記錄有效穗數(shù)，按照各小區(qū)有效穗數(shù)均值選取3株考種，測定穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、千粒質(zhì)量等。

1.4 土壤樣品采集

分別于水稻分蘗期和拔節(jié)—孕穗期取0～20 cm土壤樣品，液氮冷凍后保存于-80 ℃冰箱待測。

1.5 土壤生化性質(zhì)測定

1.6 土壤微生物基因組DNA提取及文庫構(gòu)建

土壤總DNA的提取采用Soil DNA Isolation Kit 試劑盒(Mo Bio，San Diego，CA)。以基因組DNA為模板，用簡并PCR引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，對(duì)16S rRNA基因的可變區(qū)V4進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增，磁珠篩選目的片段，用合格文庫進(jìn)行Cluster制備，設(shè)置30 bp窗口長度，通過Illumina平臺(tái)(Hiseq或Miseq)進(jìn)行Paired-end測序[29-30]。

1.7 數(shù)據(jù)分析

16S rRNA擴(kuò)增子數(shù)據(jù)主要運(yùn)用QIIME 2進(jìn)行分析[31]，測序數(shù)據(jù)經(jīng)過濾、裁剪和拼接后形成Tags，用QIIME 2腳本中的DADA2進(jìn)行質(zhì)控，并生成代表性序列和特征表(ASV表)，之后用SILVA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋?；贏SV表和物種注釋結(jié)果的分析及可視化通過R Studio(Version 4.1.0)軟件實(shí)現(xiàn)，包括采用QIIME 2和Vegan 2.5-7包分別進(jìn)行Beta多樣性分析和冗余分析[32]，使用edgeR 3.36.0包進(jìn)行差異分析 (Wilcoxon rank sum test)[33]，差異ASV篩選標(biāo)準(zhǔn)為FDR(False discovery rate)< 0.05，采用ggplot2 3.3.5包[34]作圖。土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的功能預(yù)測采用FAPROTAX(Functional annotation of prokaryotic taxa)方法[35]，并利用Pheatmap 1.0.12包繪圖[36]。使用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行Pearson相關(guān)系數(shù)計(jì)算及方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生育時(shí)期稻田土壤氮素、細(xì)菌數(shù)量的差異分析

由表1可見，土壤氨氧化潛勢、硝化強(qiáng)度、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、全氮含量和細(xì)菌數(shù)量均在2個(gè)生育時(shí)期間存在顯著或極顯著差異。分蘗期7∶3處理中，Y兩優(yōu)900土壤氨氧化潛勢和硝化強(qiáng)度均顯著低于早豐優(yōu)69(P<0.05)。拔節(jié)—孕穗期早豐優(yōu)69土壤銨態(tài)氮含量在2個(gè)氮肥處理中均顯著高于Y兩優(yōu)900(P<0.05)，硝化強(qiáng)度則低于Y兩優(yōu)900(P<0.05)；7∶3處理下，早豐優(yōu)69土壤全氮含量顯著高于Y兩優(yōu)900(P<0.05)。拔節(jié)—孕穗期，早豐優(yōu)69土壤細(xì)菌數(shù)量7∶3處理比6∶4處理多35.31%。同時(shí)，土壤細(xì)菌數(shù)量還受到生育時(shí)期、氮肥及生育時(shí)期和品種交互作用的影響。

2.2 水稻產(chǎn)量及其構(gòu)成要素與不同生育時(shí)期土壤生化因子的相關(guān)性分析

從產(chǎn)量及其構(gòu)成要素來看(表2)，穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率和產(chǎn)量在2個(gè)品種間均存在顯著或極顯著差異，2個(gè)施氮比例對(duì)產(chǎn)量及其構(gòu)成要素?zé)o顯著影響。Y兩優(yōu)900的結(jié)實(shí)率在2個(gè)施氮處理下均顯著低于早豐優(yōu)69(P<0.05)。早豐優(yōu)69穗粒數(shù)在6∶4和7∶3處理中分別比Y兩優(yōu)900顯著增加了32.52，63.29粒。早豐優(yōu)69在7∶3處理的產(chǎn)量比Y兩優(yōu)900提高10.63%。由相關(guān)性分析可知(表3)，產(chǎn)量與分蘗期土壤細(xì)菌數(shù)量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，而與拔節(jié)—孕穗期的細(xì)菌數(shù)量呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，分蘗期細(xì)菌數(shù)量與有效穗數(shù)存在顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，穗粒數(shù)與分蘗期和拔節(jié)—孕穗期的土壤氨氧化潛勢均呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，分蘗期土壤全氮含量與穗粒數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，拔節(jié)—孕穗期土壤全氮含量與產(chǎn)量存在顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。由此可見，水稻產(chǎn)量、有效穗數(shù)和穗粒數(shù)受到土壤細(xì)菌、氨氧化潛勢和全氮的調(diào)控。

表1 不同處理土壤生化因子含量變化Tab.1 Changes in the content of soil biochemical factors in different treatments

表2 不同處理水稻產(chǎn)量及其構(gòu)成要素Tab.2 Rice yield and yield components in different treatments

2.3 不同生育時(shí)期稻田土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異分析

高通量測序結(jié)果顯示，24個(gè)土壤樣品共得到844 532條有效序列，通過QIIME 2將優(yōu)化序列在100%相似度下進(jìn)行聚類，獲得5 868個(gè)ASV。以Bray-Curtis距離做非限制性主坐標(biāo)分析(Principal coordinate analysis，PCoA)結(jié)果顯示 (圖1)，稻田土壤細(xì)菌群落在第一主坐標(biāo)軸(PCo1)上按時(shí)期被分成2簇，其貢獻(xiàn)率為17.05%，品種是第2主坐標(biāo)軸(PCo2)上樣品差異的主要因素，PCo2的貢獻(xiàn)率為10.09%，表明不同生育時(shí)期會(huì)導(dǎo)致稻田土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化，同時(shí)，稻田土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)還受到品種的影響。

2.4 不同生育時(shí)期稻田土壤細(xì)菌群落組成的差異分析

分蘗期和拔節(jié)—孕穗期Y兩優(yōu)900和早豐優(yōu)69的稻田土壤優(yōu)勢菌群組成在不同分類水平存在差異(圖2)。在門和綱水平上，分蘗期的綠彎菌門(Chloroflexi)相對(duì)豐度比拔節(jié)—孕穗期高6.16 百分點(diǎn)，其中Y兩優(yōu)900高出9.35百分點(diǎn)，早豐優(yōu)69高出2.97百分點(diǎn)；拔節(jié)—孕穗期的變形菌門相對(duì)豐度比分蘗期高0.69百分點(diǎn)，γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)相對(duì)豐度比分蘗期高1.66百分點(diǎn)，α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)相對(duì)豐度比分蘗期低0.27百分點(diǎn)；拔節(jié)—孕穗期的擬桿菌門相對(duì)豐度比分蘗期高1.09百分點(diǎn)，早豐優(yōu)69土壤中擬桿菌門相對(duì)豐度比Y兩優(yōu)900高2.88百分點(diǎn)；分蘗期的酸桿菌門(Acidobacteria)相對(duì)豐度比拔節(jié)—孕穗期高出2.65百分點(diǎn)。

表3 土壤生化因子與產(chǎn)量及其構(gòu)成要素的相關(guān)性分析(n=12)Tab.3 Correlation analysis between soil biochemistry indexes and yield，its components

分蘗期和拔節(jié)—孕穗期Y兩優(yōu)900和早豐優(yōu)69土壤中富集的ASV存在重疊，Y兩優(yōu)900在2個(gè)生育時(shí)期土壤中共同富集25個(gè)ASV，占分蘗期富集的56.81%，占拔節(jié)—孕穗期富集的43.86%(圖3-A)，主要屬于綠彎菌門、變形菌門、擬桿菌門和酸桿菌門(圖3-B)。早豐優(yōu)69土壤中有8個(gè)ASV在2個(gè)生育時(shí)期中共同富集，占分蘗期的32.00%， 拔節(jié)—孕穗期的42.10%(圖3-C)，主要屬于厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和綠彎菌門 (圖3-D)。分蘗期和拔節(jié)—孕穗期富集的ASV在Y兩優(yōu)900和早豐優(yōu)69土壤中也存在重疊，拔節(jié)—孕穗期有15個(gè)ASV在2個(gè)品種中共同富集，占Y兩優(yōu)900的88.23%，早豐優(yōu)69的71.43%(圖3-E)，這15個(gè) ASV主要屬于變形菌門、酸桿菌門和擬桿菌門(圖3-F)；分蘗期有24個(gè)ASV在2個(gè)品種中共同富集，占Y兩優(yōu)900的77.42%，早豐優(yōu)69的64.86%(圖3-G)，這24個(gè)ASV主要屬于綠彎菌門、變形菌門、擬桿菌門和酸桿菌門(圖3-H)?？偟膩碚f，ASV水平上2個(gè)生育時(shí)期間差異富集的細(xì)菌在門水平包括綠彎菌門、變形菌門、擬桿菌門和酸桿菌門；2個(gè)品種間差異富集的細(xì)菌在門水平主要為綠彎菌門、變形菌門、酸桿菌門、厚壁菌門和擬桿菌門。

Y.Y兩優(yōu)900；Z.早豐優(yōu)69；T.分蘗期；J.拔節(jié)—孕穗期。圖2—5同。Y.Y Liangyou 900；Z.Zaofengyou 69；T.Tillering stage；J.Jointing—booting stage.The same asFig.2—5.

Y-6∶4.氮肥比例6∶4處理的Y兩優(yōu)900；Z-6∶4.氮肥比例6∶4處理的早豐優(yōu)69；Y-7∶3.氮肥比例7∶3處理的Y兩優(yōu)900；Z-7∶3.氮肥比例7∶3處理的早豐優(yōu)69。其他指相對(duì)豐度排名前10以外的其他細(xì)菌。因變形菌門豐度較高，相對(duì)豐度為綱水平，其余為門水平。

A.2個(gè)時(shí)期Y兩優(yōu)900土壤富集的ASV；B.2個(gè)時(shí)期Y兩優(yōu)900土壤富集ASV的組成；C.2個(gè)時(shí)期早豐優(yōu)69土壤富集的ASV；D.2個(gè)時(shí)期早豐優(yōu)69土壤富集ASV的組成；E.拔節(jié)—孕穗期土壤富集的ASV；F.拔節(jié)—孕穗期土壤富集ASV的組成。G.分蘗期土壤富集的ASV；H.分蘗期土壤富集ASV的組成。

2.5 不同生育時(shí)期稻田土壤優(yōu)勢細(xì)菌與環(huán)境因子的RDA分析

將稻田土壤理化性質(zhì)與相對(duì)豐度前十的細(xì)菌門(綱)進(jìn)行冗余分析(RDA)發(fā)現(xiàn)，2個(gè)生育時(shí)期(圖4-A、B)和2個(gè)品種(圖4-C、D)的稻田土壤優(yōu)勢細(xì)菌群落組成存在差異，且受到土壤理化因子的影響。由圖4-A可知，RDA1對(duì)因變量矩陣貢獻(xiàn)率為55.00%，RDA2對(duì)因變量貢獻(xiàn)率為18.88%，其中銨態(tài)氮對(duì)分蘗期稻田土壤微生物群落影響極顯著 (P<0.01，表4)。由圖4-B可知，2個(gè)坐標(biāo)軸分別解釋了52.42%和23.70%的拔節(jié)—孕穗期稻田土壤微生物群落變化，其中氨氧化潛勢對(duì)拔節(jié)—孕穗期稻田土壤微生物群落的影響達(dá)到顯著水平(P<0.05，表4)。

A.分蘗期環(huán)境因子與稻田土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的RDA分析；B.拔節(jié)—孕穗期環(huán)境因子與稻田土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的RDA分析；C.Y兩優(yōu)900品種環(huán)境因子與稻田土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的RDA分析；D.早豐優(yōu)69品種環(huán)境因子與稻田土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的RDA分析。

2.6 不同生育時(shí)期稻田土壤細(xì)菌生態(tài)功能預(yù)測

利用 FAPROTAX對(duì)高通量測序所得的5 868個(gè)ASV進(jìn)行生態(tài)功能預(yù)測發(fā)現(xiàn)(圖5)，不同生育時(shí)期稻田土壤細(xì)菌生態(tài)功能在品種和氮肥處理間具有較大差異。與氮循環(huán)功能有關(guān)的一氧化二氮反硝化作用、亞硝酸鹽反硝化作用、硝酸鹽反硝化作用和反硝化作用等功能均表現(xiàn)出分蘗期7∶3處理下豐度較高，尤以Y兩優(yōu)900稻田土壤中相對(duì)豐度最高。說明施氮比例和品種的不同引起了土壤氮素反硝化作用的變化，分蘗期7∶3氮肥處理下土壤細(xì)菌的反硝化功能增強(qiáng)。

圖5 不同處理間稻田土壤細(xì)菌功能相對(duì)豐度差異熱圖Fig.5 Heat map of differences in relative abundances of soil bacterial functions in paddy soils among different treatments

3 結(jié)論與討論

綜上所述，施氮比例7∶3和6∶4處理下，水稻分蘗期土壤細(xì)菌數(shù)量增加可促進(jìn)有效穗數(shù)的形成，拔節(jié)—孕穗期土壤細(xì)菌數(shù)量的增加有利于水稻產(chǎn)量的形成。土壤細(xì)菌群落構(gòu)成及生態(tài)功能在分蘗期和拔節(jié)—孕穗期2個(gè)生育時(shí)期間存在明顯差異。拔節(jié)—孕穗期較高的土壤氨氧化潛勢，有利于水稻穗粒數(shù)的增加。分蘗期7∶3處理的土壤氨氧化潛勢高于6∶4處理，且土壤細(xì)菌的反硝化功能較強(qiáng)，產(chǎn)量較低的Y兩優(yōu)900土壤細(xì)菌的反硝化功能高于產(chǎn)量較高的早豐優(yōu)69。因此，稻田土壤細(xì)菌數(shù)量、細(xì)菌群落構(gòu)成與生態(tài)功能的差異可影響水稻有效穗數(shù)、每穗粒數(shù)和產(chǎn)量的形成。